響應(yīng)曲面法優(yōu)選人參葛根煎膏醇沉工藝

叢 婧，王秀麗

（1.北京典奧中衛(wèi)醫(yī)藥科技有限公司，北京 100054； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488）

保健食品不以疾病治療為目的，可調(diào)節(jié)機(jī)體功能[1]，符合傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“未病先防”理念[2]，近年來得到了規(guī)范化發(fā)展。人參葛根煎膏是擬開發(fā)的一款以人參、葛根等為原料的保健食品制劑。產(chǎn)品水提液中含有淀粉等成分，濃縮成清膏放冷后易成糊狀，影響成品質(zhì)量，需對提取液進(jìn)行醇沉。為確保工藝的合理，需對醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)選。本試驗中以沉淀率和濃縮膏總皂苷含量為評價指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)選[3-4]?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

D100B型數(shù)顯定時恒流泵（上海青浦瀘西儀器廠）；DHG-9055A型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器廠）；DTG系列超聲波清洗機(jī)（鼎泰<湖北>生化科技設(shè)備有限公司）；SE402F型電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；MS204TS/00型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Q/IROE-07-201型微量移液器（1 000 μL，上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 試藥

無水乙醇（分析純，天津市北辰方正試劑廠，批號為20170503）；冰乙酸（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號為20170715）；Amberlite? XAD-2大孔樹脂(Ballancom chemical Co.)；中性氧化鋁（100 ～200 目，層析用 FCP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20170110）；人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量93.4%）；香蘭素（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號為20160326）；高氯酸（上海桃浦化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測定

試樣處理：取人參皂苷Re對照品0.010 1 g，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得每1 mL含人參皂苷Re 0.969 6 mg的人參皂苷Re對照品溶液。取香草醛0.5 g，精密稱定，加冰乙酸溶解并定容至10 mL，即得5%香草醛-冰乙酸溶液，使用前新制。

線性關(guān)系考察：精密吸取人參皂苷Re對照品溶液50，100，150，200，250μL，分別加入 5 支錐形瓶中，60℃熱風(fēng)揮干溶劑，用0.5 mL移液管各準(zhǔn)確加入新鮮制備的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60℃恒溫加熱10 min，取出，流水冷卻2 min，準(zhǔn)確加入冰醋酸5 mL，充分搖勻，隨行試劑空白，按紫外分光光度法，在560 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、人參皂苷Re進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3.534 4X-0.005 4，R2=0.999 3(n=5)。結(jié)果表明，人參皂苷Re進(jìn)樣量在58.17～407.20 μg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)選試驗

水提醇沉是中藥制藥重要除雜方法，醇沉的醇體積分?jǐn)?shù)多選50% ～70%[5-6]，且為主要影響因素，醇沉?xí)r間多選1 d，因隨時間的延長，變化趨于平穩(wěn)，故本試驗設(shè)計醇沉?xí)r間為20～28 h[7-9]。采用響應(yīng)曲面優(yōu)選設(shè)計（JMP軟件），以醇沉濃度和時間為影響因素，確定水提醇沉工藝最佳區(qū)域。因素設(shè)計見表1，試驗數(shù)據(jù)見表2。

表1 試驗設(shè)計因素表

表2 試驗數(shù)據(jù)表

取相對密度為1.10～1.15（60℃）的煎膏水提濃縮液。13份樣品做醇沉試驗，按表1安排響應(yīng)曲面試驗，各取80 mL樣品，在一定量程的量筒中醇沉，達(dá)到規(guī)定的醇沉體積分?jǐn)?shù)和時間后，記錄醇沉后上清液體積(V1)，并吸取一定體積(V2)的上清液，減壓濃縮（60～70℃，-0.06～0.08 MPa）去醇，放置表面皿中預(yù)凍，冷凍真空干燥12 h后稱質(zhì)量為m1，80 mL濃縮液的固形物總質(zhì)量為m0，折算出沉淀量，按下列公式計算沉淀率。醇沉后將上清液收集濃縮至相對密度為1.20～1.30（60℃測），以此樣品測定總皂苷含量。

