天麻中總多酚的大孔樹(shù)脂純化工藝優(yōu)化Δ

藺蓓蓓，鄭紅星，劉祥，周天華，胡紅忠，陳琛#（.陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所/陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心/陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 73000；.陜西百圣生物工程有限公司，陜西略陽(yáng) 74300）

天麻（Gastrodia elata Bl.）又名赤箭、合離草、獨(dú)搖芝等，為蘭科天麻屬多年生草本植物，屬國(guó)家三級(jí)保護(hù)物種，主產(chǎn)于云南、四川、貴州等地，生長(zhǎng)于林下陰濕、腐殖質(zhì)較厚的土壤處[1]。天麻是一種名貴的中藥材，其藥用部位為塊莖[2]，可用于治療眩暈眼黑、頭風(fēng)頭痛、肢體麻木、半身不遂、兒驚癇動(dòng)風(fēng)等病癥[3]。天麻既為藥用原料，又為食品原料，主要含有天麻素、對(duì)羥基苯甲醇以及多酚類等多種活性成分[4-5]。其中多酚類成分是植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物[6]，具有抗氧化[7]、抗菌[8]、降血壓[9]、抗衰老[10]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[6]等多種藥理活性。目前研究報(bào)道的多酚類成分的提取方法很多，如超聲波法[11]、微波萃取法[6]、溶劑法[12]和水浴浸提法[13]等，但由于該類成分通常含有較多雜質(zhì)，因此需要進(jìn)一步分離純化。

大孔樹(shù)脂具有吸附能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、使用周期長(zhǎng)、選擇性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多酚類等天然產(chǎn)物的分離純化[14-17]。鑒于此，本研究以天麻中總多酚粗提物為原料，以沒(méi)食子酸為對(duì)照，采用福林酚比色法測(cè)定了天麻中總多酚的含量；通過(guò)比較4種不同極性大孔樹(shù)脂對(duì)天麻中總多酚的靜態(tài)吸附力和解吸力，對(duì)大孔樹(shù)脂種類進(jìn)行篩選；通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，對(duì)天麻中總多酚的分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用天麻中總多酚、提高其藥用價(jià)值提供參考。

1 材料

1.1 儀器

722G型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；420R型冷凍離心機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；AL204型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）；FW135/177型中草藥粉碎機(jī)（上海臺(tái)杏貿(mào)易有限公司）；YB-IA型真空恒溫干燥箱（天津市拓普儀器有限公司）；HHS-4S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；MAS-Ⅰ型微波提取儀（杭州寶賽生物科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

沒(méi)食子酸對(duì)照品（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G8720，純度：≥98%）；D101型大孔樹(shù)脂（安徽三星樹(shù)脂科技有限公司，批號(hào)：MB2539）；AB-8型大孔樹(shù)脂（批號(hào)：B0692）、ADS-7型大孔樹(shù)脂（批號(hào)：KS34087）、D301型大孔樹(shù)脂（批號(hào)：JD-63428）均購(gòu)自天津波鴻樹(shù)脂科技有限公司；福林酚試劑（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：BBM0548）；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。4種型號(hào)大孔樹(shù)脂物理參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 4種型號(hào)大孔樹(shù)脂物理參數(shù)Tab 1 Physical parameters of 4 macroporous resins

1.3 藥材

天麻藥材采集于陜西省略陽(yáng)縣，經(jīng)陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院王勇教授鑒定為蘭科天麻屬植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的根莖。天麻藥材經(jīng)蒸煮后于45℃烘干，粉碎后過(guò)60目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻中總多酚含量的測(cè)定

采用福林酚比色法測(cè)定天麻中總多酚的含量[18]。

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品25 mg，置于250 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末200 g，加80%乙醇3 000 mL，置于微波提取儀（溫度：60℃，頻率：600 Hz）提取10 min，濃縮并干燥，得浸膏。取浸膏20mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加水5 mL、福林酚試劑1.5 mL、10%Na2CO3溶液3 mL，再加水稀釋至刻度，于30℃水浴放置30 min后，取出，搖勻，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以水作為空白對(duì)照。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得沒(méi)食子酸回歸方程為y＝0.0474x－0.079 8（r＝0.999 9），表明沒(méi)食子酸檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為4～32 μg/mL。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，于760 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，吸光度的RSD為0.98%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、30、60、90、120、150 min時(shí)于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD為0.98%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置150 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品適量，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算天麻中總多酚的含量。結(jié)果，天麻中總多酚的平均含量為0.257 mg/g，RSD為1.21%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品粉末，共6份，分別加入0.1 mg/mL對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

