鴉膽子素A誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460凋亡及機(jī)制的初步研究

李聰，王燕，趙曉麗，王真，蔣建東

鴉膽子素A誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460凋亡及機(jī)制的初步研究

李聰，王燕，趙曉麗，王真，蔣建東

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所（李聰、王燕、蔣建東），醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（趙曉麗、王真）

考察鴉膽子素A（BA）對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 H460 細(xì)胞凋亡的影響和作用機(jī)制。

用 BA 對(duì) H460 細(xì)胞進(jìn)行處理，采用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并利用 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè) BA 對(duì) H460 細(xì)胞凋亡的影響。Hoechst 33342 染色和免疫熒光染色觀察細(xì)胞凋亡時(shí)染色質(zhì)的凝集以及 DNA 損傷標(biāo)志蛋白 γ-H2AX 表達(dá)情況。Western blot 和RT-PCR 檢測(cè) H460 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

MTT 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，BA 能顯著抑制 H460 細(xì)胞增殖。對(duì) A549、H1299、H1355 三株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系進(jìn)行抑制增殖作用檢測(cè)，結(jié)果顯示 BA 對(duì)三株細(xì)胞系均有不同程度抑制作用。BA 作用 48 h 后，各濃度 BA 處理 H460 細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，具有時(shí)間依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BA 處理組可見(jiàn)明顯的染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核碎片化，DNA 損傷標(biāo)志蛋白 γ-H2AX 表達(dá)明顯增加。Western blot 結(jié)果顯示，BA 作用 48 h 后，促凋亡蛋白 Bax 表達(dá)升高，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達(dá)降低，與對(duì)照組相比，Bax/Bcl-2 比值顯著升高。同時(shí)與對(duì)照組相比，凋亡通路中的 cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 表達(dá)明顯增加，并引起凋亡標(biāo)志蛋白 PARP 切割。RT-PCR 結(jié)果顯示，BA 處理 H460 細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，Bcl-2 基因表達(dá)顯著降低。

BA 能抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460 細(xì)胞增殖，顯著誘導(dǎo)其凋亡，該作用與 BA 引起 DNA 損傷并激活線粒體凋亡通路有關(guān)。

鴉膽子素； 細(xì)胞凋亡； 癌，非小細(xì)胞肺； H460 細(xì)胞

肺癌是世界上發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）占到 85%。統(tǒng)計(jì)顯示，NSCLC 患者 5 年生存率極低（約 15%），原因是患者早期癥狀不明顯，約有 75% 的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期[1]，平均生存期僅為 4 個(gè)月[2]。目前的治療方法主要是手術(shù)治療、放化療、免疫治療、分子靶向治療以及藥物輔助治療等[3-4]。手術(shù)方法和放化療是臨床常用治療手段，但具有一定局限性；免疫治療和分子靶向治療，應(yīng)用時(shí)間尚短，其安全性和有效性仍需進(jìn)一步認(rèn)證[5-6]。目前，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性化合物是新藥發(fā)現(xiàn)的主要途徑，植物來(lái)源的紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等已廣泛應(yīng)用于臨床治療，因此尋找新的活性高、毒副作用小的藥物迫在眉睫。近年來(lái)，研究人員嘗試從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)能有效抑制惡性腫瘤的活性成分用于非小細(xì)胞肺癌的治療。

鴉膽子素 A（bruceine A，BA）又稱鴉膽子苦素 A，是從植物鴉膽子[(Linnaeus) Merrill]果實(shí)中提取分離的苦木內(nèi)酯類化合物。中醫(yī)認(rèn)為，鴉膽子味苦、性寒，有小毒，歸大腸、肝經(jīng)，有清熱、解毒、截瘧、止痢和腐蝕贅疵之功效[7]。在我國(guó)南部地區(qū)，鴉膽子多用作抗瘧藥，臨床常將鴉膽子油乳劑用于肺癌及肺癌腦轉(zhuǎn)移、肝癌和消化道腫瘤的輔助治療。有研究表明鴉膽子油乳劑具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到人急性髓性白血病的潛力[8]，但關(guān)于鴉膽子中的單體成分 BA 是否具有抗腫瘤作用，目前尚無(wú)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)擬利用 H460 細(xì)胞這一 NSCLS 細(xì)胞株，針對(duì) BA 進(jìn)行體外抗腫瘤作用研究，主要觀察其抑制H460 細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用，同時(shí)探討 BA 作用下 H460 細(xì)胞發(fā)生凋亡的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 鴉膽子素 A（CAS 25514-31-2，HPLC ≥ 98%）購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司；人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460 購(gòu)自美國(guó) ATCC；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25% 胰蛋白酶、10000 U/ml 青霉素 G-鏈霉素均購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；RNase A、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó) Amresco 公司；PVDF 膜、ECL 化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；Bradford 蛋白定量試劑、5 ×上樣緩沖液由普利萊基因技術(shù)有限公司提供；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；Hoechst 33342 和 β-actin（A1978）抗體購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；細(xì)胞裂解液、Western blot 所用一抗購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他無(wú)機(jī)試劑均由北京化工廠提供。