2.3 數(shù)據(jù)分析

方差分析：結(jié)果見表3和表4。

表3 沉淀率方差分析結(jié)果

表4 總皂苷含量方差分析結(jié)果

模型適用性分析：模型擬合是否合適，需依據(jù)預(yù)測值與實際值的擬合情況判斷。由圖1可見，代表實測值的黑點均布于預(yù)測值兩側(cè)，P<0.05表示模型擬合合適。

工藝優(yōu)選結(jié)果：由圖2 C響應(yīng)曲面等高線圖的白色區(qū)域給出的為最佳操作區(qū)域可見，醇沉體積分?jǐn)?shù)為58%～65%，醇沉?xí)r間為 22～28 h，總皂苷含量為3.75% ～4.05%，雜質(zhì)去除率為76% ～78%。經(jīng)計算，最佳操作點條件為醇沉體積分?jǐn)?shù)60%，醇沉?xí)r間28 h，總皂苷含量最大值為4.08%，沉淀率最大值為77.58%?？紤]到實際生產(chǎn)排班習(xí)慣，在以后的生產(chǎn)中擬取60%乙醇醇沉24 h為操作條件，預(yù)測總皂苷含量為3.80%，沉淀率為76.88%。

2.4 工藝驗證

按優(yōu)選工藝條件，重復(fù)操作3次，取平均值，并進(jìn)行工藝驗證。結(jié)果見表5?？梢姡に嚪€(wěn)定性和重復(fù)性均良好。

3 討論

中藥水提液精制工藝中醇沉法較常用，可澄清提取液、減少服藥量和去除雜質(zhì)等，操作過程簡單、溶劑安全性高、除雜效果好[10]。醇沉工藝選用適宜體積分?jǐn)?shù)的乙醇，可有效沉降糊化淀粉、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。多選用50% ～60%乙醇去除蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽類雜質(zhì)[11]。乙醇體積分?jǐn)?shù)是醇沉的主要影響因素[7]，合理加以控制，系統(tǒng)地對醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)選，可避免制劑中有效成分流失。醇沉體積分?jǐn)?shù)對沉淀率和浸膏中總皂苷含量影響較大，隨前者增加，后兩者均先增大后減小，這與總皂苷的溶解度和雜質(zhì)蛋白質(zhì)與淀粉的溶解度有關(guān)，醇沉?xí)r間因素的影響則相對較小。

圖1 預(yù)測值區(qū)間散點圖

圖2 響應(yīng)曲面和優(yōu)選等高線圖

表5 工藝驗證試驗結(jié)果（%）

目前中藥類保健食品中提取、醇沉工藝研究多選用單因素試驗、正交設(shè)計試驗對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選。其中，單因素試驗次數(shù)多，并未考慮因素之間的交互作用，使得其成本較高；正交設(shè)計試驗應(yīng)用較普遍，可得出各因素間的交互作用及可能的影響趨勢。響應(yīng)曲面法[12]是優(yōu)化隨機(jī)過程的統(tǒng)計學(xué)方法，建立連續(xù)變量曲面模型，尋找試驗指標(biāo)與各因子間的定量規(guī)律，找出各因子水平的最佳組合。其在多元線性回歸的基礎(chǔ)上主動收集數(shù)據(jù)，以獲得具有較好性質(zhì)的回歸方程。建立的多維空間曲面較接近實際情況，近年來研究應(yīng)用實例較多，所需要的試驗組數(shù)相對較少，優(yōu)化工藝效果較優(yōu)[13]，且不同于正交試驗，只能在設(shè)定的條件中選擇。

本研究中選取的產(chǎn)品是以人參、葛根等為主要原料制成煎膏，以水提醇沉工藝成型，為確保產(chǎn)品的質(zhì)量，綜合考慮產(chǎn)品標(biāo)志性成分總皂苷含量、沉淀率等因素，利用JMP軟件可視化能力強(qiáng)的特點，研究水提醇沉工藝最佳條件，結(jié)合模型擬合，確定以60%乙醇醇沉24 h，制得的煎膏符合最終產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。