植物質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

陳亞琳　謝成建　楊星勇

摘要：植物質(zhì)膜（plasma membrane，簡稱PM）是連接細(xì)胞內(nèi)外的活性屏障，而PM蛋白作為PM的重要組成成分之一，對植物細(xì)胞膜功能有著重要的作用。植物PM蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有利于對PM的功能進(jìn)行更加深入的探索。本文主要對近幾年來在植物PM蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究進(jìn)行綜合性論述，包括其研究方法、功能及其面臨的問題等，以期為植物PM蛋白質(zhì)組學(xué)的后續(xù)研究以及PM功能的深入探討提供參考。

關(guān)鍵詞：PM蛋白;蛋白質(zhì)組;PM蛋白功能;微結(jié)構(gòu)域

中圖分類號： Q942.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0007-05

蛋白質(zhì)組學(xué)以直接參與生命活動的所有蛋白質(zhì)作為研究目標(biāo)，其主要研究技術(shù)包括雙向電泳技術(shù)（two-dimensional electrophoresis，簡稱2-DE）、質(zhì)譜鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)、核磁共振、噬菌體展示技術(shù)、蛋白芯片、酵母雙雜交系統(tǒng)等。植物質(zhì)膜（plasma membrane，簡稱PM）蛋白作為植物蛋白質(zhì)的一個重要部分，蛋白組學(xué)技術(shù)為植物PM蛋白研究提供了重要的技術(shù)支撐。目前，通過PM蛋白的微結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)組學(xué)分析來研究PM蛋白的功能已成為常用的研究手段之一，也包括用拉曼射線對膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析[1]以及研究大豆（Glycine max）中的[WTBX][STBX]GmFWL1基因編碼的膜微結(jié)構(gòu)域的相關(guān)蛋白質(zhì)等[2]。

為了系統(tǒng)性地了解植物PM蛋白的研究進(jìn)展，本研究針對植物PM蛋白組學(xué)相關(guān)的問題與挑戰(zhàn)開展討論，歸納整理近幾年在植物PM蛋白質(zhì)組學(xué)方面取得的研究進(jìn)展。

1植物質(zhì)膜功能

植物PM作為植物細(xì)胞的活性屏障，是植物細(xì)胞與外部環(huán)境之間溝通的橋梁，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等等[3]。植物中多種代謝活動的協(xié)調(diào)依賴于通過膜接觸點（membrane contact sites，簡稱MCS）建立的組織間通訊網(wǎng)絡(luò)[4]，植物特有的MCS在植物組織發(fā)育、胞間運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的重要作用尚有待深入研究。如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，簡稱ER）與PM的接觸位點（endoplasmic reticulum-plasma membrane contact sites，簡稱EPCs）連接的蛋白質(zhì)復(fù)合物及其結(jié)構(gòu)有待闡釋[5]。此外，有一種蛋白質(zhì)亞復(fù)合物ESCRT-Ⅲ能夠介導(dǎo)PM的破碎和修復(fù)過程[6];溶酶體與PM融合也能夠幫助機(jī)械損傷的PM重新修復(fù)[7]，這些有賴于植物膜蛋白研究的新發(fā)現(xiàn)對于植物PM功能研究具有重要作用。

作為植物PM重要組成成分的植物PM蛋白通過嵌入脂雙層與脂質(zhì)一起構(gòu)成植物PM的分子結(jié)構(gòu)，并在植物物質(zhì)運(yùn)輸、離子交換、代謝等過程中起著重要作用。如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有一種[WTBX][STBX]VPS36介導(dǎo)的細(xì)胞PM蛋白質(zhì)能夠?qū)ζ湎虻匦援a(chǎn)生作用[8]，另有一種PM局部轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NIP1介導(dǎo)擬南芥中鋁吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)，以及鋁耐受性[9];此外，復(fù)合物AP2M參與定位PM的病害抗性蛋白介導(dǎo)的效應(yīng)物觸發(fā)的免疫（effector-triggered immunity，簡稱ETI），是通過PM上的免疫受體復(fù)合物介導(dǎo)的內(nèi)吞作用完成的[10]。近年，研究者利用不同的方法力求將PM蛋白的成分、結(jié)構(gòu)和功能了解清楚，包括通過對PM蛋白質(zhì)譜的分析探究其表達(dá)特征和功能，以及植物某種PM蛋白對整個PM蛋白組成和植物生理生化功能產(chǎn)生的影響[11]，其中，如何使質(zhì)譜檢測結(jié)果達(dá)到最優(yōu)化，也是PM蛋白研究的一個重點。

