臭牡丹提取物體外抑菌及免疫毒理學(xué)研究①

張蜀艷 蒲建萍 李 政 張良璽

(成都工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，成都610051)

臭牡丹(Clerodendrum bungei steud，CBS)為雙子葉馬鞭草科大青屬植物,以根及葉入藥。夏季采葉，秋季采根,鮮用或曬干備用。性平，味甘、苦。歸經(jīng)入肝、脾經(jīng)。具有解痙、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗炎、抗?jié)?、抗菌及解熱的作用，著名的云南蛇藥中即含有很大比例的“臭牡丹”?/p>

CBS始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在民間具有廣泛的使用記載，在《本經(jīng)》《別錄》《藥性論》《日華子本草》《開寶本草》《滇南本草》中記載了具有行瘀、止痛、涼血、消腫的作用；在《植物名實(shí)圖考》《草木便方》《分類草藥性》《天寶本草》《貴州民間方藥集》《四川中藥志》《陜西中草藥》載有行氣健脾、祛風(fēng)平肝、消腫解毒的功效；在《滇南本草》《中藥形性經(jīng)驗(yàn)鑒別法》《云南中草藥選》記載了具有祛風(fēng)、截瘧、行氣、利水的作用；在《新疆中草藥手冊(cè)》《陜西中草藥》《陜甘寧青中草藥選》具有宣肺氣、祛風(fēng)濕、消腫毒的作用；在《別錄》《日華子本草》《長(zhǎng)沙藥解》《分類草藥性》《貴州民間方藥集》《四川中藥志》《上海常用中草藥》載有祛風(fēng)除濕、活血散瘀的作用；在《千金方》《梅師集驗(yàn)方》《四川中藥志》《云南中草藥選》《泉州本草》《江西民間草藥》《浙江民間草藥》《嶺南采藥錄》《南寧市藥物志》《廣東中藥》《廣西中草藥》載有消腫解毒、祛風(fēng)止癢、治療黃疸的作用。

民間用法中發(fā)現(xiàn)CBS具有一定的抗菌性和提高人體免疫功能的功效,為了科學(xué)證明此結(jié)論,分別對(duì)CBS提取物做了體外抑菌實(shí)驗(yàn)和免疫毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)如下。

1 材料與方法

1.1材料 致病大腸桿菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、酵母菌[CMCC(B)98007]、傷寒桿菌[CMCC(B)50071]、副傷寒甲桿菌[CMCC(B)50093]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]均由四川省藥品檢驗(yàn)所提供。真菌培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基均由四川省藥品檢驗(yàn)所提供。高速組織勻漿機(jī)、燒杯、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱、吸量管等為成都工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生化實(shí)訓(xùn)室提供。地塞米松(Dexamethasone，DXMS)(江蘇恒瑞醫(yī)藥)，5%雞紅細(xì)胞(Chicken erythrocyte,CRBC)、邁格染料、甲醇、吉氏染粉、甘油、磷酸緩沖液(廈門海標(biāo)科技有限公司)，生理鹽水(江西省創(chuàng)欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，丙酮-甲醇液、EDTA-Na2、CD3+-FITC Hamster anti-mouse、CD4+-PErat anti-mouse、CD8+-PerCP Rat anti-mouse(美國(guó)BD公司)。健康小白鼠90只，體重(20±2)g，清潔級(jí)雌雄各半(成都通德藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。云芝多糖(Coriolus versicolor polysaccharide,CVP,西安艾諾醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(上海三騰儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特)；高速離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司)；倒置高倍顯微鏡(賽默飛世爾科技有限公司)；超靜無(wú)菌工作臺(tái)(山東博科科學(xué)儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1CBS提取物制備 樣品1：新鮮CBS全株(葉、莖、根)洗凈，絞碎取汁，混勻后超真空蒸餾，滅菌處理。樣品2：新鮮CBS全株(葉、莖、根)洗凈絞碎，用95%乙醇浸提，回收乙醇后真空蒸餾，滅菌處理。樣品3：新鮮CBS全株(葉、莖、根)洗凈，用100℃水、分3次煎煮后，乙醇沉淀，超真空蒸餾得凍干品，滅菌處理。CBS提取物:樣品3經(jīng)過(guò)Sevage法除蛋白和透析得到分子量在8 kD以上的物質(zhì)(本實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2.2制備細(xì)菌液[1-3]本實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。分別從致病大腸桿菌、酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌的菌種斜面沾取少量菌苔接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，作為原菌液；白色念珠菌真菌瓊脂斜面培養(yǎng)物挑取少量菌苔接種到真菌培養(yǎng)基中于20～25℃培養(yǎng)24 h后作為原菌液。分別用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，使每1 ml中活菌數(shù)約1 000個(gè)，作為實(shí)驗(yàn)菌液。