1.1.2 儀器 CKX41 倒置顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus 公司；37081 熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó) Carl Zeiss 公司；Mikro 200R 低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hettich Zentrifugen公司；Centrifuge 5424 高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；165-8001 蛋白垂直電泳儀、170-3940 蛋白半干轉(zhuǎn)膜儀、Model 680 酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；Amersham Imager 600 凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó) GE 公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460 細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后用RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，在使用前加入 10%（v/v）FBS、100 U/ml 青霉素 G和 100 μg/ml 鏈霉素，細(xì)胞置于 37 ℃和 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以 5 × 103/孔（100 μl）接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后，加入用培養(yǎng)基配置的不同濃度藥物 100 μl，每個(gè)濃度設(shè)置 3 個(gè)平行孔，并設(shè)不加藥物的溶劑對(duì)照組和無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照組。加藥作用 48 h 后，每孔避光加入 20 μl MTT（5 mg/ml），37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸凈孔內(nèi)液體，每孔加 150 μl DMSO，在微量振蕩器上輕輕振搖 7 min，用酶標(biāo)儀于 570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以不加藥物的溶劑對(duì)照組細(xì)胞活力作為 100%，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以 3 × 105/孔接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后用藥物處理細(xì)胞 48 h，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。消化收集細(xì)胞（包括懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞），用預(yù)冷的 PBS 洗滌兩次，根據(jù) Annexin V-FITC/PI 染色試劑盒說(shuō)明書操作染色后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.4 Hoechst 33342 染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以 1 × 105/孔接種于六孔板，待細(xì)胞貼壁后分別用 0.5、5、20 μmol/L 濃度的 BA 處理細(xì)胞 48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入用新鮮培養(yǎng)基配制的2 μg/ml Hoechst 33342 染色液，1 ml/孔。避光染色 15 min，PBS 清洗兩次后，加入新鮮培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集現(xiàn)象并拍攝圖片。

1.2.5 免疫熒光染色 六孔板中加入無(wú)菌蓋玻片，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后用 0.5、5、20 μmol/L BA 處理細(xì)胞 48 h，制作細(xì)胞爬片。將爬好細(xì)胞的玻片用 PBS 洗3 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗 3 次，0.5% Triton X-100 通透 20 min，吸干表面 PBS，滴加山羊血清室溫封閉 1 h，吸掉封閉液直接滴加稀釋好的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PBST 浸洗 3 次，吸干多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗（FITC），避光孵育 1 h，隨后 PBST 洗 3 次，吸干殘余液體染核，封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白水平變化 取 H460 細(xì)胞以 3 × 105/孔的密度接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后加藥物處理細(xì)胞 48 h，收集細(xì)胞（冰上操作），PBS 清洗，收集細(xì)胞沉淀。根據(jù)細(xì)胞沉淀的體積，加入細(xì)胞裂解液。冰上裂解 30 min，12 000 r/min、4 ℃離心 15 min，收集上清即為蛋白提取液，根據(jù) Bradford 法測(cè)得的蛋白濃度，按照 20 μg/管分裝后上樣，根據(jù)蛋白分子量大小用 10% 和 15% SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，采用半干轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h，漂洗，加一抗 4 ℃孵育過(guò)夜，次日取出 PVDF 膜，洗去未結(jié)合的抗體，加入二抗溶液，室溫下反應(yīng) 1 h，洗膜，用 ECL 免疫印跡試劑盒進(jìn)行顯色，通過(guò) Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像。

