一株拮抗禾谷鐮刀菌和降解嘔吐毒素解淀粉芽孢桿菌的篩選及在飼料貯存中的應用

曹坤　管明　陳康　胡彤　林赟　羅楚平

摘要：禾谷鐮刀菌是引起農作物赤霉病的主要病原菌之一，其次生代謝產物嘔吐毒素對人和動物有極大的安全危害，嘔吐毒素一旦污染飼料不僅會造成巨額的經濟損失，更有可能進入食物鏈威脅到人與動物的健康安全。目前我國鮮有高效的脫毒方法來應對嘔吐毒素對于飼料的安全威脅。為解決上述問題，從江蘇省淮安市土壤中篩選出1株同時具有禾谷鐮刀菌抗性與嘔吐毒素降解能力的解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌本身就是優(yōu)異的飼料益生菌種，用高效液相色譜和質譜聯(lián)用的方法分析該菌株后發(fā)現(xiàn)其含有桿菌霉素L和泛革素2種脂肽類抗生素，對禾谷鐮刀菌的抑菌率達60%;經液相色譜檢測后表明該菌在14 d后嘔吐毒素轉化率達到92.440%。數(shù)據(jù)表明該菌在飼料防霉與脫毒方面表現(xiàn)出良好的應用前景。

關鍵詞：禾谷鐮刀菌;嘔吐毒素;解淀粉芽孢桿菌;生物防治;赤霉病

中圖分類號：S816.79;S182 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0179-05

禾谷鐮刀菌是谷物農作物中常見的病原真菌，是主要的飼料污染源之一。在人工培養(yǎng)下主要進行無性繁殖，在作物中寄生時進行有性繁殖，其分生孢子及菌絲體具有典型的鐮刀菌特征。當農作物生長遇到持續(xù)的陰雨天氣時，禾谷鐮刀菌表現(xiàn)出比其他寄生型真菌更強的生長優(yōu)勢，在小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物農作物中生長、繁殖，導致赤霉病，同時產生毒素，而嘔吐毒素就是其產生的主要真菌毒素[1-3]。遇到陰雨天氣谷物飼料受潮之后，不僅會造成谷物飼料的霉化，同時也會造成真菌毒素的積累殘留。當動物誤食了受禾谷鐮刀菌污染的飼料后便有可能威脅到動物的生理安全，進入食物鏈之后可對動物消化道黏膜產生強烈的刺激反射而作用于嘔吐中樞，進而引起動物食欲減退、體質量減輕、代謝紊亂等癥狀而影響其生產性能[4-5]，不僅會造成畜牧業(yè)的經濟損失也有食品安全風險。由于目前市面上鮮有能夠同時拮抗禾谷鐮刀菌與降解嘔吐毒素的方法，尋找一種安全高效的飼料防霉脫毒方法是業(yè)界的迫切需求。

嘔吐毒素（DON），別稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，化學名稱為3，7，15-三羥基-12，13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產生，20世紀70年代初日本Morooka等首次分離出這種真菌毒素，闡明其結構，并將其命名為4-deoxynivalenol（DON）[6-7]。因嘔吐毒素容易引起豬嘔吐，因此稱為嘔吐毒素，DON可以影響免疫細胞增殖、凋亡和免疫細胞因子的生成以至于降低機體的免疫力;同時DON具有細胞毒性，能夠抑制粒狀單核細胞增殖，抑制mRNA翻譯和細胞外調節(jié)蛋白激酶活性，從而加速細胞死亡[8-9]。目前國內外針對嘔吐毒素的降解方法主要有物理處理法、化學處理法及生物轉化法。但由于嘔吐毒素穩(wěn)定的結構性質，如在210 ℃持續(xù)加熱30～40 min條件下其結構才會被明顯破壞等[10]，傳統(tǒng)的物理處理法脫毒效率低，而化學法雖然能達到良好的脫毒效果，但是容易混入其他有毒的化學試劑并且破壞飼料的營養(yǎng)成分。由于生物轉化法能在溫和的條件下降低或去除嘔吐毒素，并且對飼料的感官性狀和適口性影響較小，因此生物轉化法脫毒便成為人們飼料脫毒的首選方案。本研究篩選出1株解淀粉芽孢桿菌，能夠拮抗禾谷鐮刀菌與降解嘔吐毒素。解淀粉芽孢桿菌在代謝過程中能夠產生次生代謝物——抗菌蛋白、脂肽類抗生素等多種抗菌物質[11-12]，同時能夠分泌多種消化酶或多肽等活性物質，可提高動物對營養(yǎng)物質的消化吸收，維持畜禽腸道菌群平衡，抑制有害病原菌的生長，增強抵抗疾病的能力，被廣泛應用于畜牧、水產行業(yè)中[13]。毫無疑問解淀粉芽孢桿菌是最適合應用于飼料防霉脫毒的微生物之一。