1.2.3制備供試液及實(shí)驗(yàn)過(guò)程[4-6]CBS提取物用營(yíng)養(yǎng)肉湯(白色念珠菌用真菌培養(yǎng)基)以對(duì)倍稀釋法對(duì)致病大腸桿菌、酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌供試液進(jìn)行打碎攪勻逐管稀釋，使供試液濃度在每管中呈對(duì)倍遞減。制成每組濃度依次為500、250、125、62.5、31.2、15.6 mg/ml的供試液若干組。于每組供試液的抑菌實(shí)驗(yàn)管中,分別加入相應(yīng)已稀釋好的實(shí)驗(yàn)菌液0.1 ml。以無(wú)菌水作空白對(duì)照，同時(shí)將陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株加入樣品中，和樣品一起培養(yǎng)，作為陰性對(duì)照。然后置(36±1)℃培養(yǎng)24 h取出后,對(duì)各實(shí)驗(yàn)管樣本劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，再置37℃培養(yǎng)24 h(白色念球菌置20～25℃后劃線于真菌瓊脂培養(yǎng)基上，再置20～25℃培養(yǎng)24 h)，觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。陰性對(duì)照不長(zhǎng)菌，空白對(duì)照長(zhǎng)菌則實(shí)驗(yàn)方法成立。

1.2.4小鼠分組及處理[7-9]小鼠按表1進(jìn)行分組，按表1劑量腹腔注射生理鹽水(或CVP陽(yáng)性組或CBS)連續(xù)7 d后,注射DXMS連續(xù)7 d。

1.2.5巨噬細(xì)胞功能和免疫器官指數(shù)檢測(cè) 小鼠稱重，腹注CRBC，8 h后處死，腹注PBS，輕揉腹部，取腹腔液體0.5 ml，載玻片(37℃孵育30 min)，固定 5 min(丙酮∶甲醇=1∶1)，吉姆薩染色。每張涂片計(jì)數(shù)200 個(gè)巨噬細(xì)胞，按公式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)：吞噬率%=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞數(shù))×100%；吞噬指數(shù)=(被吞噬雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞數(shù))/2；另取各組小鼠脾和胸腺稱重，按以下公式計(jì)算:脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)，胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)。

1.2.6外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 小鼠腹腔注射生理鹽水(或CVP或CBS)連續(xù)7 d，腹腔注射DXMS連續(xù)7 d，取眼球血0.5 ml，加入4%EDTA-Na2，取100 μl分別加CD3+、CD4+、CD8+抗體各5 μl，4℃避光30 min，各管加溶血素1 ml，避光10 min，PBS 1 ml，離心5 min(1 000 r/min)，將沉淀用 2 ml PBS洗滌,棄上清液,將沉淀用500 μl PBS重懸后上流式細(xì)胞儀分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS Statistics軟件，方差分析組間差異，變量在各組的均值與總均值之偏差平方和的總和，記作SSb，組間自由度dfb，再進(jìn)行組間比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CBS提取物外用抑菌情況 表2表明，CBS的水和乙醇提取物對(duì)酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和金黃色葡萄球菌抑制性強(qiáng)，對(duì)致病大腸桿菌和白色念球菌抑制性也較強(qiáng)，并且濃度越大抑制性越強(qiáng)，其中水提物的抑菌性優(yōu)于乙醇提取物，再次證實(shí)了傳統(tǒng)用藥方法的合理性。當(dāng)CBS水提物在125 g/L時(shí)，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌均有理想的抑制作用，其中在外觀上樣品3具有明顯的優(yōu)勢(shì)，所以在CBS免疫毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中均采用樣品3作為供試品。