關(guān)于PM的結(jié)構(gòu)，在流動鑲嵌模型[12]的基礎(chǔ)上有了更深入的闡釋，即蛋白質(zhì)能夠瞬時被捕獲在脂筏和肌動蛋白-細(xì)胞骨架相關(guān)結(jié)構(gòu)中的區(qū)域化分層中[13]。而PM蛋白可根據(jù)其在PM中的分布位置分為外周PM蛋白、內(nèi)在PM蛋白和膜錨定蛋白。PM蛋白不能在脂雙層翻轉(zhuǎn)，但它可以在脂雙層中側(cè)向擴(kuò)散并持續(xù)擴(kuò)散。其中，外在PM蛋白是指蛋白質(zhì)通過非共價離子與磷脂分子的極性頭部結(jié)合或者通過其與內(nèi)在蛋白的相互作用而形成，主要存在于膜的外表面或內(nèi)表面[14]。內(nèi)在PM蛋白因其部分蛋白穿過或嵌入脂雙層，因此也被叫做跨PM蛋白，它是利用非極性氨基酸與磷脂分子的疏水區(qū)相互作用從而固定于膜上，由于其疏水結(jié)構(gòu)域之間的疏水作用，使得它與脂雙層的結(jié)合非常緊密。單個跨膜螺旋的蛋白質(zhì)代表了PM蛋白中功能最豐富和多樣的一種PM蛋白，如參與細(xì)胞通信、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)等多種生物功能[10，15-16]。脂錨定蛋白是指共價結(jié)合的脂質(zhì)錨定一些外周PM蛋白，使之既能插入脂雙層又能在膜表面固定蛋白質(zhì)，可分為2類：糖磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidy linositol，簡稱GPI）連接的蛋白，以及與插入PM內(nèi)小葉的長碳?xì)滏溄Y(jié)合的脂錨定蛋白;這種脂質(zhì)和蛋白結(jié)合形成的特定PM蛋白復(fù)合物在PM蛋白的運(yùn)動中可能會起到限定性作用。此外，可以通過分析在軸突初始段（axon initial segment，簡稱AIS）的PM蛋白的運(yùn)動的納米分區(qū)而了解PM蛋白的運(yùn)動規(guī)律[17]。

PM蛋白功能是多種多樣的。（1）作為受體，如參與許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的跨膜螺旋蛋白-G蛋白偶聯(lián)受體，它在視力、腦功能和運(yùn)動中都發(fā)揮著重要作用，且有幾種與此受體相關(guān)的G蛋白的功能具有膽固醇依賴性[18-21]。（2）介導(dǎo)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在植物PM內(nèi)側(cè)有一種異基三聚體G蛋白，可以在各種內(nèi)膜位置發(fā)出信號，調(diào)節(jié)植物代謝活動[22]。此外，植物PM蛋白冷應(yīng)答蛋白激1（cold-responsive protein kinase 1，簡稱CRPK1）通過磷酸化一種14-3-3蛋白，將冷信號從PM轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)植物應(yīng)對冷脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[23]。（3）作為物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的載體，成為細(xì)胞與外界交換的橋梁。如ERM蛋白家族是連接PM與細(xì)胞骨架之間的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)、膜流動性和細(xì)胞遷移等許多細(xì)胞過程中起作用[24-28]。此外，表面抗原與特異抗體結(jié)合的免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了與PM蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的深入研究和相關(guān)蛋白的鑒定[29]，這有利于推動PM蛋白在生物代謝，特別是植物代謝過程中作用研究。

