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    殼聚糖薄膜培養(yǎng)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗炎基因表達(dá)的影響

    2019-08-13 09:26:30徐雄峰李華杰
    生物技術(shù)進(jìn)展 2019年4期
    關(guān)鍵詞:抗炎殼聚糖平板

    徐雄峰, 邱 波, 李華杰, 易 鵬

    武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨外科, 武漢430060

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以慢性關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和丟失為主,以及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)增生為主要病理特征的疾病,其治療仍是臨床尚未解決的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源于組織和器官,是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞,能夠分化為成骨[1]、軟骨[2]、肝[3]等。實(shí)驗(yàn)證實(shí),誘導(dǎo)后的MSCs能夠轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨,能治療實(shí)驗(yàn)性的OA[4]。目前MSCs在常規(guī)平板培養(yǎng)(two-dimensional culture,2D培養(yǎng))過程中發(fā)生衰老和向成骨細(xì)胞自主分化、增殖能力減退、抗炎能力降低,嚴(yán)重影響了MSCs的治療效果。

    殼聚糖是廣泛存在于大自然界中的甲殼素衍生物,具有無免疫原性、低毒性、高生物相容性的特點(diǎn),殼聚糖大分子和膠原大分子之間有很好的相容性,能夠發(fā)生相互交聯(lián)作用。殼聚糖薄膜(chitosan membrane,CM)上培養(yǎng)的MSCs的遷徙性和干性關(guān)鍵基因的表觀遺傳狀態(tài)的改變已經(jīng)被證實(shí),某些遷徙相關(guān)細(xì)胞表面受體的mRNA表達(dá)顯著增加[5],干性相關(guān)基因如Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表達(dá)水平顯著高于常規(guī)培養(yǎng)的MSCs[6]。這些結(jié)果提示殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs在維持其干性、歸巢能力等方面明顯優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)的MSCs,殼聚糖薄膜培養(yǎng)對(duì)MSCs的表觀遺傳狀態(tài)產(chǎn)生了影響。表觀遺傳狀態(tài)的變化可能影響其抗炎基因的表達(dá)和維持,并影響MSCs的抗炎特性。本文旨在探討殼聚糖薄膜培養(yǎng)對(duì)人臍帶 MSCs抗炎相關(guān)基因表達(dá)的影響,為進(jìn)一步探討CM培養(yǎng)的MSCs在OA軟骨修復(fù)中的作用奠定基礎(chǔ),為OA的治療提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 殼聚糖薄膜的制備

    制備殼聚糖薄膜的方法見李華杰等[5]的研究方法。

    1.2 原代MSCs 的培養(yǎng)

    獲得P1代MSCs作為種子細(xì)胞的方法見李華杰等[5]的研究方法。

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)

    實(shí)驗(yàn)組:將MSCs P1代細(xì)胞以3×105/孔接種于底部覆蓋CM的六孔板;對(duì)照組:MSCs P1代細(xì)胞以同樣密度接種于普通平板六孔板中。兩種培養(yǎng)方式均使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃的CO2培養(yǎng)箱。觀察細(xì)胞形態(tài),收集接種3 d后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4 實(shí)時(shí)定量Real-time PCR檢測(cè)

    將收集后的細(xì)胞進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)MSCs抗炎基因LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN、IL-4、IL-13mRNA的表達(dá)水平。細(xì)胞用Trizol法提取總RNA,用基因擴(kuò)增儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,每個(gè)樣本加入3個(gè)復(fù)孔;Real-time PCR程序如下:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s,60℃ 40 s;溶解95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。選取管家基因β-Actin作為內(nèi)參,使用ABI 7500軟件2-ΔΔct法處理數(shù)據(jù),將對(duì)照組基因表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理,用柱形圖表示實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù),Real-time PCR引物序列見表1。

    表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study.

