工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際微生物多樣性對(duì)施肥制度的響應(yīng)

張變?nèi)A　靳東升　郜春花　郜雅靜　李建華

摘要：選取山西省古交屯蘭工礦復(fù)墾區(qū)為研究對(duì)象，設(shè)置4個(gè)施肥處理，即對(duì)照處理（CK）、無(wú)機(jī)肥處理（F）、有機(jī)肥處理（O）、有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理（OF），將傳統(tǒng)與現(xiàn)代微生物技術(shù)相結(jié)合，分析比較了工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際微生物多樣性對(duì)施肥制度的響應(yīng)。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法表明不同施肥處理下大豆苗期根際微生物細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量差異顯著（P<0.05），細(xì)菌、放線菌數(shù)量由大到小順序均為OF>O>F>CK，真菌數(shù)量由大到小順序?yàn)镺>F>OF>CK;Biolog-ECO分析發(fā)現(xiàn)香農(nóng)-維納指數(shù)由大到小順序?yàn)镺F>O>F>CK，均一度指數(shù)順序?yàn)镺>OF>F>CK，OF處理下大豆根際微生物多樣性指數(shù)與CK處理差異顯著，香農(nóng)維納指數(shù)由大到小順序?yàn)镺F>O>CK>F，OF處理下大豆根際微生物活性高，代謝功能強(qiáng);16S rDNA分析表明，OF處理下大豆根際微生變形菌門（Proteobacteria）豐度最高，且與O處理大豆根際微生物具有相似親緣性屬，而CK處理下大豆根際微生物綠彎菌門（Chloroflexi）與酸桿菌門（Acidobacteria）豐度最高，與F處理下大豆根際微生物具有相似親緣性屬。總體來(lái)看，大豆根際微生物多樣性對(duì)施肥的響應(yīng)變化明顯，OF處理與CK對(duì)照處理差異顯著。

關(guān)鍵詞：工礦復(fù)墾區(qū);根際微生物多樣性;大豆;施肥

中圖分類號(hào)： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0248-04

土壤微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)等多種生化過程，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)[1]。而工礦復(fù)墾區(qū)內(nèi)土壤有機(jī)質(zhì)含量低，團(tuán)聚體少，微生物活性差，提高礦區(qū)復(fù)墾土壤質(zhì)量可以緩解我國(guó)人均耕地少、質(zhì)量差的現(xiàn)狀，保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。根際是連接植物、土壤和微生物的紐帶，根際微生物繁殖速度較快、數(shù)量龐大、代謝旺盛，在土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化、提供植物養(yǎng)料、維持土壤肥力等方面都具有重要作用[2-4]。當(dāng)前已有許多研究表明，豆科植物是改良土壤質(zhì)量的先鋒物種，對(duì)于生態(tài)重建有重要意義[5-7];在植物根際土壤理化性質(zhì)、微生物多樣性、土壤酶活性等方面[8-10]已有許多研究，但是在工礦復(fù)墾區(qū)開展植物根際微生物評(píng)價(jià)研究較少[11-16]，對(duì)于山西工礦復(fù)墾區(qū)豆科植物根際生物學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究更少。山西作為煤炭大省，復(fù)墾面積廣;因此，本試驗(yàn)將山西省古交屯蘭礦區(qū)復(fù)墾地作為試驗(yàn)區(qū)，利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法、Biolog-ECO和16S rDNA相結(jié)合的方法，從微生物種類、數(shù)量、代謝功能等多樣性的視角分析評(píng)價(jià)工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際微生物對(duì)施肥制度的響應(yīng)特征，研究豆科植物種植下根際土壤微生物多樣性特點(diǎn)，旨在為今后礦區(qū)復(fù)墾與生態(tài)重建技術(shù)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于山西省古交屯蘭工礦復(fù)墾區(qū)，該區(qū)于2014年復(fù)墾為農(nóng)田，目前仍處于復(fù)墾初期，年均氣溫約9.5 ℃，年均降水量約460 mm，2017年種植豆科植物大豆。本試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)施肥處理：對(duì)照處理（CK）、無(wú)機(jī)肥處理（F）、有機(jī)肥處理（O）、有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理（OF）。CK處理施肥量為0，其他處理按照等氮量施肥150 kg/hm2，無(wú)機(jī)肥為復(fù)合肥，其中氮、五氧化二磷、氧化鉀質(zhì)量比（N ∶P2O5 ∶K2O）為=18 ∶12 ∶10，有機(jī)肥施用平遙國(guó)青（由平遙縣國(guó)青同盈禽業(yè)有限公司生產(chǎn)，有機(jī)質(zhì)含量53.48%，含氮2.2%），OF處理施肥量為1/2有機(jī)肥加1/2無(wú)機(jī)肥。

