Klenow(exo-)蛋白的制備及其在RAA檢測體系中的應用研究

付玉和, 孫文麗, 黃震巨, 程 奇

1.中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081;2.杭州眾測生物科技有限公司, 杭州 310052

重組酶介導鏈替換核酸擴增技術(recombinase-aid amplification,RAA)，是一種利用體內擴增技術實現(xiàn)在體外進行核酸快速擴增的新型擴增技術，即利用從細菌或真菌中獲得的重組酶，在常溫下形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補序列時，在單鏈DNA結合蛋白的幫助下，打開模板 DNA的雙鏈結構，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，擴增產物以指數(shù)級增長[1,2]。RAA技術能在常溫下以較短的時間實現(xiàn)核酸快速擴增，擴增產物可以通過瓊脂糖凝膠電泳或實時熒光檢測實現(xiàn)目的基因的快速檢測。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是指在基因組上單個核苷酸的變異形成的一種分子遺傳標記[3]，在分子遺傳學和各種遺傳疾病的診斷和治療中扮演著重要角色。目前普遍應用于SNP檢測的技術,如變性梯度凝膠電泳、直接測序、DNA芯片技術等,存在著技術復雜、應用成本高等缺點[4]。因此研究開發(fā)潛在的具有大規(guī)模商業(yè)化用途的檢測方法一直是研究的熱點。通過擴增來實現(xiàn)目的基因的檢測作為一種應用技術在過去幾十年間迅猛發(fā)展，一直是檢測的主流方法。利用3′→5′外切酶活性的具有校正功能的高保真酶實現(xiàn)SNP檢測的研究也一直在進行中[5]。那么更進一步突變高保真聚合酶的3′→5′外切酶活性利用高保真聚合酶在擴增過程中的聚合反應非成熟性終止能力是否具有潛在的SNP檢測能力尚未見研究報道。

Klenow(exo-)是一種來源于大腸桿菌的聚合酶，該酶采用突變方式去除了校正核酸酶活性(3′→5′)和(5′→3′)缺口平移酶活性[6]，具有鏈置換活性和較高的特異性，具有應用于SNP檢測的潛能[7]。因此本文在前人研究的基礎上開發(fā)了一種新的Klenow(exo-)蛋白制備方案并結合恒溫擴增技術中的RAA技術對其在SNP檢測中的潛在應用進行了嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株：BL21、DH5α、E.coliRosetta (DE3)本實驗室保存。LB 培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L胰蛋白胨，pH 7.0。

1.2 試劑

KOD高保真聚合酶購自TOYOBO公司；TaqDNA聚合酶、限制性內切酶、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒和PCR產物純化試劑盒均購自上海生工生物公司；無縫克隆試劑盒購自北京全式金有限公司；層析分離介質Ni Sepharose 6 Fast Flow預裝柱，Heprine預裝柱購自GE公司；組織裂解液購自百代生物有限公司。

緩沖液配方：B: 30 mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)，40 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉；C: 30 mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)，100 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉；D：30 mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)，300 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉；E:20 mmol/L Tris,50 mmol/L氯化鉀，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA；F：20 mmol/L Tris, 2 mol/L氯化鉀1 mmol/L DTT,1 mmol/L EDT。

1.3 目的片段的擴增

大腸桿菌基因組為模板分別用引物F1、R1和F2、R2(引物序列見表1，由擎科(杭州)生物公司合成)進行PCR擴增，擴增后目的片段進行膠回收。然后以回收的兩條目的片段等比例混合為模板，以F1和R2為上、下游引物進行Overlap PCR獲得所需的目的片段。反應體系均為25 μL，反應后產物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳后結果以膠回收試劑盒回收目的片段PCR產物。大片段擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 2 min，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。小片段擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 30 s，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。Overlap PCR擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 2 min，共32個循環(huán)；72℃延伸 10 min。

表1 本研究所用引物列表Table 1 Primer sequence used in the study.