解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，是一種具有廣譜抑菌活性的革蘭氏陽性菌，解淀粉芽孢桿菌最初是由Priest等發(fā)現(xiàn)鑒定的，模式菌株為ATCC23350[14]。1980年之前少有研究解淀粉芽孢桿菌的報道。近年來，隨著解淀粉芽孢桿菌抑菌能力及產酶特性的發(fā)現(xiàn)[15]，人們相繼從自然界中篩選出各類功能特異的解淀粉芽孢桿菌，并研究其應用價值。Sutyak等從一些乳制品中篩選分離出對李斯特氏菌具有抑菌作用的解淀粉芽孢桿菌[16];計堅研究表明，解淀粉芽孢桿菌可有效緩解大腸桿菌引起的仔豬炎癥反應，可一定程度緩解斷奶仔豬的腹瀉[17];沈勇濤研究報道，母豬飼料中添加解淀粉芽孢桿菌制劑可以改善母豬腸道微生態(tài)體系，幫助新生仔豬盡早建立腸道微生態(tài)體系，從而顯著提高仔豬生長性能[18];解淀粉芽孢桿菌M001（108 CFU/g）作為飼料添加劑可顯著提高大比目魚胰脂肪酶、胰蛋白酶、腸蛋白酶及胃蛋白酶活性[19];解淀粉芽孢桿菌Q-12作為對植物病原菌尖孢鐮刀菌具有強烈抗菌活性的生物防治菌被應用于植物病害防治上，同時其在畜牧及水產行業(yè)中也得以廣泛應用[20]。

本研究從江蘇省淮安市小麥田中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌。該菌在對禾谷鐮刀菌具有明顯拮抗作用的同時對禾谷鐮刀菌產生的真菌毒素——嘔吐毒素具有高效的降解效果。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種解淀粉芽孢桿菌CPLK1314是在本研究中篩選分離得到。用于測定抑菌譜的禾谷鐮刀菌由淮陰工學院生命科學與食品工程學院菌種庫提供。

1.1.2培養(yǎng)基分離篩選用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA），其組成為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水補足至1 000 mL，pH值自然。Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，其組成為胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水補足至1 000 mL，pH 值7.0。水瓊脂平板：瓊脂20 g、蒸餾水補足至1 000 mL，pH值自然。麥麩培養(yǎng)基：麥麩10 g、蒸餾水補足至10 mL，pH值自然。

1.2菌種的分離純化

1.2.1菌種的初篩

從江蘇省淮安市小麥田收集了200份土壤樣品，分別過40目篩后稱取0.5 g樣品，將樣品加入 4.5 mL 的生理鹽水中，振蕩2 min。將20 mL PDA培養(yǎng)基均勻地注入 9 cm 平皿中，待培養(yǎng)基凝固后，在其中間放置1片圓形濾紙片，然后把20 μL上述土壤樣品懸浮液滴入圓形濾紙片中。接著在距平皿中心2.5 cm處對稱地接上禾谷鐮刀菌，將平板置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)3～7 d并觀察抑菌圈的形成。挑出有明顯抑菌圈的平板，將生長在圓形濾紙片周圍的菌落用劃線法接種到LB培養(yǎng)基瓊脂平板上，通過反復平板劃線接種獲得單菌落。將單菌落劃線接種至LB斜面，分類保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌種的復篩

將上述保存在斜面中的初篩菌株，接種到液體LB培養(yǎng)基中28 ℃活化48 h，取出后28 ℃、8 000 r/min 離心10 min得上清液，取1 mL上清液加入 5 μg/mL 濃度的嘔吐毒素1 mL，28 ℃放置48 h后用高效液相色譜法檢測嘔吐毒素的峰面積變化[檢測條件為色譜柱：Agilent zorbax sb-Aq C18（規(guī)格：4.6 mm×250 mm，粒徑：5 μm）;柱溫為29 ℃;進樣量為20 μL;流動相為V乙腈 ∶V水= 15 ∶85;流速為0.8 mL/min;檢測波長為218 nm）。挑選出峰面積減小的菌株組別。