2植物細(xì)胞PM蛋白的研究方法

PM蛋白分離和提取的技術(shù)方法主要包括：密度梯度離心、自由流動電泳和相聚合系統(tǒng)[30]。在這些方法中，兩相分配是用于提取高純度的PM囊泡蛋白最為常用的技術(shù)，PM囊泡是一種細(xì)胞裂解過程中形成的膜衍生的囊泡[3]。兩相分配是相聚合系統(tǒng)中的一種方法，其分離PM蛋白的大致流程見圖1。

2.1PM蛋白提取

在兩相分配系統(tǒng)中，生物物質(zhì)與成相組分通過疏水鍵、離子鍵、氫鍵等相互作用而不同程度的分配在兩相中。因此，必須根據(jù)不同的材料使用相應(yīng)的相，常用的相包括21 g相、27 g相等[31-33]。而自由流動電泳通常則是和水兩相分配結(jié)合使用，以保證提取的PM蛋白質(zhì)量[34]。利用密度梯度離心富集PM蛋白時，雖避免了前2種方法復(fù)雜繁瑣的過程，但可能因離心導(dǎo)致膜中的其他雜質(zhì)影響PM蛋白質(zhì)量[35]。利用此方法提取PM蛋白時，要注意去除雜質(zhì)或者與PM蛋白相關(guān)的一些非特異性蛋白質(zhì)。

上述3種方法提取的植物PM蛋白存在差異（圖2）。PM囊泡蛋白主要是存在于質(zhì)外體外側(cè)部分，當(dāng)需要利用內(nèi)側(cè)PM蛋白時，使用的方法需要利用一種非離子型去垢劑 Brij-58，它可使PM囊泡發(fā)生內(nèi)向翻轉(zhuǎn)來達(dá)到此目的[30]。由于Brij-58提取質(zhì)體內(nèi)側(cè)PM蛋白的效果比較明顯，且其提取的PM蛋白純度較高，用Brij-58處理總微粒體以減少細(xì)胞器蛋白的污染，可以提高PM蛋白的豐度[36]。Brij-58還能夠與丙烯酸或其他類似物質(zhì)形成微凝膠，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附或解吸[37]。

2.2PM蛋白分離

當(dāng)提取出PM蛋白后，通過雙向電泳或是無凝膠技術(shù)分離目的蛋白或肽。2-DE是將等電聚焦電泳（isoelectric focusing，簡稱IEF）以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE）二者相結(jié)合的高分辨分離蛋白方法[35，38]。但2-DE存在對低豐度蛋白和疏水性蛋白不敏感的問題。鑒于2-DE的局限性，無凝膠分離蛋白技術(shù)得到了應(yīng)用，它是在蛋白質(zhì)鑒定之前將蛋白質(zhì)裂解以產(chǎn)生肽，而肽可以通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）分離，該方法操作快，覆蓋面更廣。具體試驗研究過程中，在如何對無凝膠技術(shù)和2-DE這2種蛋白質(zhì)分離技術(shù)進(jìn)行選擇過程中，仍然存在爭議，因為無凝膠技術(shù)雖然能彌補(bǔ) 2-DE 在低豐度蛋白上的缺陷，擴(kuò)大其分離范圍，提高分離效率，但2-DE能夠提供完整的蛋白質(zhì)的映射，同步反映了由于蛋白質(zhì)同種類型和翻譯后修飾的變化的移位。因此這2種方法各有優(yōu)劣，在試驗過程中需根據(jù)實際情況進(jìn)行[39]。

當(dāng)PM蛋白分離后，通過免疫印跡分析以及H+-ATP酶水解活性測定，以確定所分離PM蛋白的純度，通過不同的標(biāo)記酶的抑制劑作用于酶，觀察釋放的磷的含量從而測定ATP酶的活性[40]。