1.2.7 RT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá) H460 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后接種于六孔板，待細(xì)胞貼壁用 BA 處理，48 h 后，Trizol 裂解提取 RNA，測(cè)定濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后進(jìn)行 RT-PCR，體系為 20 μl。結(jié)果以 GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行分析。引物序列如下：Bcl2：forward 5' ACGACTTCTCCCGCCGCTACC 3'；reverse 5' ACAATCCTCCCCCAGTTCACCC 3'；GAPDH：forward 5' GGATGATGTTCTGGAAGAGC C 3'；reverse 5' AACAGCCTCAAGA TCATCAGC 3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BA 化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì) H460 細(xì)胞增殖的影響

圖 1A 為 BA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。不同濃度 BA 處理細(xì)胞 48 h 后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力明顯下降，低濃度即可顯著抑制細(xì)胞增殖（圖 1B）。給予 0.5 μmol/L BA 分別作用 12、24、48、72 h 后，結(jié)果顯示，隨時(shí)間增加 BA 顯著抑制 H460 細(xì)胞增殖，該效應(yīng)具有時(shí)間依賴性（圖 1C）。增加 H1299、H1355、A549 三株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，檢測(cè) BA 對(duì)其增殖影響，結(jié)果可見(jiàn)，BA 能不同程度抑制這 4 種細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比具有顯著差異（圖 1D）。

圖 1 BA 化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響（A：BA 化學(xué)結(jié)構(gòu)；B：不同濃度BA 對(duì)H460 細(xì)胞增殖影響；C：不同作用時(shí)間對(duì)H460 細(xì)胞增殖影響；D：BA 對(duì)不同細(xì)胞系增殖影響；與對(duì)照組相比，*P < 0.001）

Figure 1 Chemical structure of BA and the proliferation inhibition of cells induced by BA (A: Chemical structure of BA; B: Effects of different concentration of BA for 48 h on proliferation of H460 cells; C: A time-dependent manner with 0.5 μmol/L BA; D: Effect of BA on proliferation of different cell lines, cells were treated with BA for 48 h;*< 0.001 vs. control)

2.2 BA 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) BA 對(duì) H460 細(xì)胞凋亡的影響。不同濃度 BA（0.5、5、20 μmol/L）處理 H460 細(xì)胞，其凋亡率分別為（31.77 ± 1.81）%、（34.31 ± 1.53）%、（47.45 ± 6.18）%，明顯高于對(duì)照組（3.16 ± 0.85）%（圖 2A）。5 μmol/L BA 作用 H460 細(xì)胞 24、48、72 h 后，H460 細(xì)胞凋亡率分別為（20.44 ± 3.71）%、（30.29 ± 1.79）%、（47.56 ± 1.31）%，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（圖 2B）。提示 BA 可顯著誘導(dǎo) H460 細(xì)胞凋亡。

2.3 BA 引起細(xì)胞核染色質(zhì)凝集

Hoechst 33342 進(jìn)行細(xì)胞核染色，經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞核完整，呈卵圓形，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞（圖 3A）。BA 處理 48 h 后，隨藥物濃度增加，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎片化等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變（如圖中箭頭處所示），隨 BA 濃度升高，凋亡細(xì)胞數(shù)目增多（圖 3B ~ D）。

2.4 BA 對(duì) γ-H2AX 表達(dá)的影響

采用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) γ-H2AX 表達(dá)情況，結(jié)果如圖 4 所示，不同濃度BA 處理 H460 細(xì)胞 48 h 后，細(xì)胞內(nèi) γ-H2AX 蛋白（圖中為綠色熒光）表達(dá)增加，且具有劑量依賴性。