1.3菌株的生物學鑒定

1.3.1生理生化測定菌株形態(tài)以及生理生化特性測定參照參考文獻[21]的方法。

1.3.2解淀粉芽孢桿菌的16S rDNA PCR擴增和序列測定

利用16S rDNA通用引物，以菌株CPLK1314的DNA為模板進行PCR擴增，測序得到長度為1 472 bp的16S rDNA基因片段，在NCBI（美國國立生物技術信息中心網站）上經Blast同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株CPLK1314基因序列與芽孢桿菌相似度達99%，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4菌株對禾谷鐮刀菌拮抗能力的測定

1.4.1菌株發(fā)酵產物的測定

將菌株CPLK1314接種在 1 000 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后離心除去菌體，上清液用濃鹽酸（質量分數(shù)為37%）調至pH值2.0沉淀過夜，28 ℃、8 000 r/min 離心25 min得到沉淀，沉淀用1/10體積甲醇分2次抽提，每次抽提2 h，合并甲醇抽提物。甲醇抽提物減壓濃縮后過0.22 μm微孔濾膜即可進行質譜檢測。質譜分析儀器為Agilent 6410三重串聯(lián)四級桿質譜儀，購自美國安捷倫科技股份有限公司。采用（色譜純）飽和α-氰基-4-羥基桂皮酸、0.1%三氟乙酸、乙腈和水（體積比3 ∶1）溶液稀釋樣品1 000倍后，通過注射器直接進樣粗制備脂肽類抗生素。采用質譜法測定粗提脂肽類化合物的分子質量，電噴霧條件為毛細管電壓32 V、噴霧電壓20 kV、毛細管溫度320 ℃。檢測方式為正離子檢測。

1.4.2解淀粉芽孢桿菌CPLK1314對禾谷鐮刀菌生長和菌絲與孢子的影響

將解淀粉芽孢桿菌CPLK1314接種于LB液體培養(yǎng)基（g/L）培養(yǎng)72 h后得發(fā)酵液，采用平板對峙試驗測定解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的拮抗作用。具體為將禾谷鐮刀菌菌塊（直徑5 mm）接種在LB平板（直徑9 cm）中央，在距離菌塊2.5 cm處放置牛津杯并滴加 100 μL 發(fā)酵液，于28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長至合適位置，觀察發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的抑制活性，測定抑菌帶寬。在菌塊另一側以未接種芽孢桿菌的培養(yǎng)基上清液作為空白對照組，每組處理33個重復。抑菌率=（空白對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/空白對照組菌落直徑×100%。于光學顯微鏡下觀察解淀粉芽孢桿菌CPLK1314對禾谷鐮刀菌菌絲生長的影響。另外取禾谷鐮刀菌菌種接于PDA平板上28 ℃活化 14 d，然后用無菌水將菌種配成1×103 CFU/mL 的孢子懸浮液（血球計數(shù)板計數(shù)），隨配隨用。取200 μL孢子懸浮液涂布在水瓊脂平板上，定時于顯微鏡下觀察記錄禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)形態(tài)。取解淀粉芽孢桿菌CPLK1314劃線培養(yǎng)于LB平板培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)24 h后轉接于LB培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h成種子液。以1 ∶100的比率在LB培養(yǎng)液中擴繁。28 ℃、200 r/min、擴繁72 h后所得菌液在4 ℃、5 000 r/min 離心10 min，取上清。將1 mL上清液與1 mL孢子懸浮液充分混合后取200 μL涂布于水瓊脂平板鏡檢觀察禾谷鐮刀菌孢子形態(tài)。

1.4.3解淀粉芽孢桿菌CPLK1314在飼料中對禾谷鐮刀菌的防治能力

取禾谷鐮刀菌接于PDA平板上，28 ℃活化 14 d，然后用無菌水將菌種配成1×106 CFU/mL的孢子懸浮液（血球計數(shù)板計數(shù)），隨配隨用。將解淀粉芽孢桿菌CPLK1314劃線培養(yǎng)于 LB平板培養(yǎng)基上。在28 ℃下培養(yǎng) 24 h 后轉接于LB培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h成種子液。以1 ∶100的體積比率在LB培養(yǎng)液中擴繁。28 ℃、200 r/min擴繁72 h后所得菌液在4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，離心所得菌體用LB培養(yǎng)液重懸浮并調至所需濃度即得解淀粉芽孢桿菌懸液。取200 μL禾谷鐮刀菌孢子液與200 μL解淀粉芽孢桿菌懸液混合于2 mL EP管中，漩渦振蕩1 min混勻后用移液槍加入麥麩培養(yǎng)基中，觀察孢子萌發(fā)與菌絲生長狀況。

