系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7和miR-21的表達(dá)及意義

聶 萃 劉莉莎 周 燕

(重慶市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶400014)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是免疫調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂的自身免疫性疾病，并以產(chǎn)生自身抗體及免疫復(fù)合物為主要特征[1]。目前SLE發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，以往研究認(rèn)為，患者免疫系統(tǒng)中自身抗原失去耐受主要是T細(xì)胞與CD4+輔助T淋巴細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的異常活化導(dǎo)致，使機(jī)體免疫紊亂從而啟動(dòng)或持續(xù)自身免疫性疾病[2]。相關(guān)研究表明組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)在細(xì)胞異常狀態(tài)下活性增強(qiáng)并破壞乙酰化與去乙?；钠胶鉅顟B(tài)，并可參與機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過(guò)程[3]。隨著對(duì)SLE發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)微小RNAs(micro RNAs，miRNAs)作為一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA分子可在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究報(bào)道指出miR-21可通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而參與固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)過(guò)程，并可在多種自身免疫性疾病中異常表達(dá)[4]。但關(guān)于HDACs、miR-21與SLE間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究主要分析SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7和miR-21的表達(dá)水平及臨床意義，為進(jìn)一步揭示SLE發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年10月至2017年5月間我院收治的85例SLE患者為SLE組，且均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)修訂的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，其中男22例，女63例，年齡為16～40歲，平均(25.32±9.37)歲。計(jì)算SLE活動(dòng)指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)并對(duì)SLE組患者進(jìn)行活動(dòng)性評(píng)估，將SLEDAI評(píng)分>10作為活動(dòng)組(52例)，SLEDAI評(píng)分≤10作為穩(wěn)定組(33例)[6]。另選取同期于我院進(jìn)行體檢的37例健康志愿者為對(duì)照組，其中男13例，女24例，年齡為年齡為20～36歲，平均(26.24±7.34)歲。兩組臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn):①近期未服用相關(guān)治療藥物；②未患有其他自身免疫性疾病者；③臨床資料完整者；④患者與健康志愿者知情且均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有嚴(yán)重糖尿病疾病；②合并其他惡性腫瘤患者；③心腦血管疾病患者；④妊娠期婦女；⑤精神疾病者。PBS緩沖液購(gòu)自Hyclone公司，RLT Buffer 裂解液購(gòu)自上海易利生物科技有限公司， 總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，HDAC2、HDAC7等引物均由生工生物(上海)工程有限公司合成；熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司，Olympus BX2 生物熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1制備單核細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞 抽取兩組研究對(duì)象外周血10 ml并采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，將PBMC細(xì)胞懸液加入PBS洗滌并進(jìn)行離心，10 min后棄上清并按照約107個(gè)細(xì)胞加入80 μl緩沖液及20 μl MACS CD4磁珠的比例混勻，將其置于4℃孵育15 min并按照每107個(gè)細(xì)胞加入1～2 ml 緩沖液洗滌細(xì)胞，離心10 min后棄上清并加入500 μl緩沖液洗滌細(xì)胞。之后置LS分離柱于Midi MACS分選器中并用3 ml緩沖液濕潤(rùn)LS分離柱，將細(xì)胞懸液加入分離柱中并在運(yùn)作期間采用3 ml緩沖液濕潤(rùn)LS分離柱3次，30 min后將LS分離柱移出磁場(chǎng)并加入5 ml緩沖液將滯留于LS分離柱中的CD4+T細(xì)胞沖出，并將其置于-80℃凍存。

1.2.2qRT-PCR法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7與miR-21的表達(dá)水平 取出凍存的CD4+T細(xì)胞沉淀，解凍后加入RLT裂解液裂解細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 將CD4+T細(xì)胞cDNA稀釋5倍為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μl:SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 10.0 μl，上下游引物各1.0 μl，cDNA模板4.0 μl，ddH2O 4 μl。miR-21以U6為內(nèi)參基因，HDAC2、HDAC7均以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 15 min；94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算HDAC2、HDAC7與miR-21的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

