子宮內(nèi)膜癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA ZEB1-AS1的表達(dá)與臨床特征及對(duì)化療藥物耐藥性研究*

李曉麗，胡隴娟

(1.寶雞市婦幼保健院婦科，陜西寶雞 721000；2.寶雞高新人民醫(yī)院產(chǎn)科，陜西寶雞 721013)

子宮內(nèi)膜癌是女性常見惡性腫瘤之一[1-2]，發(fā)病率目前處于逐年增加的趨勢(shì)[3-5]，僅次于宮頸癌[6]。隨著我國(guó)人口老齡化、晚婚晚育、不孕不育等情況增加，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病出現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[7]，且死亡率持續(xù)增加[8-10]。研究報(bào)道[11]，在部分城市子宮內(nèi)膜癌已成為最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。當(dāng)前，子宮內(nèi)膜癌主要以手術(shù)治療為主，放化療為輔[12]，但越來越多的子宮內(nèi)膜癌患者出現(xiàn)化療耐藥的情況[13]。鑒于此，本研究通過檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lnc RNA)ZEB1-AS1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者化療后遠(yuǎn)期預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為子宮內(nèi)膜癌化療耐藥提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究所有臨床組織樣本均為2013年1月～2017年12月收集于寶雞市婦幼保健院婦科的子宮內(nèi)膜癌患者，共計(jì)177例，患者平均年齡56.7±11.7歲。課題組前期每三個(gè)月對(duì)所有患者進(jìn)行一次電話隨訪。

1.2 試劑和儀器 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。PCR儀購于ABI公司。細(xì)胞裂解液TRizol購于Life Technologies公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TAKARA公司。胎牛血清購于逍鵬生物公司(Biological Industries，Israel)，lnc RNAZEB1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒購于吉?jiǎng)P公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購于Invitrogen公司，引物訂購于上海生工生物公司。氟尿嘧啶及順鉑訂購于逍鵬生物公司。E-cadherin抗體、vimentin抗體和GAPDH均購于ABCAM公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床組織標(biāo)本檢測(cè)：采用RT-PCR方法檢測(cè)臨床腫瘤組織標(biāo)本中l(wèi)nc RNAZEB1-AS1的表達(dá)量。反應(yīng)體系根據(jù)ABI公司說明書進(jìn)行配制，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析；ACTB作為內(nèi)參；取腫瘤組織相對(duì)表達(dá)量≥癌旁正常組織為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞株相關(guān)實(shí)驗(yàn)：①細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。②CCK-8實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于此實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，取胰蛋白酶消化重懸后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種300個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)平行孔；接種5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板用于在不同時(shí)間點(diǎn)(0，24，48，72，96 h)加入CCK-8試劑，隨后于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度，數(shù)值越高表示孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)越多。③化療藥物敏感度實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。用胰蛋白酶消化重懸后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)平行孔；按細(xì)胞對(duì)數(shù)濃度梯度設(shè)置化療藥物(5-氟尿嘧啶、順鉑)的濃度梯度，加藥，常規(guī)培養(yǎng)24 h后PBS清洗96孔培養(yǎng)板，加入含20 g/dl CCK-8試劑的培養(yǎng)基，2 h后于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)其吸光度，數(shù)值越高則表示孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)越多。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1表達(dá)水平的差異；采用卡方檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析不同子宮內(nèi)膜癌患者臨床特征與疾病進(jìn)展中l(wèi)ncRNA ZEB1-AS1表達(dá)水平的差異；采用K-M法繪制生存曲線；用Log-rank檢驗(yàn)不同組患者生存時(shí)間之間的差異；使用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析細(xì)胞遷移和侵襲能力差異；采用重復(fù)測(cè)量的方差分析方法分析細(xì)胞增殖能力的差異(CCK-8實(shí)驗(yàn)及化療藥物敏感度實(shí)驗(yàn))。統(tǒng)計(jì)過程使用實(shí)驗(yàn)SPSS19.0軟件進(jìn)行，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 lnc RNA ZEB1-AS1在臨床樣本子宮內(nèi)膜癌-癌旁組織中的表達(dá) lnc RNA ZEB1-AS1在118例(66.7%)癌組織中高表達(dá)，59例(33.3%)癌組織中低表達(dá)，見表1。癌組織中的lnc RNA ZEB1-AS1表達(dá)量顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織，達(dá)1.99倍(Mean±SD， 0.006 0±0.020 0 vs 0.003 0±0.014 1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)，見圖1。

圖1 lnc RNA ZEB1-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)

