自制超薄型瓊脂糖凝膠板電泳分離檢測血清LDH同工酶及成年人參考范圍的建立*

申春艷，陸桂琴，于嘉屏

(上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗所中心實(shí)驗室，上海 200433)

血清中的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是以同工酶形式存在的，包括LDH1～5的5種同工酶[1]。由于其具有器官特異性的特點(diǎn)，已為臨床診治提供了很多有價值的信息[2-4]。鑒于目前檢測LDH同工酶基本采用電泳的方法，商品化的試劑盒還很少，本研究在制備了超薄型瓊脂糖凝膠板的基礎(chǔ)上[5]，建立瓊脂糖凝膠電泳的方法來分離和檢測血清中的LDH同工酶，也為排除血清中影響LDH總活性及同工酶結(jié)果的干擾因素提供了鑒定方法。

1材料與方法

1.1 研究對象 方法學(xué)建立采用檢驗實(shí)驗室所檢測用的新鮮患者血清。參考區(qū)間的建立采用133例體檢正常的成年人新鮮血清。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑

1.2.1.1 電泳緩沖液：稱取巴比妥鈉15.4 g，巴比妥2.76 g，乙二胺四乙酸0.29 g，加超純水約800 ml，加熱溶解后用l mol/L鹽酸校正pH至8.6，最后定容至1 000 ml。

1.2.1.2 瓊脂糖凝膠板：用本室前期建立的方法制作超薄型瓊脂糖凝膠板[5]。每個密封盒放3塊獨(dú)立包裝的凝膠板，用膠帶封口，在盒蓋上標(biāo)明相關(guān)信息，放4℃冰箱保存。

1.2.1.3 呈色試劑：最終濃度為632.75 mmol/L乳酸鋰，0.565 mmol/L NAD，0.4 mmol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)，2.67 mmol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)。分別稱取一定量的乳酸鋰，NAD，NBT，PMS，混合研磨，分裝4℃避光保存。臨用時取出一份加0.2 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH9.5)2.5 ml，去離子水7.5 ml使之溶解。

1.2.1.4 慶大霉素溶液：無菌水配制12.8 μl/ml(512U/ml)慶大霉素溶液。

1.2.2 儀器：法國Sebia公司的Hydrasys2全自動電泳儀及LDH同工酶電泳試劑盒；北京市六一儀器廠的DYY-6D型電泳儀電源和DYCP-38C型電泳儀；上海培清科技有限公司的JS-680D全自動凝膠成像分析儀。

1.3 方法

1.3.1 酶反應(yīng)原理：LDH是糖酵解的一個重要酶，能可逆地催化下述反應(yīng)：乳酸+NAD+←→丙酮酸+NADH+H+。根據(jù)LDH五種同工酶的電泳遷移性的不同可加以識別。遷移最快(最靠近陽極)的為LDH1，其次依次為LDH2，LDH3，LDH4和LDH5。利用酶的催化反應(yīng)進(jìn)行顯色：以乳酸鋰作為底物，LDH催化乳酸脫氫生成丙酮酸，同時使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD+)還原為NADH，吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)將NADH的氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)(NBT)，使其還原為紫藍(lán)色的甲瓚化合物。其顏色的深淺與LDH酶活性呈正比，利用光密度儀或掃描儀即可得出各同工酶的相對百分含量。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳及酶帶染色：①取瓊脂糖膠板1塊，在膠板陰極側(cè)約1.5 cm處覆蓋一張濾紙條，吸去部分水分，然后將加樣孔模條置于其上，輕按模條加樣孔四周，使其緊貼在膠板上，避免氣泡。然后將2 μl樣品加入孔內(nèi)。注意必須使樣品全部均勻地充滿孔內(nèi)。加樣后靜置5～10 min，待樣品擴(kuò)散進(jìn)入膠內(nèi)，然后除去膜條。將膠板放入電泳槽上，兩端用8層紗布搭橋，電泳槽旁放一冰袋降溫，在恒壓50V條件下電泳20 min。②電泳完畢將呈色底物均勻布加于膠板上，上面覆蓋一張比膠板略大一點(diǎn)的PE薄膜，注意避免氣泡，置37℃恒溫水浴槽內(nèi)溫育30 min，并注意避光。溫育完畢即可見紫藍(lán)色酶帶，用5 ml/dl乙酸漂洗至背景干凈。③啟動凝膠圖像分析儀拍攝軟件拍照，通過凝膠圖像分析軟件分析檢測結(jié)果。

