高效液相色譜法檢測慢性腎功能不全患者羥苯磺酸鈣穩(wěn)態(tài)血藥濃度與eGFR及肌酐干擾值相關(guān)性分析*

余久如，盧錦蓮，廖建紅，蔡維望

(1.黃石市第二醫(yī)院 a.檢驗科；b.腎病內(nèi)科，湖北黃石 435002；2.黃石醫(yī)養(yǎng)醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，湖北黃石 435004)

羥苯磺酸鈣作為改善微循環(huán)、抗血栓的藥物臨床使用較為常見，使用者中也包括一些腎功能不全的患者。這部分患者使用羥苯磺酸鈣后肌氨酸氧化酶法血清肌酐大幅降低，導(dǎo)致患者認為該藥物有明顯的改善腎功能作用[1-2]。羥苯磺酸鈣對肌氨酸氧化酶法血清肌酐檢測的干擾已被體外干擾試驗所證實[3]，且從干擾試驗觀察發(fā)現(xiàn)，腎功能不全患者血清中可能存在較高濃度的羥苯磺酸鈣。健康人單次口服羥苯磺酸鈣藥代動力學(xué)報道[4-6]較多，未見穩(wěn)態(tài)血藥濃度報道。

本研究借鑒血清羥苯磺酸鈣高效液相色譜法(HPLC)測定的文獻[5-6]，采用HPLC法檢測患者服用羥苯磺酸鈣后穩(wěn)態(tài)血清藥物濃度，觀察腎功能不全患者同非腎功能不全患者間的藥物濃度的差異，分析藥物濃度與腎小球濾過率(eGFR)及肌氨酸氧化酶法肌酐干擾值相關(guān)性。

1材料與方法

1.1 研究對象 選擇于2016年5～10月間黃石市第二醫(yī)院收治服用羥苯磺酸鈣劑量為1.5 g/d(Tid)的患者30例。其中，腎功能不全組：20例慢性腎臟病患者(符合K/DOQI指南診斷標(biāo)準(zhǔn))，男性13例，女性7例，年齡56.6(37～68)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：有腎功能不全(血清酶法肌酐高于120 μmol/L)。非腎功能不全組：本院收治非腎功能不全患者10例，男性7例，女性3例，年齡54.3(32～71)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：無腎功能不全(血清酶法肌酐低于90 μmol/L)。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)均為：有明顯心、肺及肝功能障礙者，發(fā)熱及血液白細胞計數(shù)高于參考范圍者，未按規(guī)定劑量服藥者。兩組均采集患者羥苯磺酸鈣服藥5天后清晨空腹靜脈血，分離血清-40℃保存待測。本研究征得患者知情同意，藥物的使用僅依據(jù)病情的需要。

1.2 試劑和儀器 儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀，八方世紀(jì)BF-2000氮氣吹干儀，上海精科雷磁PXSI-226離子計，sigma3K15離心機，海門市其林貝爾儀器制造有限公司QL-901渦旋振蕩器；美國ABBOTT公司ARCHITECT C8000全自動生化分析儀，日本富士膠片株式會社FUJIFILM DRI-CHEM4000ie干式生化分析儀。