1.2根際土壤取樣

于2017年6月9日在大豆生長(zhǎng)季苗期，劃定小區(qū)2 m×2 m，采用抖落法[17]在不同施肥處理下選擇大小相似的大豆8～10株，每個(gè)處理3次重復(fù)。用毛刷輕輕地刷下0～5 mm 的根際土，將其收集在無(wú)菌塑料袋中，然后放入裝有冰袋的保溫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)分析化驗(yàn)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)根際土壤細(xì)菌、放線菌、真菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏改良培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2Biolog-ECO稱取10 g根際土壤，放入滅菌的裝有90 mL濃度為0.85% NaCl的帶玻璃珠的三角瓶中，然后以250 r/min在搖床上充分震蕩30 min，10倍稀釋2次后，吸取稀釋后的150 μL土壤溶液加入到Biolog-ECO的96個(gè)孔中，然后放入培養(yǎng)箱28 ℃恒溫培養(yǎng)，利用Biolog分析儀每隔24 h讀取各孔的吸光度，連續(xù)測(cè)7 d。

1.3.316S rDNA高通量測(cè)序由上海派森諾生物公司對(duì)植物根際進(jìn)行微生物組DNA提取，包括目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收純化、熒光定量等，使用MiSeq測(cè)序儀測(cè)定大豆根際微生物V3-V4區(qū)的操作分類單元（operational taxonomic units，簡(jiǎn)稱OTU）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel、SPSS、R軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差與聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際微生物數(shù)量對(duì)施肥制度的響應(yīng)特征

從圖1可以看出，不同施肥處理下，工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際細(xì)菌數(shù)量差異顯著，從大到小順序?yàn)镺F>O>F>CK;其中，OF處理下大豆根際細(xì)菌數(shù)量最多，顯著高于其他處理;說明施肥利于工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際微生物細(xì)菌數(shù)量的增加，且配施有機(jī)無(wú)機(jī)的處理對(duì)增加根際細(xì)菌數(shù)量的效果最好。

從圖2可以看出，不同施肥處理下大豆根際放線菌數(shù)量差異顯著，從大到小順序?yàn)镺F>O>F>CK;其中，OF處理下大豆根際放線菌數(shù)量最多，顯著高于其他處理;說明施肥利于工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際微生物放線菌數(shù)量的增加，且OF處理下放線菌數(shù)量最多。

從圖3可以看出，不同施肥處理下大豆根際真菌數(shù)量差異顯著，由大到小順序?yàn)镺>F>OF>CK;其中，O處理下大豆根際真菌數(shù)量最多，顯著高于其他處理，說明施肥可以增加工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際微生物真菌數(shù)量，且與CK相比，單施有機(jī)肥處理的真菌增量最大，而OF處理下增量最小。

2.2不同施肥處理下工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際土壤平均顏色變化率動(dòng)態(tài)變化

從圖4可以看出，大豆苗期根際土壤平均顏色變化率（average well color development，簡(jiǎn)稱AWCD）吸光度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，96 h后增長(zhǎng)緩慢變化。在0～24 h內(nèi)，大豆根際土壤AWCD吸光度基本上無(wú)明顯變化;在24～48 h內(nèi)，大豆根際土壤吸光度迅速增加，其中，F(xiàn)處理下大豆根際土壤AWCD值最大;隨后在48～168 h時(shí)，大豆根際土壤AWCD吸光度的大小順序均為OF>F>O>CK;說明大豆根際土壤微生物活性影響對(duì)施肥的響應(yīng)較強(qiáng)，施肥可以增加苗期大豆根際土壤碳的吸收率，且有機(jī)無(wú)機(jī)配施下大豆根際微生物活性最大，利用碳源的能力最強(qiáng)。

2.3工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際微生物多樣性指數(shù)對(duì)施肥制度的響應(yīng)特征

土壤微生物群落功能多樣性表征土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落對(duì)土壤中碳源類型利用多少的能力，本試驗(yàn)采用的微生物多樣性指數(shù)為土壤微生物群落的香農(nóng)-維納指數(shù)（H'）和Mclntosh均一度指數(shù)（U）[18]，計(jì)算公式見表1。