1.5解淀粉芽孢桿菌CPLK1314對嘔吐毒素的降解能力

1.5.1嘔吐毒素標準曲線的制作

將嘔吐毒素（北京貝納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院）用色譜純甲醇配制成濃度為5、10、25、50、100 μg/mL濃度標準品后用高效液相色譜法檢測嘔吐毒素在不同濃度下的峰面積[檢測條件為色譜柱：Agilent zorbax sb-Aq C18（規(guī)格：4.6 mm×250 mm，粒徑：5 μm）;柱溫為 29 ℃;進樣量為20 μL;流動相為V乙腈 ∶V水=15 ∶85;流速為0.8 mL/min;檢測波長為218 nm]。

1.5.2解淀粉芽孢桿菌CPLK1314對嘔吐毒素的降解轉化能力

將解淀粉芽孢桿菌CPLK1314接種于LB液體培養(yǎng)基中30 ℃活化培養(yǎng)48 h，取100 mL發(fā)酵上清液，放入冰水浴中預冷10 min，將硫酸銨研磨成粉末在攪拌、冰浴條件下緩慢加入，分別加至終濃度為75%（質量分數(shù)）。加完后繼續(xù)攪拌15～20 min。4 ℃冰箱靜置過夜，12 500 r/min低溫離心 15 min，得到的沉淀用10 mL NaH2PO4緩沖液（pH值6.60）溶解即為胞外酶粗提液。取1 mL胞外酶粗提液加入DON配制成濃度為25 μg DON/mL的試驗組。分別用不加胞外酶粗提液只加DON和不加胞外酶粗提液不添加DON的NaH2PO4緩沖液（pH值6.60）作陽性對照和陰性對照，32 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3、7、14 d，然后用高效液相色譜法根據(jù)峰面積檢測計算培養(yǎng)基中剩余DON含量[檢測條件為色譜柱：Agilent zorbax sb-Aq C18（規(guī)格：4.6 mm×250 mm，粒徑：5 μm）;柱溫為29 ℃;進樣量為20 μL;流動相為V乙腈 ∶V水= 15 ∶85;流速為0.8 mL/min;檢測波長為218 nm]。

2結果與分析

2.1菌種的分離與篩選

從淮安市土壤樣品中篩選出10株對禾谷鐮刀菌有較明顯抑菌圈的菌株，其中菌株CPLK1314對禾谷鐮刀菌有明顯的拮抗作用且對嘔吐毒素具有高效的降解效率。

2.2菌株COLK1314的生物學鑒定

對篩選的菌株CPLK1314進行形態(tài)學鑒定和生理生化鑒定：菌株CPLK1314菌體細胞在400倍光學顯微鏡下呈短桿狀，具有運動性;在LB培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形，邊緣整齊，中間形成褶皺，淡黃色，不透明（表1）。

構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，菌株CPLK1314與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）親緣關系最近。結合生理生化試驗結果（表1）初步鑒定菌株CPLK1314為解淀粉芽孢桿菌。

2.3菌株拮抗禾谷鐮刀菌效果

2.3.1菌株CPLK1314的發(fā)酵產物

圖2采用高效液相色譜和質譜聯(lián)用的方法分析檢測到解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)液中含有2種脂肽類抗生素，經對比為桿菌霉素L與泛革素。

2.3.2菌株CPLK1314對禾谷鐮刀菌的抑菌率及對其孢子、菌絲的影響

菌株CPLK1314對禾谷鐮刀菌的抑菌率如表2所示，經3組平行測試后發(fā)現(xiàn)該菌對禾谷鐮刀菌的平均抑菌率達60%。圖3為菌株CPLK1314對禾谷鐮刀菌孢子與菌絲的影響，經對比發(fā)現(xiàn)，菌株CPLK1314處理后的真菌孢子相較于正常孢子，兩端膨大，產生分歧，形狀不規(guī)則;菌絲則相較于正常菌絲表現(xiàn)為菌絲雜亂，菌絲部分膨大，部分菌絲甚至出現(xiàn)消融現(xiàn)象。表明菌株CPLK1314對禾谷鐮刀菌孢子具有明顯的致畸作用且對禾谷鐮刀菌菌絲具有明顯的抑制效果。