1.4 重組表達質粒的構建及誘導表達

以質粒提取試劑盒提取pTrc99a質粒載體，然后以NcoⅠ、HindⅢ限制性內切酶雙酶切質粒載體和膠回收目的片段。酶切體系如下：質粒1 μg，限制性內切酶各1 μL，10×Buffer 2 μL， 補加去離子水至總體積20 μL。酶切后產物以純化試劑盒純化。將Klenow(exo-)目的基因片段和線性化后的質粒載體以2∶1的比例配制10 μL連接體系。連接反應條件為25℃連接3 h，質粒構建示意圖如圖1所示。

圖1 pTrc99a-Klenow(exo-)質粒構建示意圖Fig.1 Construction diagram of pTrc99a-Klenow(exo-) plasmid.

連接產物轉化大腸桿菌克隆菌株：連接反應結束后將連接產物加入100 μL感受態(tài)中，冰浴30 min后42℃熱激90 s，冰浴2 min，加入500 μL LB培養(yǎng)基。37℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)1 h取200 μL菌液涂布于含氨芐抗性的LB平板上,37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

挑取單克隆至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6左右。取1 μL菌液為模板以F1、R2為引物進行PCR鑒定，陽性克隆可見1 900 bp的條帶。并將陽性菌落送至杭州擎科生物科技有限公司測序，將測序正確無突變的陽性克隆菌株凍存并提取質粒。將提取的質粒轉化至大腸桿菌Rosetta (DE3)表達菌株。

挑取轉化后單菌落接種至5 mL，LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG于37℃誘導4 h ，收集少量菌體，超聲破碎菌體后離心分離上清液與沉淀，將破碎后的上清和沉淀加入適量Loading Buffer，沸水浴3～5 min后進行SDS-PAGE鑒定誘導表達結果。

1.5 陽性克隆菌的搖瓶發(fā)酵及Klenow(exo-)蛋白的純化

挑單克隆菌至100 mL LB培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)作為一級種子，然后將一級種子以2%的比例接種至6瓶600 mL的液體LB培養(yǎng)基中。37℃ 200 r/min 培養(yǎng)至OD600為 0.6時加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG，于37℃誘導4 h。

在4℃ 6 000 r/min條件下離心30 min,棄上清收集菌體。用破碎緩沖液[緩沖液A:30 mmol/L MPB(pH 7.4)，20 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉]重懸菌體。將重懸后的菌液以ATS高壓均質機(800 Mpa，4℃)破碎3次。打開離心機預冷后以4℃ 16 000 r/min 離心破碎液，上清用鎳柱做親和層析。分別用緩沖液B、C、D洗脫后將目的蛋白透析至緩沖液E中。

透析后以緩沖液E為平衡液，以緩沖液F為洗脫液線性洗脫。洗脫后目的蛋白再次透析至E緩沖液中。凍存至-80℃冰箱中待用。

1.6 Klenow(exo-)蛋白結合RAA體系對SNP檢測的應用

以Klenow(exo-)蛋白結合其他所需蛋白配制RAA反應體系，設計引物SalF、SalR、SalF(突)(表1)，質粒模板采用含沙門氏菌invA基因的質粒(南京金斯瑞合成)。按照RAA 50 μL擴增反應體系[2],最后加入100 mmol/L醋酸鎂激活反應。反應條件為：37℃，30 min，加入50 μL 酚-氯仿1∶1溶液結束反應,并以12 000 r/min離心5 min,離心后最上層上清為擴增產物。擴增后產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系

分別稱取30 mg的水牛肉和牦牛肉加入組織裂解液。12 000 r/min離心10 min取上清用水稀釋至10-1、10-2，分別檢測核酸濃度約為10 ng/μL、1 ng/μL，以此為模板，以線粒體Cytb基因為靶基因，根據(jù)水牛和牦牛序列的差異設計引物序列F、R(F引物與水牛靶序列匹配，與牦牛靶序列在3′端有兩個連續(xù)突變，R序列與水牛，牦牛靶序列均完全匹配，表1)。分別用Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系和PCR體系(TaqDNA聚合酶)進行檢測。

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的構建與鑒定

通過PCR方式引入突變位點，設計引物時使兩個片段帶有20 bp左右的同源重組區(qū)[7]，PCR擴增獲得大小分別約為1 800 bp、120 bp的目的蛋白條帶。通過Overlap PCR獲得大小約1 900 bp目的片段(圖2)，通過載體與目的片段雙酶切連接轉化后獲得含有目的片段的載體。陽性克隆片段提取質粒經雙酶切后明顯可見約1 900 bp目的蛋白條帶及4 000 bp線性化質粒條帶(圖3)，驗證后質粒進一步送測序驗證。測序后結果與預期的目的蛋白基因序列完全相符，說明獲得了正確的目的基因。