藥品與試劑：口服羥苯磺酸鈣為西安利君制藥公司產(chǎn)品(0.5g/粒)；羥苯磺酸鈣對照品(含量94.8%，批號：100573-201503)購自中國食品藥品檢定研究院；對氨基苯甲酸對照品(含量99.8%，批號：100017-201210)購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸(分析純)購自武漢市中天化工有限責(zé)任公司；磷酸二氫鉀(分析純)、四丁基氫氧化銨水溶液(10%，分析純)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈(高效液相色譜純)購自山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；水為二次去離子水；肌氨酸氧化酶法肌酐試劑購自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C)試劑購自寧波瑞源生物科技有限公司；脫亞胺酶法肌酐試劑購自日本富士膠片株式會社；質(zhì)控品購自英國RANDOX公司；空白血清為未服藥物且排除心、肝、腎等常見疾病的健康體檢者混合血清。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-SP柱(5 μm，4.6*250mm，日本GL Sciences公司)，保護柱ODS-SP柱(5 μm，4.0*10mm，日本GL Sciences公司)；流動相：0.05 mol/L pH 3.0磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈(85∶15，v/v)，流動相中含0.1 mg/dl四丁基氫氧化銨[7]；流速：1.0 ml/min；檢測波長：300 nm；柱溫：35℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)液配制：稱取羥苯磺酸鈣對照品200 mg(相當(dāng)于羥苯磺酸鈣189.6 mg)，用100 ml容量瓶加去離子水至刻度溶解成標(biāo)準(zhǔn)儲存液。用去離子水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲存液配成濃度為19.0，37.9，94.8，189.6，474.0，948.0和1 896.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列儲存液；內(nèi)標(biāo)為對氨基苯甲酸，用去離子水配成50 mg/L濃度的內(nèi)標(biāo)儲存液。上述儲存液4℃避光冷藏備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測樣品)處理：吸取0.25 ml空白血清(患者血清)于2.5 ml具塞尖底塑料離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)系列儲存液 (去離子水)25 μl，加入內(nèi)標(biāo)儲存液(50 mg/L)25 μl，混勻后加入1 ml乙腈沉淀蛋白，旋渦振蕩1 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液0.65 ml于試管中，氮氣吹干后加250 μl流動相溶解，混勻后取20 μl進樣分析。

1.3.4 萃取回收率：取94.8，474.0，1 896.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列儲存液，按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測樣品)處理”法處理進樣分析，每種濃度平行做6份，得到萃取后峰面積。另取上述標(biāo)準(zhǔn)系列儲存液，除用去離子水替換空白血清外，其它按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測樣品)處理”法處理，每種濃度平行做2份，取峰面積均值作為對照計算羥苯磺酸鈣及內(nèi)標(biāo)萃取回收率。

1.3.6 準(zhǔn)確度及精密度：取空白血清標(biāo)本，以9∶1比例分別加入189.6，948.0，1896.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲存液(對照加去離子水)配制3份濃度為18.96，94.80，189.60 mg/L的加標(biāo)測試樣品和1份對照樣品，每份樣品按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測樣品)處理”法分別處理并進樣檢測，每天每種樣品檢測2次，連續(xù)5天，計算加標(biāo)回收率、日內(nèi)及日間精密度。

1.3.7 患者血清檢測：按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測樣品)處理”法檢測穩(wěn)態(tài)血藥濃度，并同期檢測其Cystatin C，肌氨酸氧化酶法肌酐和脫亞胺酶法肌酐。

2結(jié)果

2.1 方法專屬性 在1.3.1色譜條件下，空白血清、空白血清加內(nèi)標(biāo)、空白血清加內(nèi)標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)液及1名患者血清色譜圖見圖1。羥苯磺酸鈣、對氨基苯磺酸內(nèi)標(biāo)保留時間分別為：6.9和8.0min。色譜圖表明，血清內(nèi)源性物質(zhì)不干擾羥苯磺酸鈣測定。

A.空白血清；B.空白血清加內(nèi)標(biāo)；C.空白血清加內(nèi)標(biāo)和對照品；D.患者血清加內(nèi)標(biāo)。1.內(nèi)標(biāo)對氨基苯甲酸；2.羥苯磺酸鈣。

圖1血清羥苯磺酸鈣及內(nèi)標(biāo)對氨基苯甲酸HPLC色譜圖

2.2 萃取回收率 9.48，47.40，189.60 mg/L的羥苯磺酸鈣萃取回收率分別為：75.6%±1.22%，75.7%±1.48%，75.1%±1.29%；內(nèi)標(biāo)對氨基苯甲酸萃取回收率分別為：94.4%±1.14%，94.6%±1.32%，94.5%±1.38%；羥苯磺酸鈣及內(nèi)標(biāo)對氨基苯磺酸平均萃取回收率分別為：75.5%和94.5%。