Tab.1 qRT-PCR primer sequences

GeneForward primer 5′-3′Reverse primer 5′-3′HDAC2AGTCAAGGAGGCGGCAAAATGCGGATTCTATGAGGCTTCAHDAC7CTTCTCCACAAGGACAAGCTCCAGGGTTCTGTAGGβ-actinTGCTGTCCCTGTATGCCTCTTGATGTCACGCACGATTTmiR-21GTGCAGGGTCCGAGGTGCCGCTAGCTTATCAGACTGATGTU6ATTGGAACGATACAGAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG

1.2.3免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè) SLE患者于入院后與健康志愿者體檢時(shí)各抽取清晨空腹靜脈血3 ml，并將其分別置于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，離心后吸取上層血清進(jìn)行相關(guān)免疫指標(biāo)檢查。主要包括免疫球蛋白IgA、IgG與IgM以及補(bǔ)體C3與C4，采用免疫比濁法檢測(cè)免疫指標(biāo)并在熒光顯微鏡下觀察[7]。

2 結(jié)果

2.1一般資料比較 兩組免疫學(xué)指標(biāo)存在明顯差異，SLE組患者IgA、IgM、IgG水平均高于對(duì)照組，而C3、C4均低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組在年齡、性別等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表2。

2.2SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7與miR-21表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果 SLE患者活動(dòng)組HDAC2、HDAC7表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組與穩(wěn)定組(P<0.05)，而穩(wěn)定組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SLE患者活動(dòng)組miR-21表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組與穩(wěn)定組(P<0.05)，且穩(wěn)定組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表3。

ProjectControl group(n=37)SLE group(n=85)χ2/tPAge26.24±7.3425.32±9.370.5300.597Gender(Male/Female)13/2422/631.0790.299IgA(mg/L)1.12±0.562.03±0.697.0680.000IgM(mg/L)1.09±0.522.84±1.238.3210.000IgG(mg/L)12.32±3.6124.21±4.2314.8910.000C3(mg/L)0.97±0.640.45±0.236.6020.000C4(mg/L)0.51±0.310.15±0.0210.7130.000

2.3HDAC2、HDAC7、miR-21表達(dá)水平與SLE患者免疫學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性 將SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7、miR-21表達(dá)水平與患者免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示HDAC2、HDAC7均與miR-21、IgA、IgM、IgG呈負(fù)相關(guān)，而均與C3、C4呈正相關(guān)；miR-21與IgA、IgM、IgG呈正相關(guān)，而與C3、C4呈負(fù)相關(guān)；IgA、IgM、IgG均與C3、C4呈負(fù)相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表4。

2.4ROC分析HDAC2、HDAC7與miR-21對(duì)SLE的診斷價(jià)值 結(jié)果顯示HDAC2的敏感度為92.94%，特異度為64.86%，截?cái)嘀禐?.66；HDAC7的敏感度為92.94%， 特異度為67.57%， 截?cái)嘀禐?.95；miR-21的敏感度為74.12%，特異度為75.68%，截?cái)嘀禐?.06，詳見(jiàn)圖1、表5。

GroupsnHDAC2HDAC7miR-21Control group370.89±0.151.18±0.231.00±0.12SLE group850.52±0.050.69±0.121.17±0.18Activity group520.55±0.081)2)0.58±0.111)2)1.22±0.211)2)Stable group330.88±0.241.08±0.201.05±0.26

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the stable group,2)P<0.05.

圖1 HDAC2、HDAC7與miR-21對(duì)SLE的ROC分析Fig.1 ROC analysis of HLE2,HDAC7 and miR-21 for SLE

表4 HDAC2、HDAC7和miR-21表達(dá)水平與SLE患者免疫學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性(r/p)

Tab.4 Correlation of HDAC2,HDAC7 and miR-21 mRNA expression with immunological parameters of patients with SLE(r/p)

IndexHDAC2HDAC7miR-21IgAIgMIgGC3HDAC70.519/0.000miR-21-0.321/0.003-0.493/0.000IgA-0.325/0.002-0.724/0.0000.472/0.000IgM-0.484/0.000-0.766/0.0000.523/0.0000.849/0.000IgG-0.450/0.000-0.629/0.0000.447/0.0000.609/0.0000.711/0.000C30.291/0.0070.606/0.000-0.407/0.000-0.737/0.000-0.702/0.000-0.701/0.000C40.346/0.0010.498/0.000-0.347/0.001-0.536/0.000-0.602/0.000-0.432/0.0000.462/0.000