圖2 Overlap PCR獲得目的片段Fig.2 The desired segment obtained by Overlap PCR.注: 1～2: Overlap PCR結果， M:2 000 bp Marker

2.2 融合蛋白表達情況的分析及蛋白制備

SDS-PAGE結果表明工程菌在37℃經IPTG誘導4 h后，超聲破碎取上清及沉淀進行SDS-PAGE，在約65 kDa處有明顯的目的蛋白條帶與預期的Klenow(exo-)蛋白大小一致(圖4)。鎳柱親和層析后SDS-PAGE結果顯示，在65 kDa處40 mmol/L、100 mmol/L咪唑洗脫液中均有明顯的目的蛋白，其中100 mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白純度較高。可用于目的蛋白的進一步純化。通過GE公司預裝柱Heparine HP 除去部分目的蛋白中殘留的核酸并對目的蛋白進行進一步的精細純化。由結果可見經過肝素柱純化后目的蛋白純度有了明顯的提高，有利于后續(xù)的檢測反應，純化后目的蛋白如圖5所示。

圖3 重組質粒的雙酶切鑒定Fig.3 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid1:重組質粒雙酶切后; 2:重組質粒雙酶切前; M:2 000bp核酸Marker

圖4 工程菌株誘導表達檢測Fig.4 Expression detection of engineered strain induced.1:未誘導對照沉淀;2:未誘導對照上清;3:誘導1號菌沉淀;4:誘導2號菌上清;5:誘導2號菌沉淀;6:誘導1號菌上清;M:蛋白Marker.

2.3 檢測體系的配制及質粒檢測結果

用Klenow(exo-)配制 RAA體系后擴增結果顯示，在模板濃度為100 pg/μL以上時引物3′端發(fā)生突變后不能有效擴增目的片段，引物正常匹配時擴增效果良好，有明顯的擴增條帶出現(xiàn)。顯示了Klenow(exo-)酶對突變堿基較強的特異性。當模板濃度低于100 pg/μL突變和非突變引物均不能有效擴增目的片段(圖6和圖7)。由結果可知該體系在對于濃度高于100 pg/μL的核酸樣本時能明顯區(qū)分是否發(fā)生突變，在模板濃度較低的情況下效果不明顯，這可能是由反應體系本身的限制引起，尚需對反應體系本身做進一步優(yōu)化處理。

圖5 目的蛋白肝素柱純化Fig.5 Purification by Heparine.注：1～4：Heparine柱線性洗脫目的蛋白。

圖6 引物正常匹配擴增結果Fig.6 Amplification of primer normally matched.注:模板濃度為:1,2: 10 ng/μL; 3,4: 1 ng/μL; 5,6: 100 pg/μL; 7,8: 10 pg/μL; M:2 000 bp Marker。

圖7 引物3′ 端雙堿基突變后的擴增結果Fig.7 Amplification of primer 3′-terminal mutation.注:模板濃度為:1,2: 10 ng/μL; 3,4: 1 ng/μL; 5,6: 100 pg/μL; 7,8: 10 pg/μL; M:2 000 bp Marker。

2.4 實際樣本檢測結果

基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系與PCR分別檢測實際樣本結果如圖8和圖9所示。在實際樣本的檢測中發(fā)現(xiàn),在納克級別的模板濃度下基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系在遇到3′突變的情況下基于其聚合反應非成熟性終止能力無法進行有效的擴增，而PCR體系則能通過其3′→ 5′外切酶活性實現(xiàn)擴增反應的持續(xù)進行，無法停止反應從而導致該反應體系無法形成有效區(qū)分。結合該實驗結果可知應用Kenow(exo-)的RAA檢測體系具有單獨或聯(lián)合其他檢測技術來檢測SNP的潛在應用價值。同時我們也可以看到雖然結果符合預期，有部分非特異性條帶出現(xiàn)，說明蛋白的用量、反應時間等尚有提高的空間,需進一步優(yōu)化,也可考慮應用熒光技術來實現(xiàn)最終檢測結果的判讀提高準確度。

圖8 基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系擴增結果Fig.8 RAA amplification results based on Klenow(exo-) protein.注：1,2:水牛10 ng/μL模板; 3,4:牦牛10 ng/μL模板; 5,6:水牛1 ng/μL模板; 7,8：牦牛1 ng/μL模板; M:2 000 bp Marker.

