酶解法制備鰻魚內(nèi)臟魚油及品質(zhì)分析*

鐘佳澤，師藝冰，岑萬，陳由強(qiáng)，黃鷺強(qiáng)

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117 2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福建 福州 350117）

烤鰻是一種營養(yǎng)價(jià)值高、風(fēng)味好的即食水產(chǎn)品，在日本、韓國、中國香港等國家和地區(qū)深受消費(fèi)者歡迎。福建省是烤鰻加工和出口大省，目前烤鰻加工的大量副產(chǎn)物如魚頭、魚骨、內(nèi)臟等常作為魚粉的生產(chǎn)原料而未深度開發(fā)。但是，這些副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素等，其中鰻魚內(nèi)臟中不飽和脂肪酸含量較高并且富含二十碳五烯酸（DHA）和二十二碳六烯酸（EPA）等多不飽和脂肪酸[1]，具有特殊的生理功能[2，3]，是生產(chǎn)高品質(zhì)飼用魚油的良好原料。

目前工業(yè)生產(chǎn)多采用蒸煮法[4]、壓榨法[5]、溶劑抽提法[6，7]、淡堿水解法[8，9]、酶解法[10，11]等方法制備魚油。酶解法[12]具有生產(chǎn)條件溫和、得率高、產(chǎn)品質(zhì)量好的特點(diǎn)，蛋白酶水解原料產(chǎn)生的水解液富含氨基酸等物質(zhì)，可以得到進(jìn)一步的利用。利用烤鰻副產(chǎn)物鰻魚內(nèi)臟提取不飽和脂肪酸的魚油，可以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)副產(chǎn)物的高值化利用，項(xiàng)目具有良好的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

本研究以鰻魚內(nèi)臟為材料，采用酶解法研究粗魚油的制備及對魚油的品質(zhì)進(jìn)行分析，通過分析精煉魚油的主要理化指標(biāo)差異和精煉魚油的脂肪酸組成，為烤鰻加工副產(chǎn)物的綜合開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鰻魚內(nèi)臟（-20℃冷凍保存），由福建福銘食品有限公司提供。

1.1.2 試劑

復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（50000 U/g），廣州華琪生物科技有限公司；

菠蘿蛋白酶（60000 U/g）、木瓜蛋白酶（50000 U/g），上海源葉生物科技有限公司。

氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、乙醇、乙醚、乙酸、異辛烷、硫代硫酸鈉、異辛烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、韋氏試劑、環(huán)己烷等，均為國產(chǎn)分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

高嶺土為食品級試劑，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.1.3 儀器

電熱恒溫水浴鍋，金壇市易晨儀器制造有限公司；

MQK-WSL-2羅維朋比色儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

高速離心機(jī)，貝克曼湘儀離心機(jī)儀器（湖南）有限公司；

pH計(jì)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（帶真空泵），上海亞榮儀器有限公司；

6890 N-5975C氣相色譜質(zhì)譜色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗魚油制備及精煉

鰻魚內(nèi)臟→原料預(yù)處理→酶解→滅酶→水和魚油混合物→離心分離→粗魚油→脫膠→脫酸→水洗→脫色→脫臭→精煉魚油

1.2.2 原料預(yù)處理

將冷凍保存的鰻魚內(nèi)臟用4 ℃低溫解凍，洗凈，切成2～3 cm的小段。

1.2.3 酶解

稱取魚油內(nèi)臟組織（濕基），按料液比（w∶w=1∶1）添加等質(zhì)量的水，攪拌均勻。用NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)料液pH至7.0。酶解溫度為50 ℃，酶添加量為1.5%，酶解時(shí)間為2.0 h，在酶解過程中，隔15 min用玻璃棒攪拌15 s，促進(jìn)酶與底物接觸。

1.2.4 滅酶

將酶解后的料液置于100 ℃恒溫水浴中處理10 min滅酶。

1.2.5 離心分離

取酶解后的料液于離心管中，4000 r/min室溫離心15 min。離心后的魚油與水分層，用移液槍吸出上層的油，即粗魚油，將其置于樣品瓶中密封，冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2.6 脫膠

取一定量的粗魚油，加入魚油量1%的濃度為60%的磷酸，在65 ℃恒溫水浴下加熱攪拌1 min，取出魚油在5000 r/min的速率下離心10 min，取出上層的油脂，得到脫膠魚油。

1.2.7 脫酸

將脫膠魚油加入體積為魚油量1%，濃度為20%的NaOH溶液，攪拌后升溫至65 ℃恒溫水浴加熱30 min。取出魚油在5000 r/min 速率下離心10 min，去除下層沉淀。再向魚油中加入一定量60 ℃的蒸餾水，洗去魚油中殘留的皂腳，然后在5000 r/min的速率下離心10 min，重復(fù)2次，取出上層的油，得到脫酸魚油。