表1 實(shí)驗(yàn)用小鼠分組及腹腔注射劑量

Tab.1 Grouping and intraperitoneal injection dose of experimental mice

Groups(n=15)Control(ml)DXMS(ml)DXMS+CVP(ml)DXMS+CBSHigh dose(ml)DXMS+CBSMiddle dose(ml)DXMS+CBSLow dose(ml)Normal saline0.20.20.00.00.00.0CVP(20 g/L)0.00.00.20.00.00.0CBS(20 g/L)0.00.00.00.20.00.0CBS(10 g/L)0.00.00.00.00.20.0CBS(5 g/L)0.00.00.00.00.00.2DXMS(mg/kg)0.0100100100100100

表2 臭牡丹提取物外用抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Experimental results of external application of extract from CBS

ConcentrationPathogenic Escherichia coliYeastSalmonella typhiParatyphoid BacillusStaphylococcus aureusCandida abicans500(mg/ml)Sample 1------Sample 2- -----Sample 3- -----250(mg/ml)Sample 1- -----Sample 2- -----Sample 3- -----125(mg/ml)Sample 1- -----Sample 2- ----+Sample 3- -----62.5(mg/ml)Sample 1- ---- +Sample 2 + ---- +Sample 3- ---- +31.2(mg/ml)Sample 1 + ---- +Sample 2 + + + ++ +Sample 3 + ---- +15.6(mg/ml)Sample 1 + + + ++ +Sample 2 + + + ++ +Sample 3 + + + ++ +

Note：+.Growth of bacteria;-.No growth of bacteria.

GroupsPhagocytosis rate(%)Phagocytosis indexSpleen indexThymus indexControl36.5±3.71 0.265±0.025.65±0.643.67±0.54DXMS19.90±3.341)0.157±0.021)2.08±0.241)0.92±0.281)DXMS+CVP23.98±2.602)0.179±0.032)3.74±0.363)1.47±0.323)DXMS+CBS(20 g/L)28.78±4.304)0.245±0.025)4.35±0.655)1.84±0.435)DXMS+CBS(10 g/L)23.77±4.560.199±0.04 3.92±0.521.53±0.202)DXMS+CBS(5 g/L)21.17±4.67 0.185±0.023.33±0.531.44±0.28

Note：1)P<0.01 vs control;2)P< 0.05，3)P<0.01 vs DXMS;4)P<0.05，5)P<0.01 vs DXMS+CVP.

GroupsCD3+T(%)CD4+T(%)CD8+T(%)CD4+CD8+Control76.05±4.91 39.51±3.8135.65±3.541.11±0.19DXMS93.19±4.741)77.03±6.211)19.78±1.431)3.89±0.791)DXMS+CVP96.10±4.2376.65±6.16 20.24±1.953.79±0.67DXMS+CBS(20 g/L)99.74±2.273)72.99±5.2331.81±4.943)5)2.29±0.593)5)DXMS+CBS(10 g/L)98.70±1.963)78.59±6.2722.25±1.384)3.53±0.532)DXMS+CBS(5 g/L)96.08±4.1679.43±3.5321.50±2.193.69±0.82

Note：1)P<0.01 vs control;2)P< 0.05，3)P<0.01 vs DXMS;4)P<0.05，5)P<0.01 vs DXMS+CVP.

2.2CBS對(duì)免疫抑制模型腹腔巨噬細(xì)胞功能和免疫器官指數(shù)的影響 相比于陽(yáng)性組，高劑量CBS能使免疫抑制小鼠的吞噬率、吞噬指數(shù)明顯提高(P<0.05或P<0.01)。相比于模型組，陽(yáng)性組的CVP與中、高劑量的CBS提取物均能明顯提高吞噬率和吞噬指數(shù)(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯降低(P<0.01)，其中巨噬細(xì)胞吞噬率下降45.5%，吞噬指數(shù)下降40.8%，脾臟和胸腺指數(shù)則分別下降63.2% 和74.9%。模型組脾臟及胸腺指數(shù)均小于空白組(P<0.01)。CVP與各劑量CBS均能提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) (P<0.01或P<0.05)；陽(yáng)性組與高劑量CBS 組相比差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

2.3CBS對(duì)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響 與空白組比較，DXMS、CVP、CBS均能明顯升高CD3+T(P<0.01)、CD4+T(P<0.01)淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率和CD4+/CD8+T細(xì)胞數(shù)量比值，降低CD8+T淋巴細(xì)胞的百分率(P<0.01),并隨著CBS濃度增大，CD3+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均有增大的趨勢(shì)，而CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量則減少。