圖9 PCR擴增結果Fig.9 PCR amplification results.注：1,2:牦牛10 ng/μL模板; 3,4:牦牛1 ng/μL模板; 5,6:水牛10 ng/μL模板; 7,8：水牛1 ng/μL模板; M:2 000 bp Marker

3 討論

隨著測序技術的不斷發(fā)展，人們對于單堿基多態(tài)性的重要性有了深入的了解，作為一種遺傳變異的分子標記，其對于遺傳病研究、藥物開發(fā)等醫(yī)藥治療領域及生物學、農學等基礎學科都有著廣泛的影響[8,9]。

利用高保真聚合酶來實現(xiàn)SNP檢測的想法由來已久，基于高保真聚合酶的錯配切除效應，研究人員提出了一些解決方案，其中最具典型意義的是單堿基敏感性分子復合開關技術[10]，然而該技術需要多輪巢式PCR進行結果對比[11]，過程較為繁瑣，限制了其大規(guī)模應用。高保真 DNA 聚合酶具有通過聚合反應非成熟性終止以維持成熟性終產物保真度的能力。尋找潛在的快捷檢測方法依舊是擺在我們面前的課題。利用去除外切酶活性的高保真聚合酶能否實現(xiàn)引物與模板不匹配的擴增反應的終止，一直是我們關注的另一個重要方面，也是實現(xiàn)高保真聚合酶直接檢測SNP的關鍵之處。Klenow片段是一種目前研究的比較透徹的具有3′→5′端外切酶活性的聚合酶[12]。Kelnow(exo-)聚合酶是在Klenow片段的基礎上對其活性部位進行突變來實現(xiàn)3′→5′端外切酶活性,去除其D355A、E357A。突變后聚合酶只具有極小的3′→5′端外切酶活性,約為(1.4±0.5)×10-5U[13,14],因此在3′端堿基發(fā)生突變后，不能有效的進行擴增使反應終止。利用這一原理結合重組酶介導鏈替換核酸擴增(RAA技術)可以對SNPs位點進行快速高效的鑒別。目前國內對Klenow(exo-)制備的報道中其基因序列基本都是對Klenow酶進行單個氨基酸的突變 ，這種方式使得Kelnow(exo-)聚合酶殘留的3′→5′端外切酶活性較高，降低了反應終止的可靠性，另外現(xiàn)有報道的純化方法也只是進行簡單的親和層析。這樣純化出來的蛋白純度較低，且會混有較高水平的核酸殘留，影響后續(xù)的恒溫擴增體系[15,16]。

通過Overlap獲得Klenow(exo-)基因并引入組氨酸標簽，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)可以獲得高純度的Klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中表達量較高，純化工藝簡單，生產成本極低。結合RAA快速擴增技術后能有效的對突變位點進行鑒別，從實驗結果來看無論在質粒檢測、還是實際樣本的檢測中均具有較好的特異性。然而由于目前暫時缺乏真實的臨床SNP樣本，盡管理論及類似實驗可行,其靈敏度仍需進一步提升。具體到真實的臨床樣本依然需要大量的實驗來驗證其是否有效和可靠[17]?？紤]到SNP快速檢測技術的臨床應用前景，任何希望能在該領域大展身手的技術必須兼?zhèn)淇焖俸透咄刻匦?。本技術結合熒光探針或側向流試紙條技術后有望只通過一臺便攜熒光檢測儀或一張檢測試紙條即可在常溫下20 min左右實現(xiàn)檢測，而且其反應體系本身又比較易于高通量化，因此其應用前景非常巨大[18,19]。因此，我們有理由相信圍繞Klenow(exo-)的RAA高靈敏度體系開發(fā)意義巨大且任重道遠。