1.2.8 脫色

將脫酸魚油加入一定量的高嶺土，攪拌均勻，65 ℃下加熱30 min，然后在5000 r/min的速率下離心10 min，取出上層油脂，得到脫色魚油。

1.2.9 脫臭

使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在50 ℃真空條件下對脫色魚油進(jìn)行脫臭，得到精煉魚油。

1.3 脂肪酸組成測定

1.3.1 魚油甲酯化

準(zhǔn)確稱取1.0 g精煉魚油，加入6 mL 5%鹽酸甲醇溶液，密封，隔絕外界空氣，于60 ℃恒溫水浴3 h，每隔0.5 h上下顛倒一次，充分混勻。結(jié)束后加入適量的水和正己烷，充分混勻，靜置，取上層有機(jī)相，氮吹干，再加入2 mL的正己烷溶解，用0.22μm濾膜過濾于樣品瓶中，用于后續(xù)檢測。

1.3.2 脂肪酸組成測定

用氣質(zhì)聯(lián)用儀，對魚油的脂肪酸組成進(jìn)行測定。

柱類型和條件：SP2560 100 m×0.25 mm×0.2μm。

色譜條件：升溫程序?yàn)橹鶞?0 ℃保持2 min后，以4 ℃/min升至100 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，再保持12.5 min。進(jìn)樣口溫度220 ℃，分流比10∶1，載氣為氦氣，流速為 1 mL/min，進(jìn)樣量為1μL，采用峰面積歸一化法計(jì)算脂肪酸相對含量。

1.4 魚油理化指標(biāo)的測定

1.4.1 魚油得率的計(jì)算

魚油得率的計(jì)算采用如下公式

式中：F—魚油得率，%

w1—粗魚油質(zhì)量，g

w2—內(nèi)臟質(zhì)量，g

1.4.2 色澤測定

參照張麗等[13]使用羅維朋比色儀檢測油脂的黃值與紅值。

1.4.3 酸值測定

按照GB 5009.229-2016測定魚油酸值。

1.4.4 碘值測定

按照GB/T 5532-2008 測定魚油碘值。

1.4.5 過氧化值測定

按照LS/T 6106-2012 測定魚油過氧化值。

1.4.6 魚油的理化指標(biāo)評定標(biāo)準(zhǔn)

按照SC/T 3502-2016 對魚油進(jìn)行評價(jià)，如表1所示。

表1 魚油的理化指標(biāo)的規(guī)定

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0 軟件，用 Duncan氏多重比較法分析各實(shí)驗(yàn)組間的差異顯著性，圖表制作工具采用origin 8.5。數(shù)據(jù)處理均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），柱形圖上標(biāo)有不同字母表示在0.05 水平有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝

2.1.1 蛋白酶

在酶解溫度50 ℃，酶添加量為1.5%，酶解時(shí)間為2.0 h的條件下，選用木瓜蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示，木瓜蛋白酶酶解未徹底，另外2組酶解較徹底。復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的魚油得率最高，為14.0%，其次是菠蘿蛋白酶，木瓜蛋白酶效果最差。相對于木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解效果具有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 不同種類的蛋白酶對應(yīng)的魚油提取率

2.1.2 酶解溫度

采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，酶添加量為1.5%，酶解時(shí)間為2.0 h，設(shè)定5組溫度，結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，溫度55 ℃以下，隨著溫度的升高，魚油得率呈現(xiàn)上升趨勢；55 ℃時(shí)達(dá)到最大值，魚油得率為15.5%；隨后魚油得率隨著溫度的升高而下降。推斷溫度過高導(dǎo)致酶活性降低，從而影響酶解效率。因此，選擇酶解溫度55 ℃時(shí)魚油得率最高，與其它溫度條件比較具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 不同酶解溫度對魚油得率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間

圖3 不同酶解時(shí)間對魚油得率的影響

采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，酶添加量為1.5%，溫度為55 ℃，設(shè)定酶解時(shí)長，結(jié)果見圖3。

數(shù)據(jù)顯示，隨著酶解時(shí)間的延長，魚油得率不斷上升，最高得率為15.2%，超過2.0 h魚油得率沒有顯著性差異（p＞0.05）。隨著酶解時(shí)間加長，魚油色澤加深，可能是魚油被空氣中的氧氣氧化所致。因此，綜合實(shí)際生產(chǎn)因素考慮，酶解時(shí)間為2.0 h適宜。

