阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌TAM向M1表型極化

何少忠（通信作者），毛亞婷，王群，廖桂祥（通信作者）

1 深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科 （廣東深圳 518102）；2 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科 （廣西桂林541004）；3 深圳市人民醫(yī)院放療科 （廣東深圳 518020）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）是外周血單核細(xì)胞遷移浸潤到腫瘤組織的巨噬細(xì)胞，是乳腺癌免疫微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞，在促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展與免疫逃逸中發(fā)揮關(guān)鍵的橋梁作用[1-5]。根據(jù)TAM活化類型及其在腫瘤微環(huán)境中作用不同，主要分為兩種極化類型，即經(jīng)典活化M1型和替代活化M2型，M1型主要誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤；M2型主要誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，抑制炎癥促進(jìn)腫瘤生長[6-9]。VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路在腫瘤血管生成中起關(guān)鍵作用，有研究報(bào)道VEGF促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移募集到腫瘤組織形成TAM，而VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路是否參與TAM的極化表型調(diào)控[10-13]。本研究試想通過阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)，以促進(jìn)乳腺癌TAM向M1表型極化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞及小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞RAW264.7（中科院上海細(xì)胞庫），4T1細(xì)胞使用含10%滅活胎牛血清的PRMIl640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，RAW264.7細(xì)胞使用含10%滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。

1.1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶EDTA消化液、胎牛血清（FBS）及無血清Opti-MEMI培養(yǎng)基（美國Gibco公司），小鼠細(xì)胞因子（IL-10、IL-12、VEGF、ELISA、TGF-β）檢測(cè)試劑盒（美國Invitrogen公司），Alexa Fluor? 488 anti-mouse CD206、PerCP anti-mouse F4/80、APC anti-mouse CD16/32抗體（美國Ebioscience公司），慢病毒（賽業(yè)生物），阿帕替尼（江蘇恒瑞公司），貝伐單抗（上海羅氏公司）。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)鑒定TAM細(xì)胞模型，檢測(cè)VEGFR-2蛋白表達(dá)

將小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液并用0.22 μm過濾器過濾得到4T1細(xì)胞上清液。將RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，長到60%～70%底面積時(shí)，棄掉原來培養(yǎng)液，加入4T1細(xì)胞上清液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)形成TAM細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)前后TAM表型，ELISA檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞因子的變化和WB檢測(cè)誘導(dǎo)前后VEGFR-2蛋白表達(dá)。

1.2.2 阻斷VEGF/VEGFR-2 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)TAM表型的干預(yù)實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，加入4T1細(xì)胞上清液培養(yǎng)48h后，誘導(dǎo)形成TAM細(xì)胞。與未干預(yù)TAM組對(duì)比，設(shè)4個(gè)TAM干預(yù)組，分別為VEGFR-2基因siRNA組、VEGF抗體（貝伐單抗）阻斷組、VEGFR-2受體抑制劑（阿帕替尼）阻斷組、貝伐單抗+阿帕替尼聯(lián)合阻斷組。VEGFR-2基因siRNA組用慢病毒轉(zhuǎn)染TAM細(xì)胞沉默VEGFR-2的表達(dá)，貝伐單抗組和阿帕替尼組分別用20 μg/ml貝伐單抗和8 nM阿帕替尼作用24 h，貝伐單抗+阿帕替尼藥物聯(lián)合干預(yù)組則聯(lián)用20 μg/ml貝伐單抗+8 nM阿帕替尼處理24 h。收集細(xì)胞后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TAM表型、ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的變化和WB檢測(cè)VEGFR-2表達(dá)，明確阻斷VEGF/VEGFR-2 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)TAM表型的影響。

1.2.3 TAM遷移實(shí)驗(yàn)

將1.2.2各組處理后細(xì)胞用胰酶消化細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，加入transwell小室上室，下室加入培養(yǎng)液，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出上室用固定液固定20 min，將膜取下結(jié)晶紫染色，封片，鏡下拍照。倒置顯微鏡下觀察上室外表面細(xì)胞，各取5個(gè)視野。脫色處理后在550 nm處酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（OD）值，與未干預(yù)TAM組對(duì)比，檢測(cè)4個(gè)干預(yù)阻斷組TAM侵襲能力的改變。

1.2.4 TAM吞噬實(shí)驗(yàn)

將1.2.2各組處理后細(xì)胞棄培養(yǎng)液培養(yǎng)，對(duì)照孔加0.5 ml 0.9%氯化鈉注射液，其余每孔加0.5 ml 0.075%中性紅，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，傾去上清液，用PBS洗滌，每孔加入細(xì)胞溶解液，室溫下放置30 min。待細(xì)胞溶解后，即用分光光度計(jì)測(cè)定OD值，檢測(cè)未干預(yù)TAM與4個(gè)干預(yù)阻斷組TAM的吞噬能力的改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)量資料以±s表示，率的比較采用方差分析，采用bonfernoni分析總體及總體中兩樣本均數(shù)之間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAM細(xì)胞誘導(dǎo)模型呈M2型極化