2.3 線性范圍及檢測低限 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為1.90，3.79，9.48，18.96，47.40，94.80和189.60 mg/L，以羥苯磺酸鈣與內(nèi)標(biāo)氨基苯磺酸峰面積比為橫坐標(biāo)(X)，以羥苯磺酸鈣濃度為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸方程為：Y=33.733X-0.108 6(r2=0.999 1，P<0.01)。線性范圍：1.90～189.60 mg/L，檢測低限：0.452 mg/L。

2.4 準(zhǔn)確度及精密度 平均加標(biāo)回收率為98.9%(95.6%～103.6%)；18.96，94.80和189.60 mg/L三種濃度測試樣品日內(nèi)CV分別為4.8%，4.5%和4.1%，日間CV分別為6.3%，6.1%和5.4%。

2.5 腎功能不全組、非腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣、eGFR檢測結(jié)果 見表1。腎功能不全組和非腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度、eGFR檢測結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0．001)。

表1 兩組患者穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度及eGFR比較

2.6 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR及肌酐干擾值相關(guān)性及回歸分析結(jié)果 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR相關(guān)性顯著(r=-0.790，P=0.000)，回歸分析曲線見圖2，回歸方程為Y=608 0.61X-1.692(r2=0.975 3)，回歸方程顯著性檢驗F=710.882，P=0.001；腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與肌酐干擾值相關(guān)性顯著(r=0.816，P=0.000)，回歸分析曲線見圖3，回歸方程為Y=0.002 7X2+0.343 5X+22.935(r2=0.987 5)，回歸方程顯著性檢驗F=671.064，P=0.000。

圖2 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR回歸曲線

圖3 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與肌酐干擾值回歸曲線

3討論羥苯磺酸鈣化學(xué)名2，5二羥苯磺酸鈣，常用藥物及對照品(標(biāo)準(zhǔn)品)為一水合物，分子式為(C6H5O5S)2·Ca2+·H2O。其溶于水以離子形式存在。本文為便于比較，HPLC檢測中以無水羥苯磺酸鈣記其濃度。HPLC檢測羥苯磺酸鈣報道方法較多，鑒于其較強的極性，保留時間短，故多選用極性較強的色譜柱延長保留時間。研究中也測試過不同pH及配比的流動相，選取了分離度較好的流動相配制方法。方法學(xué)評價顯示方法專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍均滿足檢測血清羥苯磺酸鈣濃度的需要。

由于服藥患者肌酐檢測受到干擾，且基于Cystatin C計算的eGFR較簡化MDRD評估方程[8-9]應(yīng)用也較多，本文選用基于Cystatin C的eGFR評估患者的腎小球濾過功能。

文獻報道[4-6]健康人單次口服500mg羥苯磺酸鈣峰濃度(Cmax)9～18.0 mg/L，國秀芝等[10]報道HPLC法健康志愿者服藥(1.5 g/d，Tid)3天后的血藥峰濃度7.04～23.15 mg/L，與該研究非腎功能不全組基本吻合。同樣用藥劑量腎功能不全組穩(wěn)態(tài)藥物濃度數(shù)倍于非腎功能不全組，且肌氨酸氧化酶法肌酐測定的干擾值與藥物濃度呈顯著相關(guān)，也印證了藥物體外干擾劑量效應(yīng)實驗[3]。羥苯磺酸鈣主要以原形通過腎臟、腸道排泄，腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR呈顯著負相關(guān)，特別是當(dāng)eGFR低于12 ml(min·1.73m2)-1時，穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度急劇升高，顯示eGFR對羥苯磺酸鈣排泄的重要影響。

鑒于腎功能不全患者常規(guī)劑量服用羥苯磺酸鈣后出現(xiàn)與eGFR呈負相關(guān)的藥物蓄積，建議腎功能不全患者使用羥苯磺酸鈣應(yīng)依據(jù)eGFR降低用藥劑量。