與陽(yáng)性組比較，高濃度CBS能較明顯提高CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的陽(yáng)性率,降低CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量陽(yáng)性率和CD4+/CD8+的比值,中、低濃度對(duì)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量陽(yáng)性率和CD4+/CD8+的比值改變不大,見表4。

3 討論

CBS水提物對(duì)酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌、致病大腸桿菌、白色念球菌6種細(xì)菌抑制性優(yōu)于乙醇提取物，且外觀性較好，CBS水提物濃度大于等于125 g/L時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌均有理想抑制作用。溶劑便宜易得，有較高的開發(fā)和利用價(jià)值，在以后的研究中對(duì)實(shí)驗(yàn)條件可深入研究，增加提取率。

小鼠免疫抑制模型用地塞米松來(lái)制作。本研究通過(guò)連續(xù)7 d對(duì)小鼠腹腔注射100 mg/kg地塞米松造模，出現(xiàn)食少納呆、疲乏無(wú)力等表現(xiàn)，免疫器官萎縮明顯，腹腔吞噬指數(shù)和巨噬細(xì)胞吞噬率降低明顯，表明小鼠免疫功能明顯下降[10]。

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，主要是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行吞噬作用，激活淋巴球或其他免疫細(xì)胞，令其對(duì)病原體作出反應(yīng)。研究表明，CBS與CVP相比能明顯提高免疫抑制小鼠對(duì)CRBC的吞噬率與吞噬指數(shù)，對(duì)非特異免疫功能有明顯促進(jìn)作用[11]。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，有大量的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；胸腺為機(jī)體的重要免疫器官，是T淋巴細(xì)胞成熟分化的重要場(chǎng)所，與免疫緊密相關(guān)。DXMS使小鼠的免疫器官重量降低、脾淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著增加，CBS 能明顯拮抗DXMS的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)及重量，有明顯的保護(hù)作用[12,13]。

T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定是檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，T淋巴細(xì)胞(CD3+)主要由輔助性T細(xì)胞(CD4+)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)組成，CD4+T細(xì)胞具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能，去除受感染細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞分布在抑制性T淋巴細(xì)胞和殺傷性T淋巴細(xì)胞表面,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。注射DXMS的小鼠淋巴細(xì)胞總數(shù)降低、CD3+T細(xì)胞數(shù)量升高，提示DXMS可能對(duì)淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞具有更明顯的細(xì)胞毒作用；注射CBS和CVP的小鼠淋巴細(xì)胞總數(shù)升高的同時(shí)CD3+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯升高,提示CBS在促進(jìn)T細(xì)胞增殖的同時(shí)對(duì)B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞具有增殖作用；此外，評(píng)價(jià)機(jī)體免疫平衡的重要指標(biāo)CD4+/CD8+T細(xì)胞數(shù)量比值一般在1～2之間，高劑量CBS能通過(guò)升高CD8+T細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)降低CD4+T細(xì)胞數(shù)量，使免疫抑制小鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯降低并接近正常值，表明了CBS可改善DXMS引起的機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂，且效果優(yōu)于CVP。

以上結(jié)果提示，CBS 能對(duì)DXMS引起的免疫低下小鼠細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用，通過(guò)重建和維系免疫功能，有望開發(fā)成新的恢復(fù)和改善免疫功能的有效調(diào)節(jié)劑，針對(duì)艾滋病、紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)破壞的疑難疾病，本藥品可以通過(guò)重建和維持免疫功能，開發(fā)出有針對(duì)性獲得恢復(fù)或改善免疫功能的有效藥物，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究[14-16]。

CBS具有抑菌性和免疫調(diào)節(jié)功能，這兩大功能與免疫性疾病產(chǎn)生機(jī)理對(duì)比分析，我們推測(cè)CBS可以用來(lái)對(duì)抗免疫性病毒，一方面它能夠殺滅因病毒入侵人體而感染的各種病菌，同時(shí)它又能夠重建和維持人體的免疫功能。進(jìn)一步的研究如能大量獲取CBS的有效成分，開發(fā)出有針對(duì)性獲得恢復(fù)或改善免疫功能的有效藥物，在人類對(duì)抗免疫性病毒的進(jìn)程中將會(huì)提供有益的補(bǔ)充。