2.5 BA 對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果（圖 5A）顯示，BA 處理H460 細(xì)胞 48 h 后，cleaved caspase-9 和 cleaved caspase-3 表達(dá)增加，以及 PARP 蛋白切割，提示 BA 誘導(dǎo) H460 凋亡可能是經(jīng)由線粒體通路，通過(guò)激活 caspase-9 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨后，針對(duì)凋亡發(fā)生機(jī)制展開(kāi)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白 Bax 隨 BA 濃度的升高表達(dá)量增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達(dá)減少，與對(duì)照組相比，Bax/Bcl-2 比值明顯升高（圖 5B），此外，圖 5C 中 Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著降低（< 0.01），揭示 BA 通過(guò)調(diào)節(jié) Bax 和 Bcl-2 表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖 2 BA 對(duì) H460 細(xì)胞凋亡的影響（A：濃度依賴性；B：時(shí)間依賴性；C：凋亡率直方圖；與對(duì)照組相比，*P < 0.001）

Figure 2 Apoptotic cell death of the H460 cells was induced by BA (A: A dose-dependent manner; B: A time-dependent manner; C: The corresponding histograms of A and B;*< 0.001 vs. control)

圖 3 Hoechst 33342 染色觀察BA作用H460 細(xì)胞48 h 后細(xì)胞核的變化（× 100）（A：空白對(duì)照組；B：0.5 μmol/L；C：5 μmol/L；D：20 μmol/L；標(biāo)尺= 100 μm）

Figure 3 The effect of BA on the H460 cells at 48 h was viewed using Hoechst 33342 staining (× 100) (A: Control; B: 0.5 μmol/L; C: 5 μmol/L; D: 20 μmol/L; Bar = 100 μm)

圖 4 免疫熒光檢測(cè)BA 對(duì)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX 蛋白含量的影響

Figure 4 The effect of BA on the expression of γ-H2AX in the H460 cells

3 討論

臨床上，鴉膽子油乳劑常用于肺癌、肝癌、消化道癌癥的輔助治療。BA 是鴉膽子果實(shí)中提取的單一化合物，目前關(guān)于 BA 的研究較少，多局限于提取分離以及治療犬類疾病[9-10]，對(duì)于其藥理作用尤其是抗癌作用及機(jī)制研究方面尚無(wú)報(bào)道[11-13]。針對(duì)單體化合物 BA 誘導(dǎo) H460 細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制的研究將為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供研究基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，采用不同濃度 BA 處理 H460 細(xì)胞 48 h，MTT 結(jié)果顯示 BA 能顯著抑制 H460 細(xì)胞增殖（< 0.001）。另選擇三株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 H549、H1299、H1355，檢測(cè) BA 抑制其增殖情況，結(jié)果顯示 BA 對(duì)不同細(xì)胞系均有顯著抑制作用，其中對(duì) A549 和 H1355 細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)。利用 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè) H460 細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示隨藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率明顯升高。Hoechst 33342 染色發(fā)現(xiàn)，BA 能引起 H460 細(xì)胞染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核碎片化。免疫熒光結(jié)果同樣印證，BA 能誘導(dǎo) H460 細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為 DNA 雙鏈斷裂標(biāo)志蛋白γ-H2AX含量增加。γ-H2AX 屬于組蛋白家族成員之一，為磷酸化激活狀態(tài)，是檢測(cè) DNA 損傷的標(biāo)志蛋白[14]，其表達(dá)量增加，說(shuō)明 BA 處理 H460 細(xì)胞可能引起細(xì)胞 DNA 損傷，但是目前尚不清楚 DNA 損傷是否是 BA 誘導(dǎo) H460細(xì)胞凋亡的機(jī)制，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖 5 BA對(duì)H460 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（A：BA 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響；B：Bax/Bcl-2 比值；C：BA 對(duì)Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響；與對(duì)照組相比，**P < 0.01，*P < 0.001）

Figure 5 The effects of BA on apoptosis-related protein expression in H460 cells (A: Expression of apoptosis-related proteins; B: Ratio of Bax/Bcl-2 expression; C: Bcl-2 mRNA expression in the H460 cells;**< 0.01 and*< 0.001 vs. control)