2.1.8 樣品含量測(cè)定 取樣品粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算天麻中總多酚的含量，平行操作3次。結(jié)果，天麻中總多酚的含量為0.250～0.258 mg/g。

2.2 大孔樹(shù)脂純化工藝的優(yōu)化

2.2.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理 取4種型號(hào)大孔樹(shù)脂各50g，以水浸洗，然后用無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜。再以水浸泡清洗至無(wú)醇味（大約5倍樹(shù)脂），然后用5%鹽酸溶液浸泡（2倍大孔樹(shù)脂體積）2 h，接著以水浸泡清洗至中性。最后用5%氫氧化鈉溶液浸泡（2倍大孔樹(shù)脂體積）2 h，然后以水浸泡清洗至中性[19]，于4℃保存，備用。

2.2.2 靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率的測(cè)定 ①分別稱取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的4種型號(hào)大孔樹(shù)脂各2 g，各3份分別置于具塞錐形瓶中，加“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液100mL，于28℃下以100 r/min振蕩24 h，使樹(shù)脂充分吸附后濾過(guò)；濾液按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算4種型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附量、靜態(tài)吸附率。②用濾紙吸干充分吸附后的大孔樹(shù)脂的表面濾液，置于干燥的具塞錐形瓶中，加80%乙醇50 mL，于28℃下以100 r/min振蕩12 h使其充分解吸，解吸液濾過(guò)，濾液按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算4種型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)解吸量、靜態(tài)解吸率。靜態(tài)吸附量＝（吸附前天麻中總多酚質(zhì)量濃度－吸附后天麻中總多酚質(zhì)量濃度）×上樣液體積/干樹(shù)脂質(zhì)量。靜態(tài)吸附率＝[（吸附前天麻中總多酚質(zhì)量濃度－吸附后天麻中總多酚質(zhì)量濃度）/吸附前天麻中總多酚質(zhì)量濃度]×100%。靜態(tài)解吸量＝洗脫液中樣品質(zhì)量濃度×洗脫液體積/干樹(shù)脂質(zhì)量。靜態(tài)解吸率＝[洗脫液中樣品質(zhì)量濃度×洗脫液體積/（吸附前天麻中總多酚質(zhì)量濃度－吸附后天麻中總多酚質(zhì)量濃度）]×上樣液體積×100%。4種型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

表3 4種型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Results of static adsorption-desorption of four macroporous resins（±s，n＝3）

表3 4種型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Results of static adsorption-desorption of four macroporous resins（±s，n＝3）

型號(hào)AB-8型ADS-7型D101型D301型靜態(tài)吸附量，mg/g 0.036±0.001 0.055±0.001 0.034±0.002 0.057±0.002靜態(tài)吸附率，%36.00±1.32 56.50±0.87 33.50±1.50 54.70±1.66靜態(tài)解吸量，mg/g 0.017±0.006 0.030±0.002 0.011±0.001 0.035±0.002靜態(tài)解吸率，%86.07±0.80 45.97±1.11 75.10±1.18 69.97±1.80

圖1 4種型號(hào)大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸結(jié)果柱狀圖Fig 1 Static adsorption and desorption column diagram of four macroporous resins

由表3、圖1可知，ADS-7型大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率較高，而靜態(tài)解吸率最低；AB-8、D101型大孔樹(shù)脂的靜態(tài)解吸率較高，而靜態(tài)吸附率較低；D301型大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率和解吸率均較高。綜合考慮，選擇D301型大孔樹(shù)脂進(jìn)行進(jìn)一步考察。

2.2.3 動(dòng)態(tài)吸附性能考察 ①上樣液流速考察：取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的D301型大孔樹(shù)脂15 g濕法裝柱，另取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液3倍柱體積（BV）（質(zhì)量濃度4 mg/mL，以天麻中總多酚質(zhì)量計(jì)，下同），各3份，以流速2、3、4 BV/h進(jìn)行吸附試驗(yàn)，收集流出液；靜置2 h后以100 r/min振搖10 h，充分吸附后，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色并于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參照“2.2.2”項(xiàng)下公式計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附量和動(dòng)態(tài)吸附率，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，隨著上樣液流速的加快，動(dòng)態(tài)吸附量、動(dòng)態(tài)吸附率均逐漸下降；當(dāng)上樣液流速為2 BV/h時(shí)，動(dòng)態(tài)吸附量、動(dòng)態(tài)吸附率均為最高。可能與上樣液流速過(guò)快導(dǎo)致上樣液在層析柱中停留的時(shí)間較短，不能與樹(shù)脂充分接觸，導(dǎo)致樹(shù)脂吸附效果不明顯[20-21]有關(guān)。為減少實(shí)際生產(chǎn)成本，本研究選擇上樣液流速為2 BV/h。