2.1.1 TAM細(xì)胞呈M2型極化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞48 h后細(xì)胞表面分子標(biāo)志的表達(dá)，M1型（表面分子標(biāo)記 F4/80+CD16/32）細(xì)胞比例由誘導(dǎo)前12.95%降低至誘導(dǎo)后4.47%（P＜0.05），M2型（表面分子標(biāo)記F4/80+CD206）細(xì)胞由誘導(dǎo)前4.44%升高至誘導(dǎo)后18.51%（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)前后表面分子變化

表1 M1、M2型細(xì)胞誘導(dǎo)前后比較（%，±s）

表1 M1、M2型細(xì)胞誘導(dǎo)前后比較（%，±s）

注：與誘導(dǎo)前RAW264.7組比較，aP＜0.001

組別 M1（CD16/32+） M2（CD206+）誘導(dǎo)前RAW264.7組 12.95±2.61 4.40±0.62誘導(dǎo)后TAM組 4.47±0.50a 18.51±3.14a

2.1.2 TAM細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子減少，Th2型細(xì)胞因子分泌水平增高

M1和M2型巨噬細(xì)胞分別通過分泌Th1型細(xì)胞因子（IL-12）和 Th2型細(xì)胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β 及ARG-1）來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，4T1細(xì)胞上清液誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞后Th1型細(xì)胞因子（IL-12）分泌減少（P＜0.05），Th2型細(xì)胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β及ARG-1）分泌增多（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ELISA檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)前后細(xì)胞因子變化

2.2 M2型TAM高表達(dá)VEGFR-2受體

2.2.1 TAM細(xì)胞高表達(dá)VEGFR-2蛋白

Western Blot檢測(cè)經(jīng)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7后VEGFR-2蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)后TAM細(xì)胞VEGFR-2蛋白含量增高（P＜0.05），是誘導(dǎo)前細(xì)胞的2.5倍。見圖3。

圖3 WB檢測(cè)VEGFR-2的蛋白表達(dá)

2.2.2 M2 型TAM高表達(dá)VEGFR-2蛋白受體

流式細(xì)胞術(shù)雙染檢測(cè)小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1上清液誘導(dǎo)48 h后M1與M2型TAM中VEGFR-2膜蛋白的表達(dá)，M2型細(xì)胞的比例由50.1%升高到83.1%（P＜0.05），VEGFR-2蛋白在M2型細(xì)胞中的比例由33.7%上升至48.5%（P＜0.05），而VEGFR-2蛋白在M1型細(xì)胞中比例改變不明顯。見圖4和表2。

2.3 阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)能夠逆轉(zhuǎn)M2-TAM表型，促進(jìn)TAM向M1極化

RAW264.7小鼠單核-巨噬細(xì)胞加入4T1細(xì)胞上清液誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后得到TAM細(xì)胞。將上述細(xì)胞分為5組，分別為TAM空白對(duì)照組、VEGFR-2沉默組、VEGF抗體（貝伐單抗）阻斷組、VEGFR-2受體抑制劑（阿帕替尼）阻斷組和貝伐單抗+阿帕替尼聯(lián)合阻斷組。通過siRNA技術(shù)干擾TAM細(xì)胞VEGFR-2表達(dá)、VEGF抗體（貝伐單抗）、VEGFR-2受體阻斷劑（阿帕替尼）及貝伐單抗+阿帕替尼藥物聯(lián)合分別阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)TAM極化表型的影響，結(jié)果提示阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)能夠逆轉(zhuǎn) M2-TAM表型，促進(jìn)TAM向M1極化。

圖4 流式雙染檢測(cè)誘導(dǎo)前（RAW264.7）與誘導(dǎo)后（TAM）M1與M2型VEGFR-2受體表達(dá)

表2 M1、M2型VEGFR-2的誘導(dǎo)前后比較（%，±s）

表2 M1、M2型VEGFR-2的誘導(dǎo)前后比較（%，±s）

注：與誘導(dǎo)前RAW264.7組比較，aP＜0.05

組別 M1（CD16/32+）VEGFR-2+M1（CD16/32+）M2（CD206+）VEGFR-2+M2（CD206+）誘導(dǎo)前RAW264.7組 97.9±3.0 94.3±3.1 50.1±12.7 33.7±5.6誘導(dǎo)后TAM組 99.2±1.2 85.4±5.2 83.1±13.6a 48.5±6.1a

2.3.1 Western Blot 檢測(cè)VEGFR-2的表達(dá)

相比于空白對(duì)照組，siRNA沉默TAM細(xì)胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致了VEGFR-2蛋白表達(dá)水平的降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 WB檢測(cè)TAM干預(yù)前后VEGFR-2蛋白表達(dá)