本試驗(yàn)利用96 h的AWCD數(shù)據(jù)來(lái)分析計(jì)算工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際微生物多樣性指數(shù)，由表2可知，施肥對(duì)工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際土壤微生物群落香農(nóng)-維納指數(shù)、均一度指數(shù)有影響，CK處理下大豆根際微生物香農(nóng)-維納指數(shù)和均一度指數(shù)最低，但是CK和F處理間差異均不顯著，而CK與OF處理差異均顯著（P<0.05），且OF處理下大豆根際微生物香農(nóng)-維納指數(shù)最高。說明施肥處理有利于苗期大豆根際微生物香農(nóng)-維納指數(shù)和均一度指數(shù)增加，使微生物活性提高，微生物代謝功能增強(qiáng)?？傮w來(lái)看，OF處理對(duì)于提高大豆苗期根際土壤碳源利用的效果較好。

2.4工礦復(fù)墾區(qū)大豆根際土壤微生物類別對(duì)施肥制度的響應(yīng)特征

從圖5可以看出，不同施肥處理下工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際微生物豐度值大于5%的門有放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria），OF處理下放線菌門、藍(lán)菌門的豐度最低，變形菌門豐度最高，CK處理下綠彎菌門與酸桿菌門的豐度最高。

從圖6可以看出，工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際微生物屬對(duì)施肥制度的響應(yīng)明顯。根據(jù)大豆根際微生物屬的相對(duì)豐度可以將其分為2類，CK與F具有相似親緣性，主要表現(xiàn)在豐度值較高的諾卡氏屬（Nocardoides）與土壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）;O與OF具有相似親緣性，主要表現(xiàn)在豐度值較高的中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、糖霉菌屬（Glycomyces）、Ohtaekwangia和壤霉菌屬（Agromyces）。

3結(jié)論與討論

大豆根際土壤微生物數(shù)量對(duì)施肥制度響應(yīng)明顯。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理下工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量均存在顯著性差異;其中，施肥處理的大豆根際微生物數(shù)量均顯著高于CK處理，且有機(jī)無(wú)機(jī)配施（OF）處理下大豆根際細(xì)菌、放線菌數(shù)量與CK處理相比數(shù)量差異最大。這與蘆思佳等的研究結(jié)果[19-21]一致。

施肥可以增加土壤有機(jī)質(zhì)的含量，為微生物提供碳源與能量，進(jìn)而提高土壤微生物活性，促進(jìn)土壤微生物功能代謝[20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際土壤微生物AWCD隨時(shí)間的推移呈動(dòng)態(tài)增加，有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理下AWCD和微生物多樣性香農(nóng)-維納指數(shù)最高，而CK處理下大豆根際微生物的AWCD與香農(nóng)-維納指數(shù)最低，說明大豆根際微生物對(duì)有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理響應(yīng)強(qiáng)烈，原因可能是有機(jī)無(wú)機(jī)配施可以為根際微生物提供充足的碳源，提高微生物新陳代謝功能，因此對(duì)于改善山西工礦復(fù)墾區(qū)土壤微生物活性差、有機(jī)質(zhì)含量低的特征效果最佳。

工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際微生物優(yōu)勢(shì)屬在施肥處理間存在差異，且有機(jī)肥、有機(jī)無(wú)機(jī)配施下土壤微生物屬具有相似親緣性，而無(wú)機(jī)肥、對(duì)照處理下微生物屬具有相似親緣性。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感性指標(biāo)，可以表征土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康狀況[22-23]。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)適用于測(cè)定具有特殊生理功能的微生物，但當(dāng)微生物種類較多時(shí)，無(wú)法培養(yǎng)，難以測(cè)定[24]。Biolog法可獲取微生物群落總體活性與代謝功能信息[25]，16S rDNA通過提取微生物組總DNA可鑒定微生物菌群結(jié)構(gòu)[26]。本試驗(yàn)利用傳統(tǒng)與現(xiàn)代微生物研究方法的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)對(duì)工礦復(fù)墾區(qū)苗期大豆根際土壤微生物多樣性進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果得出，有機(jī)無(wú)機(jī)配施下大豆對(duì)改善土壤微生物活性效果最佳，并發(fā)現(xiàn)了其中豐度較高的優(yōu)勢(shì)屬，但是大豆根系分泌物可能會(huì)因氣溫、降水等環(huán)境改變而變化，不同施肥處理下大豆根際微生物的優(yōu)勢(shì)屬在快速生長(zhǎng)期與衰退期可能會(huì)發(fā)生差異，因此有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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