2.1.4 酶添加量

采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，酶解時(shí)間為2.0 h，溫度為55 ℃，設(shè)定5組不同的酶添加量結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，隨著酶添加量的增加，魚油得率上升，當(dāng)酶添加量為2% 時(shí)，得率最高為15.7%；但當(dāng)酶添加量大于2% 時(shí)，魚油的得率反而略有下降，這可能是蛋白酶添加過多導(dǎo)致其對自身有部分水解作用，導(dǎo)致酶活力降低。綜合各方面因素酶添加量為2%最為合適，其得率相對其它的酶添加量具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 不同酶添加量對魚油得率的影響

2.2 魚油的色澤

經(jīng)羅維朋比色儀測定，發(fā)現(xiàn)魚油精煉前后的色澤變化明顯。黃值和紅值均有下降，紅值變?yōu)?，黃值大幅度下降，從10降到2，黃值和紅值的變化表明精煉魚油的脫色效果好。結(jié)果見表2。

表2 精煉前后魚油色澤比較

2.3 精煉前后魚油理化指標(biāo)

魚油質(zhì)量可以通過魚油理化指標(biāo)高低來評價(jià)，具體評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

動植物油脂酸價(jià)、過氧化值、碘價(jià)等高低反映了動植物油脂品質(zhì)。魚油經(jīng)過精煉步驟，可以去除游離脂肪酸，提高不飽和脂肪酸含量。從表3中可知，粗魚油酸值為(4.23±0.12) mg/g（＜8 mg/g），精煉魚油的酸值為(0.12±0.02) mg/g（＜1 mg/g）；粗魚油的過氧化值為(7.08±0.23) mmol/kg，精煉魚油的過氧化值為(4.48±0.15)mmol/k（＜5 mmol/kg），這些指標(biāo)均達(dá)到了SC/T 3502-2016 規(guī)定的一級魚油標(biāo)準(zhǔn)。

表3 精煉前后魚油理化指標(biāo)比較

2.4 魚油感官評價(jià)

粗魚油顏色呈紅棕色，稍微渾濁，有較重的魚腥味和輕微酸敗味；精煉魚油呈淡黃色，不含雜質(zhì)，具有特有的微腥味，沒有酸敗味。

2.5 精煉后魚油脂肪酸組成

精煉魚油經(jīng)甲酯化處理后，用氣質(zhì)聯(lián)用儀對其進(jìn)行脂肪酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

從表4可知，鰻魚油主要由C14～C22十種脂肪酸組成，其中不飽和脂肪酸占魚油的比重達(dá)到62.42%，主要以十八碳烯酸為主，其含量為49.90%，可見鰻魚內(nèi)臟可作為提取十八碳烯酸的良好材料。多不飽和脂肪酸的含量達(dá)到9.78%，DHA和EPA含量占9.55%；飽和脂肪酸比例為32.23%，主要以十五酸和十六酸為主。

表4 精煉魚油的脂肪酸組成

3 小結(jié)與討論

本研究采用酶解法從烤鰻加工副產(chǎn)物鰻魚內(nèi)臟中制備魚油，粗魚油通過脫膠、脫酸、脫臭等步驟進(jìn)行精煉，測定精煉前后魚油的主要理化指標(biāo)，用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定精煉后魚油的脂肪酸組成。

通過對3種蛋白酶的實(shí)驗(yàn)比較，得出復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解提油得率最高，此時(shí)酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間2 h、酶添加量2.0%，鰻魚內(nèi)臟魚油得率為15.7%。粗魚油通過精煉之后，魚油的酸值、過氧化值以及碘值分別為(0.12±0.02)mg/g、(4.48±0.15)mmol/kg以及(131.56±2.59)g/100g，除了碘值，其余都達(dá)到了SCT 3502-2016 規(guī)定的一級精煉魚油標(biāo)準(zhǔn)，色澤得到改善，黃值從10降為2，紅值降為0。

通過氣質(zhì)聯(lián)用儀對精煉魚油進(jìn)行檢測，得出：鰻魚油主要由C14～C22十種脂肪酸組成，其中，不飽和脂肪酸占魚油的比重占62.42%，以單不飽和脂肪酸十八碳烯酸為主。在多不飽和脂肪酸中，DHA和EPA含量占9.55%。飽和脂肪酸比重占32.23%，以十五酸和十六酸為主。

利用酶解法從鰻魚內(nèi)臟中提取魚油，可綜合利用生產(chǎn)副產(chǎn)物，提高綜合效益。同時(shí)，由于制備條件溫和，大大保留了魚油的功能性成分，可為進(jìn)一步研究和開發(fā)高品質(zhì)魚油產(chǎn)品提供思路。