2.3LC-MS/MS

用胰蛋白酶將獲取的蛋白質(zhì)消化后通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS）分析，然后在相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)蛋白，這種鑒定方法基本在大部分PM蛋白提取試驗中都適用，LC-MS/MS分析是現(xiàn)階段蛋白質(zhì)研究的常用方法，其過程方便快捷，操作也比較簡單，且利用此方法分析出來的結(jié)果準(zhǔn)確率高。在提取PM蛋白的整個過程中必須盡可能地使所提取的PM蛋白純度更高，為了達(dá)到這個目的，現(xiàn)在可用的方法是使用相關(guān)的去污劑來達(dá)到這個效果，它對于溶解和純化PM蛋白具有很好的效果[41]。

3植物PM蛋白組的功能研究

細(xì)胞膜被認(rèn)為是液相平面，其中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)理論上可以自由擴(kuò)散。而細(xì)胞壁有可能限制蛋白質(zhì)的擴(kuò)散，特別是對于[CM（25]具有較大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，即使蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁組分之間沒有結(jié)合或者是相互作用[42]。此外，PM蛋白在植物物質(zhì)運(yùn)輸方面也起到相當(dāng)重要的作用，通過分析比較相關(guān)PM蛋白前后積累量的變化發(fā)現(xiàn)，部分PM蛋白在膜運(yùn)輸?shù)倪^程中起調(diào)節(jié)作用[38]。PM內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，簡稱PIP）主要位于PM中，促進(jìn)水和小的不帶電溶質(zhì)的被動擴(kuò)散，可以通過研究PIP調(diào)節(jié)水分運(yùn)動來了解植物細(xì)胞如何調(diào)節(jié)其膜滲透性[43]。有研究對PIP的合成進(jìn)行RNA干擾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PIP不僅在植物水分跨膜運(yùn)輸過程中具有重要作用，而且能夠通過改變PM蛋白的組成響應(yīng)其在膜運(yùn)輸中的作用，即影響植物的蒸騰作用和氣孔運(yùn)動[44]。因此，PM蛋白在幫助植物物質(zhì)運(yùn)輸方面起著重要作用。

植物PM蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞功能詮釋中具有非常重要的作用。如通過蛋白組學(xué)手段，以模式植物擬南芥為研究對象，并結(jié)合PM蛋白質(zhì)微結(jié)構(gòu)域方面開展相關(guān)研究，并取得一系列研究結(jié)果[30]。在研究植物PM蛋白功能方面，不同試驗情況采用不同的研究手段。

利用經(jīng)典的SDS-PAGE技術(shù)對擬南芥PM蛋白成分研究，發(fā)現(xiàn)生長素結(jié)合蛋白1（auxin binding protein 1，簡稱ABP1）并不是擬南芥生長發(fā)育所必需的，也不是植物生長發(fā)育必需的[45]。植物是一種固著生物，但卻生長在一個快速變化的環(huán)境中，在其生長和發(fā)育過程中經(jīng)常會遇到各種環(huán)境脅迫，包括生物和非生物脅迫[46]。在植物生物脅迫方面，為揭示擬南芥感染灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）后的響應(yīng)機(jī)制，Costa等利用兩相分配的方式研究發(fā)現(xiàn)，部分PM蛋白能夠響應(yīng)某種病原體感染，并部分具有應(yīng)激機(jī)制[47]。PM蛋白在植物響應(yīng)和耐受鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用[48]，Li等通過密度梯度離心，對響應(yīng)鹽脅迫的甜菜相關(guān)PM蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了植物響應(yīng)鹽脅迫以及鹽脅迫耐受性的部分相關(guān)機(jī)制[35]。此外，有研究人員通過分析玉米（Zea mays L.）PM蛋白在正常水環(huán)境以及水脅迫環(huán)境下的分布，并依據(jù)生理、轉(zhuǎn)錄組和細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)等的分析闡釋了玉米根適應(yīng)水脅迫的壓力進(jìn)行生長調(diào)節(jié)的機(jī)制[49]。鹽脅迫和水脅迫都只是非生物脅迫的一部分，而植物如何適應(yīng)各種不良環(huán)境，PM蛋白又在其中扮演著怎樣的角色，在以后的植物學(xué)研究中尚有很多亟待解決的問題。