    1.5 蛋白印跡法(Western blot)

    采用Western blot法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MSCs抗炎相關(guān)基因LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN、IL-4、IL-13蛋白的表達(dá),β-Actin作為對(duì)照。

    1.6 免疫熒光檢測(cè)

    在超凈工作臺(tái)內(nèi),將成球培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞懸液滴加至蓋玻片上,置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至細(xì)胞固著。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)約6 h。然后用4%多聚甲醛固定。待爬片稍干后用組化筆在蓋玻片中間細(xì)胞分布均勻的位置畫圈,加破膜工作液,室溫孵育10 min,PBS洗3次,每次5 min。在圈內(nèi)滴加3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育20 min,將爬片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5 min。待爬片稍干后在圈內(nèi)滴加一抗覆蓋細(xì)胞,平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。將爬片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5 min。稍甩干后在圈內(nèi)滴加二抗覆蓋細(xì)胞,室溫孵育50 min。PBS洗3次,每次5 min。每孔內(nèi)滴加DAPI染液,室溫孵育5 min,PBS洗3次,每次5 min。滴加抗熒光淬滅劑于細(xì)胞上,封片,熒光顯微鏡下觀察。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果與分析

    2.1 平板培養(yǎng)和CM培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

    如圖1所示,平板培養(yǎng)組(對(duì)照組)MSCs貼壁生長(zhǎng),形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣,增殖后聚集成簇,在CM作為底物的培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組)條件下,MSCs為懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)。早期MSCs呈單個(gè)球體懸浮于CM表面,大約1 d后MSCs開始在CM表面自發(fā)聚集為多細(xì)胞球形體,并進(jìn)行性增大。

    圖1 平板培養(yǎng)和CM培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of MSCs cells cultured in plate and CM.注:A、B分別為對(duì)照組培養(yǎng)3 d時(shí)40倍和100倍視野下的細(xì)胞形態(tài);C、D分別為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)3 d時(shí)40倍和100倍視野下的細(xì)胞形態(tài)。

    2.2 CM培養(yǎng)對(duì)MSCs抗炎相關(guān)基因表達(dá)的影響

    CM培養(yǎng)的MSCs抗炎相關(guān)基因IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN的表達(dá)水平較常規(guī)培養(yǎng)組增加,差異顯著(P<0.01)。其中STC-1、IL-13、IL1RN基因表達(dá)量相對(duì)于平板培養(yǎng)增加超過40倍(圖2)。

    圖2 CM組與平板培養(yǎng)組 MSCs mRNA 的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)Fig.2 Relative expression multiple of MSCs mRNA in CM and plate.

    2.3 免疫熒光觀察

    CM培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組)和平板培養(yǎng)(對(duì)照組)中待檢測(cè)的COX-2、IL-4、IL-10、ILF基因表達(dá)的蛋白位于細(xì)胞內(nèi),屬于內(nèi)源性蛋白。而實(shí)驗(yàn)組中COX-2、IL-4、IL-10、ILF基因表達(dá)的蛋白量比對(duì)照組高,說明CM培養(yǎng)有利于MSCs 中COX-2、IL-4、IL-10、ILF基因的表達(dá)(圖3)。

    圖3 平板培養(yǎng)和CM培養(yǎng)的MSCs中相關(guān)蛋白的分布情況Fig.3 Distribution of related protein in MSCs cultured in plate and CM.

    2.4 CM培養(yǎng)對(duì)MSCs抗炎相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

    與常規(guī)培養(yǎng)組MSCs抗炎相關(guān)基因IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN蛋白的表達(dá)水平比較,CM培養(yǎng)組蛋白的表達(dá)水平顯著增高(圖4)。

    圖4 CM和平板培養(yǎng)的MSCs抗炎相關(guān)基因蛋白的相對(duì)表達(dá)情況Fig.4 Relative expression of anti-inflammatory related genes cultured in CM and plate.注:實(shí)驗(yàn)組為CM培養(yǎng),對(duì)照組為常規(guī)平板培養(yǎng)。

    3 討論

    OA病理變化涉及形成關(guān)節(jié)的所有組織,其發(fā)展過程中,關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織具有不同嚴(yán)重程度的炎癥反應(yīng),關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞。研究認(rèn)為,免疫系統(tǒng)參與OA的發(fā)生發(fā)展,是OA發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵要素之一[7]。在OA的進(jìn)展過程中,各種細(xì)胞因子其產(chǎn)生和發(fā)揮作用可以根據(jù)疾病的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度而變化[8]。細(xì)胞因子最重要的作用是干擾分解代謝和合成代謝過程,尤其是在經(jīng)常承受高機(jī)械負(fù)荷的組織中,例如人體關(guān)節(jié)[9]。由于合成和分解代謝的平衡遭到破壞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退化,進(jìn)而導(dǎo)致疾病的持續(xù)發(fā)展。由于細(xì)胞因子在OA等炎癥性疾病中的作用,它們可分為炎癥性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子[10]。在OA的發(fā)生發(fā)展中,即包括對(duì)組織有損害的炎癥分解代謝過程,也包括對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用的抗炎合成代謝過程,這些過程由各種炎癥和抗炎因子介導(dǎo)完成。OA發(fā)生病理生理過程主要由炎性細(xì)胞因子和其他增強(qiáng)分解代謝作用的介質(zhì)介導(dǎo)[7]。但是,不應(yīng)低估調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)并對(duì)關(guān)節(jié)組織起保護(hù)作用的抗炎細(xì)胞因子的作用。OA中常見的抗炎基因包括IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN。