2.3.3菌株在飼料儲存中的抗菌效果

如表3、圖4所示，經3組平行試驗證明，在添加相同濃度禾谷鐮刀菌孢子的條件下，極短時間內只添加無菌水的對照組孢子迅速萌發(fā)并侵染整個三角瓶底部，而加入不同濃度梯度的菌株CPLK1314的發(fā)酵液試驗組均表現(xiàn)出對外來孢子的萌發(fā)抑制能力，并且對后續(xù)的禾谷鐮刀菌菌絲生長具有不同程度的拮抗效果，菌株CPLK1314濃度越高其效果越明顯。而在試驗設置最高濃度組106 CFU/g濃度下，至三角瓶中水分自然消失至干竭狀態(tài)時，瓶中菌絲依舊未完全鋪滿，甚至部分干癟消失，表現(xiàn)出優(yōu)異的禾谷鐮刀菌拮抗能力。該試驗的實踐意義在于，在傳統(tǒng)飼料儲藏中加入以解淀粉芽孢桿菌CPLK1314為主要成分的防腐劑，預期可有效抑制禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)與菌絲生長。

2.4菌株的嘔吐毒素降解能力

2.4.1嘔吐毒素標準曲線

如表4、圖5所示，將各個濃度嘔吐毒素標準品的液相色譜圖重疊，以嘔吐毒素標準品的濃度為橫坐標，以高效液相色譜的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=13.950x+30.566，r2=0.998 6。

2.4.2菌株對嘔吐毒素降解能力的檢測

解淀粉芽孢桿菌CPLK1314對嘔吐毒素處理14 d，分別在3、7、14 d時通過高效液相色譜檢測得峰面積，再根據(jù)嘔吐毒素的標準曲線計算出剩余嘔吐毒素濃度，進而得出菌株CPLK1314胞外酶粗提液對嘔吐毒素的降解轉化效果。由表4可知，菌株胞外酶對嘔吐毒素的降解轉化效率高達92.440%，具有高效良好的嘔吐毒素降解能力。

3討論與結論

禾谷鐮刀菌及其次生代謝產物嘔吐毒素廣泛存在于自然界中，容易對谷物和飼料造成嚴重的污染，并因此導致巨額的經濟損失，人和動物一旦攝入被嘔吐毒素污染的糧食或飼料也有可能引起毒素的中毒，因此對于嘔吐毒素的防治與研究具有深遠且重要的意義。目前關于嘔吐毒素的脫毒方法大致分類為物理法、化學法和生物降解法，其中生物降解法以其溫和的反應條件和高效的脫毒效率被認為是嘔吐毒素脫毒的最佳方案。世界各地的學者都在孜孜不倦地尋求高效、合理、安全、經濟的嘔吐毒素防治與降解手段。

本研究從淮安市霉化污染嚴重的小麥田中篩選出1株既可以拮抗禾谷鐮刀菌又對嘔吐毒素具有一定脫毒能力的菌株。經初步鑒定后判斷為解淀粉芽孢桿菌，經高效液相色譜和質譜聯(lián)用的方法檢測出該解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)液中含有桿菌霉素L和泛革素2種脂肽類抗生素，對禾谷鐮刀菌的抑菌率達到60%，對禾谷鐮刀菌孢子具有一定的致畸性，對禾谷鐮刀菌的菌絲也有較強的抑制干擾作用，在生物防治試驗中，濃度達到106 CFU/g的試驗組表現(xiàn)出對禾谷鐮刀菌優(yōu)異的生防功效。與此同時，經硫酸銨沉淀后獲得的胞外酶粗提液14 d后對嘔吐毒素的轉化率達到了92.440%。

解淀粉芽孢桿菌在作為優(yōu)秀的植物病害生防菌的同時也經常被用于作為飼料益生菌群。本研究的解淀粉芽孢桿菌表現(xiàn)出優(yōu)異的飼料儲存防霉應用潛力。其同時具有的禾谷鐮刀菌抗性和降解嘔吐毒素能力的特性可以一定程度地保證飼料不會被禾谷鐮刀菌侵染，并可以消除飼料預先殘留的嘔吐毒素，又或者可以將其加工制成高效的嘔吐毒素脫毒劑應用于飼料食品的加工產業(yè)。但是試驗表明，只有在達到一定的濃度條件下，該解淀粉芽孢桿菌才能表現(xiàn)出最佳的防霉特性，其在大規(guī)模應用的經濟性方面還有待商榷。同時，該菌的胞外酶特性尚未被完全解析，其轉化嘔吐毒素的具體機制與細節(jié)具有廣闊的研究潛力與意義。本研究篩選出的解淀粉芽孢桿菌CPLK1314為今后的工作打下了基礎，今后將對嘔吐毒素的具體降解機制進行深入研究，以便更高效、合理、安全、經濟地應用于飼料的貯存與脫毒。

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