表5 HDAC2、HDAC7與miR-21對(duì)SLE的ROC分析

Tab.5 ROC analysis of HLE2,HDAC7 and miR-21 for SLE

Detection IndicatorAUCStandard errorZ statistics95% confidence intervalPHDAC20.8480.0408.6390.772-0.906<0.000HDAC70.7950.0525.6630.712-0.863<0.000miR-210.7740.0456.1510.690-0.845<0.000

表6 影響SLE相關(guān)因素的Logistic分析

Tab.6 Logistic analysis of factors affecting SLE

Influencing factorβSEWaldPOR95%CIIgA0.4840.3581.8260.0341.6221.225-2.148IgM0.4410.3361.7230.0411.5541.137-2.125HDAC21.0500.4236.1650.0012.8582.032-4.021HDAC70.7450.3275.1950.0112.1071.687-2.632miR-210.7230.4083.1420.0232.0611.564-2.716

2.5SLE影響因素的Logistic分析 將影響SLE發(fā)生的相關(guān)因素進(jìn)行Logistic分析，結(jié)果顯示HDAC2、HDAC7、miR-21、IgA及IgM水平異常均為SLE發(fā)生的危險(xiǎn)因素，詳見(jiàn)表6。

3 討論

SLE是一類(lèi)由多因素引起機(jī)體免疫異常的自身免疫性疾病，同時(shí)可激活局部補(bǔ)體系統(tǒng)并導(dǎo)致局部組織的炎癥損傷[8]。其主要表現(xiàn)為大量自身抗體產(chǎn)生與免疫復(fù)合物的沉積，并可損傷腎臟、心臟等組織器官[9]。目前關(guān)于SLE發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，因而需尋找新方向進(jìn)一步探究其發(fā)病因素以控制病情發(fā)展。研究表明CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用可促進(jìn)體液免疫亢進(jìn)并產(chǎn)生自身抗體進(jìn)而參與SLE疾病發(fā)生過(guò)程[10]。隨著生物技術(shù)進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)HDACs可通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白與胞內(nèi)蛋白的乙酰化水平并改變細(xì)胞表型進(jìn)而參與機(jī)體免疫細(xì)胞分化及免疫反應(yīng)過(guò)程[11]。相關(guān)研究報(bào)道指出miR-21可通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3進(jìn)而參與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化及發(fā)育并可影響獲得性免疫細(xì)胞的功能[12]。CD4+T細(xì)胞HDACs與miR-21在SLE發(fā)生過(guò)程中是否發(fā)揮相似功能尚不明確。因此，本研究旨在探討SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7與miR-21的表達(dá)特點(diǎn)及其與患者臨床免疫學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。