    MSCs具有多向分化潛能,因?yàn)槠湟子诜蛛x、體外培養(yǎng)的增殖能力強(qiáng)、免疫抑制特性、可塑性、自分泌和旁分泌介導(dǎo)的效應(yīng)、向受損部位遷徙能力以及表型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)使其成為治療OA的研究熱點(diǎn)[11,12]。MSCs是一種重要的參與組織再生的細(xì)胞庫,可遷移至損傷部位,在局部微環(huán)境作用下,定向分化為某一特定類型的功能細(xì)胞直接參與組織損傷修復(fù)過程,同時(shí)又能分泌多種生物活性物質(zhì),包括細(xì)胞因子及細(xì)胞生長(zhǎng)因子等,起到改善損傷部位再生微環(huán)境、抑制局部炎癥的作用[13]。MSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性,并具有多向分化潛力,而其低免疫原性又為其應(yīng)用于臨床治療提供了安全性保障,使其在炎性關(guān)節(jié)炎的治療中具有一定的應(yīng)用前景[14]。研究證實(shí),關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSCs能夠治療早期關(guān)節(jié)炎,并對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用,同時(shí)還能增加某些抗炎相關(guān)基因和軟骨保護(hù)因子的表達(dá)[15]。

    研究發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增后的MSCs在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的存活率較低,且生物活性與治療效果均不佳[16]。MSCs的分裂或分化與其所處的微環(huán)境密切相關(guān),微環(huán)境中的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、蛋白等均對(duì)MSCs的分化有影響[17]。研究證實(shí),三維細(xì)胞培養(yǎng)能夠生成多細(xì)胞球形體,并可重現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境和相關(guān)生理活動(dòng)[18]。因此,三維培養(yǎng)的MSCs較傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的MSCs具有更強(qiáng)的生物功能和治療效果[19]。本研究的培養(yǎng)結(jié)果也顯示,CM三維培養(yǎng)較常規(guī)平板二維培養(yǎng)更有助于維持MSCs抗炎相關(guān)基因的表達(dá)。

    本研究發(fā)現(xiàn),利用CM培養(yǎng)MSCs能夠克服平板培養(yǎng)的缺點(diǎn),表現(xiàn)為MSCs附在CM上可以形成類球形體,類似懸滴培養(yǎng)的3D培養(yǎng)模式,其轉(zhuǎn)化效率顯著加強(qiáng)[20]。研究表明,附著在CM上的MSCs可以自組裝形成三維細(xì)胞球形體[21]。在這一過程中,MSCs在CM上附著和擴(kuò)散,然后收縮偽足形成多細(xì)胞球體,這種聚集過程與懸浮或懸滴培養(yǎng)的形成機(jī)制完全不同[22]。研究發(fā)現(xiàn),在CM上形成類球狀體與某些基因或蛋白的參與有關(guān),包括鈣粘素分子[23,24]、RHO/ROCK 激酶通路[21]和Wnt分子[24]。雖然觀察到一些基因、蛋白表達(dá)的變化,但在CM上形成球體的確切機(jī)制還未闡明。

    采用三維(3D)懸浮培養(yǎng)MSCs能夠形成多細(xì)胞球體,能夠?qū)SCs的表觀遺傳狀態(tài)產(chǎn)生影響,能夠提高M(jìn)SCs的抗炎特性[25]。CM上培養(yǎng)的MSCs能夠形成多細(xì)胞球體,MSCs的抗炎相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)受影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抗炎相關(guān)基因IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1和IL1RN的表達(dá)水平與常規(guī)平板培養(yǎng)比較顯著增高,表明CM培養(yǎng)的MSCs多細(xì)胞球體的形成更有助于維持MSCs抗炎相關(guān)基因的表達(dá)。

    綜上所述,與常規(guī)平板培養(yǎng)比較,CM培養(yǎng)有助于維持MSCs抗炎相關(guān)基因的表達(dá),能夠增強(qiáng)MSCs的抗炎特性。

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