2.2 lnc RNA ZEB1-AS1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者臨床特征間的關(guān)系 lnc RNA ZEB1-AS1高表達(dá)與低表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤臨床分期(χ2=14.293，P=0.001)、是否化療(χ2=6.049，P=0.019)、是否原位癌(χ2=8.245，P=0.041)、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=10.427，P=0.005)、是否遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(χ2=20.229，P<0.001)以及HPV陰陽性(χ2=12.710，P=0.001)之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 lnc RNA ZEB1-AS1高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者生存期縮短相關(guān) lnc RNA ZEB1-AS1低表達(dá)組中位生存時(shí)間為35.0個(gè)月，高表達(dá)組中位生存時(shí)間為19.6個(gè)月，組間總生存率(overall survival，OS)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，lnc RNA ZEB1-AS1高表達(dá)組總體生存率明顯低于lnc RNA ZEB1-AS1低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.33，P=0.002 3)，見圖2。

表1 lnc RNA ZEB1-AS1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌臨床特征之間的關(guān)系[n(%)]

圖2 lnc RNA ZEB1-AS1縮短子宮內(nèi)膜癌患者生存期

2.4 過表達(dá)lnc RNA ZEB1-AS1促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖 當(dāng)細(xì)胞增殖48 h后，過表達(dá)lnc RNA ZEB1-AS1組細(xì)胞增殖速度明顯較對(duì)照組細(xì)胞快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

轉(zhuǎn)染0，24，48，72和96 h后進(jìn)行檢測(cè)分析，分別為過表達(dá)組vs干擾組(時(shí)間，P)：0.189±0.029 vs 0.187±0.00 9(0 h，P>0.05)，0.210±0.029 vs 0.200±0.016(24 h，P>0.05)，0.395±0.028 vs 0.337±0.040(48 h，P=0.044)，0.529±0.055 vs 0.398±0.061(72 h，P=0.013)和0.749±0.073 vs 0.568±0.035(96 h，P=0.002)，見圖3。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期前，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)間的差異愈明顯，說明lnc RNA ZEB1-AS1能夠明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。

注：*P<0.05，** P<0.01。

2.5 過表達(dá)lnc RNA ZEB1-AS1可降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度 過表達(dá)組對(duì)5-氟尿嘧啶的IC50為24.71±3.19 μmol/L，對(duì)照組為13.35±0.83 μmol/L(P<0.01)；過表達(dá)組對(duì)順鉑的IC50為43.33±6.45 μmol/L，對(duì)照組為12.21±1.21 μmol/L(P<0.01)。兩種化療藥物處理后細(xì)胞的存活曲線見圖4。兩種藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示過表達(dá)lnc RNA ZEB1-AS1后細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶及順鉑的敏感度降低，表明lnc RNA ZEB1-AS1高表達(dá)能使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶及順鉑藥物的耐藥性提高。

3討論子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，給女性健康帶來了嚴(yán)重傷害[3，14]。我國(guó)女性子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率僅次于宮頸癌[7-9]。子宮內(nèi)膜癌多發(fā)生在女性絕經(jīng)以后，另外我國(guó)人口老齡化速度加快、老齡化人口數(shù)量增加，導(dǎo)致我國(guó)子宮內(nèi)膜癌患者數(shù)持續(xù)增加[15-16]。目前子宮內(nèi)膜癌的治療方式主要以手術(shù)治療為主，放療和化療為輔，但化療耐藥比例逐漸升高[6，17]。研究顯示長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA， lnc RNA)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且有文獻(xiàn)報(bào)道lnc RNA廣泛參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥過程[18-19]。

lnc RNA是一類在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平具有調(diào)控作用的非編碼RNA，其在腫瘤耐藥中的作用逐漸受到重視[18，20-21]。研究報(bào)道[22]lnc RNA ZEB1-AS1在胃癌中表達(dá)上調(diào)，與胃癌不良預(yù)后相關(guān)；JIN等[23]研究顯示lnc RNA ZEB1-AS1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲；ZHANG等[24-25]研究顯示，在胃癌細(xì)胞中，敲低lnc RNA ZEB1-AS1將通過與miR-335-5p作用共同抑制胃癌細(xì)胞的增殖。另有研究表明lnc RNA ZEB1-AS1在多種腫瘤中發(fā)揮促癌基因作用[26-31]，但目前尚未見到其在子宮內(nèi)膜癌中的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示lnc RNA ZEB1-AS1在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，且其高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、化療相關(guān)，同時(shí)證實(shí)過表達(dá)lnc RNA ZEB1-AS1可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，降低其對(duì)順鉑、5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感度，表明lnc RNA ZEB1-AS1在子宮內(nèi)膜癌患者化療耐藥過程中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)lnc RNA ZEB1-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等過程相關(guān)，但本研究尚未進(jìn)行其具體分子機(jī)制的深入研究，仍需后續(xù)研究進(jìn)行報(bào)道。