除此之外，隨著PM蛋白技術(shù)的不斷改進(jìn)，越來越多的植物PM蛋白功能被不斷發(fā)現(xiàn)。如通過兩相分配結(jié)合無凝膠技術(shù)提取質(zhì)膜蛋白，并通過鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)分析[50]揭示了鐵元素的缺乏對于甜菜質(zhì)膜蛋白的重要影響;利用無標(biāo)記和基于MaxQuant的蛋白質(zhì)組學(xué)方法[40]發(fā)現(xiàn)了甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）對磷缺乏適應(yīng)性機(jī)制的基因型差異;Preger等通過密度梯度離心與無凝膠技術(shù)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了大豆質(zhì)膜上的一種b型細(xì)胞色素受生長素響應(yīng)基因[WTBX][STBX]AIR2調(diào)控，并控制其開花特異性[51]。隨著PM蛋白研究技術(shù)的不斷發(fā)展，植物PM蛋白的功能將會越來越清晰。

4植物PM蛋白質(zhì)組研究的問題與挑戰(zhàn)

作為細(xì)胞與外界的連接紐帶，PM具有物質(zhì)運(yùn)輸，信號傳導(dǎo)，細(xì)胞壁生物合成和分泌的一系列重要功能。而作為構(gòu)成PM重要成分的蛋白質(zhì)，它在PM的眾多功能中又具體扮演著什么樣的角色，這是我們目前要去深入探討的一個問題。隨著研究的深入，研究人員一步一步揭開了關(guān)于植物PM蛋白質(zhì)的神秘面紗，其結(jié)構(gòu)和功能也越來越多地被了解。目前針對植物PM蛋白質(zhì)組的相關(guān)研究，主要集中在對模式植物或經(jīng)濟(jì)作物的PM蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其在植物生理功能方面的闡釋。

雖然有關(guān)PM的研究越來越多，但有很大比例都是關(guān)于PM的結(jié)構(gòu)和其微結(jié)構(gòu)域的研究。關(guān)于PM蛋白的研究相對偏少，植物PM蛋白的研究更少。PM蛋白研究的一個難點是PM蛋白的表面相對疏水，甚至需要洗滌劑從膜中提取，有時又非常不穩(wěn)定。這導(dǎo)致包括表達(dá)、溶解、純化以及相關(guān)蛋白的鑒定和翻譯后修飾的確定就更加困難[29]。關(guān)于植物PM蛋白研究存在的困難還比較多，包括在植物中ER-PM接觸位點的結(jié)構(gòu)和功能，目前也僅僅只鑒定出一些蛋白復(fù)合物[5]，PM蛋白參與其中作用的具體種類和作用機(jī)制仍未得到解決。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌動蛋白、血影蛋白和錨蛋白的軸突周期性模式形成了190 nm的間隔的環(huán)狀結(jié)構(gòu);然而，這種結(jié)構(gòu)是否與擴(kuò)散屏障功能相關(guān)還不清楚[17]，這對研究PM蛋白在PM中的運(yùn)動軌跡也造成了阻礙。

雖然在植物PM蛋白質(zhì)組研究的很多方面仍舊存在很多困難，但在研究人員的不懈努力下，PM蛋白質(zhì)組的研究仍然穩(wěn)步前進(jìn)中，并且取得了一定進(jìn)展。比如最近引入基于代謝標(biāo)記（metabolic labeling）和點擊化學(xué)（click chemistry）的生物化學(xué)結(jié)合的方法能夠通過超分辨率顯微鏡對不同膜組分進(jìn)行直觀觀察[52-54]。這個方法一定程度上克服了PM蛋白研究的一部分困難。除此之外，植物PM蛋白質(zhì)組在PM功能、在各種代謝中的不同作用以及植物各種環(huán)境脅迫應(yīng)激過程中，不同的作用種類及其結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)制仍然有很多問題需要解決。盡管植物PM蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還比較有限，但有理由相信，未來植物PM蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果會越來越多、方法會越來越成熟，越來越多的PM蛋白功能會被闡釋。

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