2.3.2 阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)TAM表型向M1極化

相比于空白對(duì)照組，siRNA沉默TAM細(xì)胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致M1型TAM比例升高（P＜0.05），M2型TAM比例下降（P＜0.05）。見圖6和表3。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞干預(yù)前后表面分子變化

表3 M1、M2型細(xì)胞干預(yù)前后比較（%，±s）

表3 M1、M2型細(xì)胞干預(yù)前后比較（%，±s）

注：與TAM空白對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別 M1（CD16/32+） M2（CD206+）TAM空白對(duì)照組 6.23±0.58 18.36±0.91 VEGFR-2沉默組 9.78±1.25a 10.52±0.61a貝伐單抗阻斷組 9.37±0.61a 12.67±1.46a阿帕替尼阻斷組 10.71±1.00a 8.23±0.30a貝伐單抗+阿帕替尼阻斷組 10.88±0.89a 5.48±0.46a

2.3.3 阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子分泌，減少Th2型細(xì)胞因子分泌

相比于TAM空白對(duì)照組，siRNA沉默TAM細(xì)胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)TAM表型向M1極化后，Th1型細(xì)胞因子（IL-12）分泌增多（P＜0.05），Th2型細(xì)胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β及ARG-1）分泌減少（P＜0.05）。見圖7。

圖7 ELISA檢測(cè)TAM細(xì)胞干預(yù)前后細(xì)胞因子變化

2.4 TAM遷移實(shí)驗(yàn)及吞噬實(shí)驗(yàn)

Transwell結(jié)果表明，相比于TAM空白對(duì)照組，siRNA 沉默TAM細(xì)胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷 VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)TAM表型向M1型極化，TAM遷移能力增強(qiáng)（P＜0.05）（圖8a）。中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌TAM向M1表型極化后，TAM細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)（P＜0.05）（圖8b）。

圖8 TAM表型向M1型極化后

3 討論

TAM在乳腺癌浸潤免疫細(xì)胞中的比例高達(dá)50%，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)及預(yù)后不良，越來越受到研究人員的重視[14-16]。TAM極化表型是影響腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的重要因素[17]。腫瘤微環(huán)境中TAM主要被誘導(dǎo)極化為M2型，特征性表達(dá) CD206、CD163，高表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10，低表達(dá)促炎細(xì)胞因子IL-12，分泌VEGF、TGF-β及CCL-22，產(chǎn)生精氨酸酶（Arg-1），誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，導(dǎo)致了免疫逃逸[18-20]。

本研究通過小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，模擬腫瘤微環(huán)境，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)TAM細(xì)胞誘導(dǎo)模型呈M2型極化，同時(shí)TAM細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子減少，Th2型細(xì)胞因子及VEGF分泌水平增高。

VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，VEGFR-2是VEGF的跨膜受體，由胞外區(qū)、膜區(qū)及胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)組成，VEGFR-2受體和VEGF配體結(jié)合從而激活催化域內(nèi)酪氨酸激酶，導(dǎo)致受體磷酸化而引起胞內(nèi)酶聯(lián)反應(yīng)；介導(dǎo)腫瘤異常血管新生VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路在腫瘤血管生成中起關(guān)鍵作用[21-22]。此外，有研究報(bào)道腫瘤缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)VEGF表達(dá)后，將吸引巨噬細(xì)胞遷移浸潤到腫瘤組織形成TAM，且TAM自身分泌VEGF形成正反饋，刺激局部血管形成募集更多的巨噬細(xì)胞浸潤腫瘤組織[23-24]。如何打破TAM形成的免疫抑制微環(huán)境，是腫瘤免疫治療面臨的重要問題[25]。本研究通過阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)，以促進(jìn)乳腺癌TAM向M1表型極化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

本研究通過siRNA沉默小鼠巨噬細(xì)胞VEGFR-2基因、VEGF抗體（貝伐單抗）、VEGFR-2受體阻斷劑（阿帕替尼）及貝伐單抗+阿帕替尼藥物聯(lián)合阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)，研究對(duì)TAM極化表型功能的影響。結(jié)果顯示，阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致VEGFR-2蛋白表達(dá)降低后，能夠逆轉(zhuǎn)M2-TAM表型促進(jìn)TAM表型向M1型極化，同時(shí)促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子分泌，減少Th2型細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)TAM的遷移、吞噬，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，證實(shí)通過阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)從而促進(jìn)TAM向M1型極化，對(duì)于調(diào)控腫瘤微環(huán)境中TAM表型功能具有重要意義。

綜上所述，阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)能夠逆轉(zhuǎn)M2型TAM，促進(jìn)TAM向M1型極化，增強(qiáng)TAM遷移吞噬能力，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。我們將進(jìn)一步構(gòu)造動(dòng)物模型，開展體內(nèi)研究證實(shí)阻斷VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)逆轉(zhuǎn)M2型TAM與T細(xì)胞活化的作用與機(jī)制。