細(xì)胞凋亡即細(xì)胞的程序性死亡，主要有兩條途徑調(diào)節(jié)：第一種是外源性或細(xì)胞質(zhì)途徑，由 FAS 死亡受體激活；第二種是內(nèi)源性或線粒體途徑，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素 C 釋放，激活 caspase-9 引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。兩種途徑最終都匯合到共同的半胱天冬氨酸蛋白酶途徑，活化 caspase-3 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，降解細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能蛋白，引起細(xì)胞死亡[16]。實(shí)驗(yàn)證明 BA 能誘導(dǎo) H460 細(xì)胞凋亡，為檢測(cè)其作用機(jī)制，對(duì)凋亡通路蛋白（caspase-9、caspase-3）及其作用底物 PARP 表達(dá)量進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示 cleaved caspase-9 和 cleaved caspase-3 表達(dá)水平隨 BA 濃度增加而升高，提示 BA 誘導(dǎo) H460 細(xì)胞凋亡可能與激活線粒體途徑相關(guān)。Bcl-2 家族蛋白是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要分為兩類，促凋亡蛋白：Bax、Bak、Bad、Bcl-Xs等和抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W 等[17]。兩者通過(guò)促進(jìn)或抑制細(xì)胞色素 C 的釋放發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[18]。Western blot 檢測(cè) Bax 和 Bcl-2 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，隨給藥濃度增加，Bax 表達(dá)升高，Bcl-2 表達(dá)降低，提示 BA 通過(guò)調(diào)節(jié) Bax/Bcl-2 比值誘導(dǎo)H460 凋亡。此外，RT-PCR 結(jié)果提示，BA 能抑制 Bcl-2 mRNA 表達(dá)，其結(jié)果與 Western blot 結(jié)果一致。

綜上所述，BA 能在體外誘導(dǎo) H460 細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，其作用機(jī)制主要是通過(guò)升高Bax/Bcl-2 比值，激活線粒體通路中的 caspase-9，活化下游caspase-3，最終引起細(xì)胞凋亡。此外 BA 誘導(dǎo) H460 細(xì)胞發(fā)生 DNA 損傷也可能為其潛在的抗腫瘤機(jī)制之一。BA 作為一種天然的單體化合物，其對(duì) H460 細(xì)胞的作用及作用機(jī)制仍需深入研究。本實(shí)驗(yàn)只是驗(yàn)證了其對(duì) H460 細(xì)胞體外作用情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大 BA 抑瘤譜，針對(duì) EGFR 突變細(xì)胞系和對(duì) EGFR 具有抗藥性細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步研究，并針對(duì) Bcl-2 家族調(diào)節(jié)蛋白上游通路進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)開(kāi)展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為 BA 應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供參考依據(jù)。

[1] Oser MG, Niederst MJ, Sequist LV, et al. Transformation from non-small-cell lung cancer to small-cell lung cancer: molecular drivers and cells of origin. Lancet Oncol, 2015, 16(4):e165-e172.

[2] Inoue A, Yoshida K, Morita S, et al. Characteristics and overall survival of EGFR mutation-positive non-small cell lung cancer treated with EGFR tyrosine kinase inhibitors: a retrospective analysis for 1660 Japanese patients. Jpn J Clin Oncol, 2016, 46(5):462-467.

[3] Reck M, Rabe KF. Precision diagnosis and treatment for advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med, 2017, 377(9):849-861.

[4] Kumarakulasinghe NB, van Zanwijk N, Soo RA. Molecular targeted therapy in the treatment of advanced stage non-small cell lung cancer (NSCLC). Respirology, 2015, 20(3):370-378.

[5] Kumar SS, Higgins KA, McGarry RC. Emerging therapies for stage III non-small cell lung cancer: stereotactic body radiation therapy and immunotherapy. Front Oncol, 2017, 7:197.

[6] Molina JR, Yang P, Cassivi SD, et al. Non-small cell lung cancer: epidemiology, risk factors, treatment, and survivorship. Mayo Clin Proc, 2008, 83(5):584-594.

[7] Bawm S, Matsuura H, Elkhateeb A, et al. In vitro antitrypanosomal activities of quassinoid compounds from the fruits of a medicinal plant, Brucea javanica. Vet Parasitol, 2008, 158(4):288-294.

[8] Zhang H, Yang JY, Zhou F, et al. Seed oil of Brucea, javanica induces apoptotic death of acute myeloid leukemia cells via both the death receptors and the mitochondrial-related pathways. Evid Based Complement Alternat Med, 2011, 2011:965016.

[9] Sun Z, Cao Y, Zhai LZ. Java brucea and Chinese herbal medicine for the treatment of cholesterol granuloma in the suprasellar and sellar regions: A case report and literature review. Medicine (Baltimore), 2017, 96(5):e5930.