1.3.3 方法學(xué)確認(rèn)

1.3.3.1 精密度：批內(nèi)精密度實(shí)驗：將6份不同血清樣本進(jìn)行電泳分析，在同一張10人份的凝膠板上加樣，每份樣本加樣5個泳道，電泳圖譜采用光密度掃描計算。批間精密度實(shí)驗：將10份不同血清樣本進(jìn)行電泳分析，分6批在10人份的凝膠板上加樣，每份樣本加樣1個泳道，電泳圖譜采用光密度掃描計算。不同膠片間的精密度實(shí)驗：分別用6張膠板對4份血清樣本進(jìn)行電泳分析，每份樣本加樣5個泳道，電泳圖譜采用光密度掃描計算。

1.3.3.2 正確度及相關(guān)：采用自建LDH同工酶瓊脂糖凝膠電泳方法和Sebia電泳儀配套的LDH同工酶電泳試劑盒測定方法分別對31份血清樣本進(jìn)行比較分析。以自建方法為Y，Sebia方法為X，計算相關(guān)系數(shù)(r)和回歸方程(Y=bX-a)。

1.3.3.3 線性范圍：選擇高、低LDH活性的血清樣品各一份。高值活性為1 910U/L，低值活性為73 U/L。將高值(H)和低值(L)樣品按5L，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，5H的體積比混合成6個系列濃度的實(shí)驗樣品。用所建立的電泳方法檢測高、混合、低濃度樣品，各做5次重復(fù)檢測，取均值。以預(yù)期濃度為X，測定均值為Y，計算回歸方程：Y=bX+a。以相關(guān)系數(shù)r≥0.975，b趨近于1為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3.4 參考區(qū)間：取133例體檢健康成年人新鮮血清樣本進(jìn)行檢測，并統(tǒng)計檢測結(jié)果，建立本方法的LDH同工酶參考區(qū)間。

2結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳圖譜 采用本實(shí)驗的瓊脂糖凝膠電泳方法能成功地分離出LDH同工酶的5條酶帶，各條帶分離清晰，帶型整齊。根據(jù)電泳遷移率的快慢，從陰極(下端)到陽極(上端)的5條帶依次為LDH5，LDH4，LDH3，LDH2和LDH1。見圖1。

2.2 精密度

2.2.1 批內(nèi)精密度：6份血清樣本LDH1的批內(nèi)CV值為1.07%～8.77%，LDH2的批內(nèi)CV值為1.13%～3.93%，LDH3的批內(nèi)CV值為1.01%～4.39%，LDH4的批內(nèi)CV值為0.46%～6.23%，LDH5的批內(nèi)CV值為2.30%～6.84%。批內(nèi)CV值均小于8.77%。

2.2.2 批間精密度：10份血清樣本LDH1的批間CV值為1.93%～9.04%，LDH2的批間CV值為2.07%～5.85%，LDH3的批間CV值為2.03%～4.51%，LDH4的批間CV值為3.15%～12.08%，LDH5的批間CV值為4.41%～13.12%。批間CV值均小于13.12%。

2.2.3 不同膠板間精密度：4份血清樣本在不同凝膠板之間板間CV值，LDH1為1.04%～2.67%，LDH2為1.20%～3.05%，LDH3為1.33%～4.52%，LDH4為1.74%～7.32%，LDH5為2.97%～7.89%。膠板間CV值均小于7.89%。

2.3 正確度及相關(guān)分析 31例新鮮血清樣本的結(jié)果見表1，自建方法與Sebia方法的5種LDH同工酶結(jié)果間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.0281～0.5674，均P>0.05)，且兩方法間5種同工酶均顯著相關(guān)，斜率趨近于1。

表1 兩種方法LDH同工酶結(jié)果(%)的比較及相關(guān)分析

圖1 血清LDH同工酶瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.4 線性范圍 LDH1～LDH5的線性范圍及回歸方程參數(shù)、相關(guān)系數(shù)見表2。5種同工酶的線性相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.975，b趨近于1。表明5個同工酶譜在本方法范圍內(nèi)顯示出良好的線性。