HDACs可分為4大類(lèi)與18個(gè)亞型，HDAC2屬于HDACⅠ類(lèi)亞型，研究表明HDACⅠ可通過(guò)降低腎臟血管系膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)生成從而改善腎臟功能最終緩解狼瘡腎炎[13]。研究發(fā)現(xiàn)有害顆粒的應(yīng)激作用可降低HDAC2活性，HDAC2可產(chǎn)生白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子-α且均為炎性反應(yīng)的代表性標(biāo)志物，同時(shí)可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)[14]。HDACⅡ型蛋白酶分子位于細(xì)胞質(zhì)并可在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核間出入，HDAC7屬于HDACⅡ亞型且在癌細(xì)胞中高表達(dá)，相關(guān)研究表明HDAC7在急性淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓中表達(dá)水平與疾病發(fā)生有關(guān)，且HDAC7表達(dá)水平越低疾病進(jìn)展越快[15]。研究表明HDAC7可影響p21等細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)，而凋亡細(xì)胞與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[16，17]。關(guān)于HDAC2、HDAC7在SLE發(fā)病過(guò)程中的相關(guān)研究較少，因此本研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)SLE患者與健康志愿者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7表達(dá)水平，結(jié)果顯示SLE組HDAC2、HDAC7表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，其中SLE活動(dòng)組中兩者表達(dá)水平顯著低于穩(wěn)定組與對(duì)照組，說(shuō)明SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7表達(dá)水平顯著降低，且其表達(dá)水平降低程度與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。分析其原因可能為SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7表達(dá)降低誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡并通過(guò)凋亡途徑進(jìn)而導(dǎo)致抗原提呈細(xì)胞提呈至反應(yīng)性T細(xì)胞引起自身反應(yīng)，最終導(dǎo)致SLE的發(fā)生。本研究結(jié)果檢測(cè)并觀察SLE患者免疫指標(biāo)表達(dá)，結(jié)果顯示IgA、IgM、IgG水平顯著升高，而C3、C4顯著降低，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HDAC2、HDAC7均與miR-21、IgA、IgM、IgG呈顯著負(fù)相關(guān)，而均與C3、C4呈顯著正相關(guān)，且研究報(bào)道指出IgA、IgM等免疫學(xué)指標(biāo)用于鑒別SLE并可反映疾病嚴(yán)重程度[18]。提示SLE發(fā)病時(shí)外周血CD4+T細(xì)胞等發(fā)生作用活化T細(xì)胞并釋放大量細(xì)胞因子而降低HDAC2、HDAC7表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)展。本研究采用ROC法分析HDAC2、HDAC7對(duì)SLE的臨床診斷價(jià)值，結(jié)果顯示HDAC2與HDAC7均具有較高的靈敏度與特異度，推測(cè)HDAC2與HDAC7可作為臨床早期診斷SLE的重要指標(biāo)。

miR-21位于人類(lèi)17q23.2染色體，研究表明miR-21可調(diào)控程序性死亡分子4、轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子3等轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)而參與機(jī)體免疫細(xì)胞的凋亡、分化及生成等過(guò)程[19]。miR-21在銀屑病病灶的上皮細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，將其轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞后導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞凋亡并參與銀屑病發(fā)生過(guò)程[20]。相關(guān)研究表明潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)miR-21表達(dá)水平顯著升高，miR-21可能通過(guò)Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)途徑影響T細(xì)胞的分化及功能進(jìn)而參與腸內(nèi)炎癥及免疫應(yīng)答過(guò)程[21]。與此相似，本研究結(jié)果顯示SLE活動(dòng)組miR-21表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組與穩(wěn)定組，且穩(wěn)定組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SLE患者miR-21呈高表達(dá)且參與疾病發(fā)生過(guò)程。本研究將miR-21表達(dá)水平與患者免疫血清指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miR-21與IgA、IgM、IgG呈顯著正相關(guān)，而均與C3、C4呈顯著負(fù)相關(guān)，提示miR-21表達(dá)水平升高導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受功能下降并產(chǎn)生大量自身抗體進(jìn)而加快SLE進(jìn)展。ROC分析結(jié)果顯示miR-21的敏感度為74.12%，特異度為75.68%，截?cái)嘀禐?.06，說(shuō)明檢測(cè)SLE患者miR-21表達(dá)水平高于1.06時(shí)可判斷疾病是否已發(fā)生。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)HDAC2、HDAC7均與miR-21呈顯著負(fù)相關(guān)，且Logistic回歸分析顯示HDAC2、HDAC7、miR-21、IgA及IgM水平異常均為SLE發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果揭示SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7及miR-21表達(dá)水平異常與疾病活動(dòng)程度有關(guān)，且均可導(dǎo)致疾病的惡性發(fā)展。

綜上所述，SLE患者CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7表達(dá)水平顯著降低，而miR-21表達(dá)水平顯著升高，HDAC2、HDAC7均與miR-21呈負(fù)相關(guān)且均可參與SLE發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程，檢測(cè)CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7及miR-21表達(dá)水平有助于臨床早期診斷SLE及評(píng)估病情進(jìn)展。本研究存在不足之處，關(guān)于HDAC2、HDAC7與miR-21在SLE發(fā)病過(guò)程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。