[10] Pan L, Chin YW, Chai HB, et al. Bioactivity-guided isolation of cytotoxic constituents of Brucea javanica collected in Vietnam. Bioorg Med Chem, 2009, 17(6):2219-2224.

[11] Yan Z, Guo GF, Zhang B. Research of Brucea javanica against cancer. Chin J Integr Med, 2017, 23(2):153-160.

[12] Kim SH, Liu CY, Fan PW, et al. The aqueous extract of Brucea javanica suppresses cell growth and alleviates tumorigenesis of human lung cancer cells by targeting mutated epidermal growth factor receptor. Drug Des Devel Ther, 2016, 10:3599-3609.

[13] Huang Z, Yang G, Shen T, et al. Dehydrobruceine B enhances the cisplatin-induced cytotoxicity through regulation of the mitochondrial apoptotic pathway in lung cancer A549 cells. Biomed Pharmacother, 2017, 89:623-631.

[14] Zhang F, Zhang T, Qu Y, et al. Replication-dependent γ-H2AX formation is involved in docetaxel-induced apoptosis in NSCLC A549 cells. Oncol Rep, 2010, 24(5):1297-1305.

[15] Ghobrial IM, Witzig TE, Adjei AA. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA Cancer J Clin, 2005, 55(3):178-194.

[16] Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol, 1994, 124(1-2):1-6.

[17] Takeda K, Stagg J, Yagita H, et al. Targeting death-inducing receptors in cancer therapy. Oncogene, 2007, 26 (25):3745-3757.

[18] Mahdavi S, Khodarahmi P, Roodbari NH. Effects of cadmium on Bcl-2/ Bax expression ratio in rat cortex brain and hippocampus. Hum Exp Toxicol, 2018, 37(3):321-328.

Bruceine A induces apoptosis in non-small-cell lung cancer cell line H460 by regulating mitochondria-related apoptosis signaling

LI Cong, WANG Yan, ZHAO Xiao-li, WANG Zhen, JIANG Jian-dong

Institute of Materia Medica (LI Cong, WANG Yan, JIANG Jian-dong), Institute of Medicinal Biotechnology (ZHAO Xiao-li, WANG Zhen), Chinese Academy of Medical Sciences & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

We aim to investigate whether bruceine A (BA) induces apoptosis in human non-small-cell lung cancer cell (NSCLC) H460 cells and to learn the mechanism.

The proliferation of NSCLC cell lines, including H460, A549, H1299 and H1355, was detected by the MTT assay after treatment with BA. Effect of BA on apoptosis in the H460 cells was measured by FACS analysis with Annexin V-FITC/PI staining. Hoechst 33342 and immunofluorescence (IF) staining were used to observe the chromatin condensation and the expression of the DNA damage marker protein γ-H2AX, respectively. Western blot and real-time PCR were used to detect the expression of apoptosis-related protein and mRNA in the H460 cells, respectively.

Based on MTT result, the proliferation was significantly inhibited in H460 cells after treatment with BA for 48 h. The proliferation inhibition of other NSCLC cell lines A549, H1299 and H1355 upon BA treatment was detected, and BA inhibited the proliferation of the three cell lines in a dose-dependent manner. Significant induction of apoptosis was observed in a time-dependent fashion upon BA treatment in the H460 cells. Also, remarkable nuclear condensation was observed following BA treatment in H460 cells using Hoechst 33342 staining. DNA damage marker γ-H2AX was increased by BA as evidenced by IF staining. Furthermore, BA increased and decreased the expression of Bax and Bcl-2, respectively, and cleaved caspase-9, caspase-3 and PARP protein, as demonstrated by Western blot. Also, Bcl-2 gene expression in the H460 cells was significantly decreased after BA treatment.

BA inhibits the H460 cells proliferation by inducing apoptosis, which may be mediated through the mitochondria-dependent apoptotic signaling pathways.

BRUCEINE; Apoptosis; Carcinoma, non-small-cell lung; H460 cell

JIANG Jian-dong, Email: jiang.jdong@163.com; WANG Zhen, Email: wangzhen@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（500101206）

蔣建東，Email：jiang.jdong@163.com；王真，Email：wangzhen @imb.pumc.edu.cn

2019-03-06