表2 LDH同工酶線性范圍及回歸方程參數(shù)和相關(guān)系數(shù)

表3 LDH同工酶參考區(qū)間(%)

3討論LDH同工酶檢測在臨床上有著重要的臨床意義，肝臟疾病時以LDH5升高為主[6-7]，心肌損傷時以LDH1升高為主[8-9]，二者同時受損則LDH1和LDH5同時升高[10]，對心肌梗死伴有缺氧狀況及患者的危險程度具有良好的鑒別價值。

經(jīng)典的瓊脂糖凝膠板厚度常達(dá)到3 mm，染料不易滲透進(jìn)去，同工酶帶常會出現(xiàn)空泡，對掃描定量產(chǎn)生干擾。本研究采用自制的超薄型瓊脂糖凝膠板，厚度只有0.8 mm，用此凝膠板來分離檢測LDH同工酶，酶染色時間縮短至30 min，同工酶圖譜呈色清晰，分離效果良好。以往的加樣方式是通過齒狀加樣槽在瓊脂糖板上留出凹槽，將樣品加入其中，這往往會使膠板破裂。本實(shí)驗采用有孔的加樣膜條直接鋪在瓊脂糖凝膠板上加樣，操作方便，且在瓊脂糖膠板上不留痕跡，易于干燥保存。本研究配制的凝膠板中含有抗生素，因此不容易長菌，密封放置4～8℃可長達(dá)3個月以上。

本法建立的成人血清LDH同工酶參考區(qū)間符合LDH2>LDH1>LDH3>LDH4>LDH5的規(guī)律，與Sebia的LDH同工酶電泳試劑盒中的說明書所推薦的參考范圍(LDH1為16.1%～31.5%，LDH2為29.2%～41.6%，LDH3為17.0%～26.2%，LDH4為5.9%～12.3%，LDH5為3.2%～17.3%)相比較，有一定差異。這與瓊脂糖的純度、膠板厚度、染色深淺以及人種的差異等因素都有關(guān)系。

血清中的LDH總活性及同工酶結(jié)果會受到其它酶分子的干擾，嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。①巨分子LDH酶[11-12]：大多是LDH的其中一種同工酶與其自身抗體免疫球蛋白結(jié)合形成的巨分子酶，在電泳條帶上可形成一條寬帶，光密度掃描不易分開。巨LDH酶的形成有三種形式：一是某一同工酶與免疫球蛋白(IgA占60%，IgG或 IgM)的復(fù)合物；二是與脂蛋白結(jié)合；三是同工酶亞基自身異常聚合。聚合物酶帶導(dǎo)致電泳圖譜發(fā)生異樣改變，如LDH2至LDH3融合形成一條寬帶，或LDH2后有一彌散區(qū)，LDH3幾乎消失，一般為LDH與抗體結(jié)合的免疫復(fù)合物。巨分子LDH的出現(xiàn)是否與自身免疫性疾病有關(guān)目前尚無定論[13]。②醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，AD)[14]：肝臟中的AD濃度相當(dāng)高，當(dāng)肝細(xì)胞大量損傷時，AD即從肝臟內(nèi)釋放入血，使血清內(nèi)AD顯著升高，而AD能利用瓊脂糖上的羥基等基團(tuán)參與與LDH同樣的反應(yīng)，導(dǎo)致在LDH染色時在LDH5的陰極側(cè)顯示“LDH6”條帶。而此“LDH6”條帶的出現(xiàn)直接反映了肝臟的損害程度，這類患者死亡率很高[15]。因此，正確鑒定血清中的LDH干擾物質(zhì)對疾病的正確診斷具有重要意義，這些干擾物質(zhì)往往會影響LDH酶活性結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及LDH同工酶譜的紊亂，嚴(yán)重時會造成誤診，直接對患者的健康造成難以預(yù)料的后果。而本研究建立的瓊脂糖凝膠板電泳法就能鑒別這些干擾物質(zhì)，以確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確無誤。

因此，LDH同工酶瓊脂糖凝膠板電泳分離方法的建立，不僅向臨床提供了LDH同工酶的檢測結(jié)果，也有助于檢驗科對LDH異常升高的患者作進(jìn)一步的鑒別診斷，防止發(fā)出錯誤的檢驗報告，其應(yīng)用前景十分廣闊。