表4 不同上樣液流速比較（n＝3）Fig 4 Comparison of different flow rate of sampling solution（n＝3）

②上樣液質(zhì)量濃度考察：取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的D301型大孔樹(shù)脂15 g濕法裝柱，另取按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備的質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL的供試品溶液，各3份，以上樣液流速2 BV/h、上樣量3 BV進(jìn)行吸附試驗(yàn)，收集流出液；靜置2 h后以100 r/min振搖10 h，充分吸附后，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色并于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參照“2.2.2”項(xiàng)下公式計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附量和動(dòng)態(tài)吸附率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同上樣液質(zhì)量濃度比較（n＝3）Fig 5 Comparison of different mass concentration of sampling solution（n＝3）

由表5可見(jiàn)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，動(dòng)態(tài)吸附量、動(dòng)態(tài)吸附率均呈先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，動(dòng)態(tài)吸附量、動(dòng)態(tài)吸附率均最高。其原因可能為上樣液質(zhì)量濃度過(guò)大，純化時(shí)間較長(zhǎng)，樹(shù)脂不能將天麻中總多酚完全吸收，從而導(dǎo)致吸附能力降低。故本研究選擇上樣液質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

2.2.4 動(dòng)態(tài)解吸性能考察 ①洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)考察：取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的D301型大孔樹(shù)脂15 g濕法裝柱，另取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液3 BV，各4份，以上樣液流速2 BV/h，上樣液質(zhì)量濃度4 mg/mL進(jìn)行吸附試驗(yàn)，收集流出液。靜置2 h后，分別用50%、60%、70%、80%、90%乙醇以5 BV進(jìn)行洗脫，流速為3 BV/h，收集流出液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并參照“2.2.2”項(xiàng)下公式計(jì)算動(dòng)態(tài)解吸量和動(dòng)態(tài)解吸率，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)比較（n＝3）Tab 6 Comparison of different volume fraction of eluent（n＝3）

由表6可見(jiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，動(dòng)態(tài)解吸量、動(dòng)態(tài)解吸率均呈先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，動(dòng)態(tài)解吸量、動(dòng)態(tài)解吸率均最高。其原因可能為70%乙醇更有利于天麻中總多酚的溶解，增加乙醇體積分?jǐn)?shù)可能會(huì)影響天麻中總多酚和大孔樹(shù)脂之間的相互作用[22]。故本研究選擇洗脫溶劑為70%乙醇。

②洗脫流速考察：取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的D301型大孔樹(shù)脂15 g濕法裝柱，另取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液3 BV，以上樣液流速2 BV/h，上樣液質(zhì)量濃度4 mg/mL進(jìn)行吸附試驗(yàn)，收集流出液。靜置2 h后，用70%乙醇以5 BV進(jìn)行洗脫，洗脫流速分別為2、2.5、3、3.5、4、4.5 BV/h，收集流出液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并參照“2.2.2”項(xiàng)下公式計(jì)算動(dòng)態(tài)解吸量和動(dòng)態(tài)解吸率，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同洗脫流速比較（n＝3）Tab 7Comparison of different flow rates of eluent（n＝3）

由表7可見(jiàn)，隨著洗脫流速的增加，動(dòng)態(tài)解吸量、動(dòng)態(tài)解吸率均呈先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)洗脫流速為3 BV/h時(shí)，動(dòng)態(tài)解吸量、動(dòng)態(tài)解吸率均為最高。其原因可能為解吸液通過(guò)層析柱速度過(guò)快，使解吸液不能與樹(shù)脂充分接觸，從而影響解吸液對(duì)天麻中總多酚的溶解。故本研究選擇洗脫流速為3 BV/h。

③洗脫溶劑體積考察：取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的D301型大孔樹(shù)脂15 g濕法裝柱，另取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液3 BV，以上樣液流速2 BV/h，上樣液質(zhì)量濃度4 mg/mL進(jìn)行吸附試驗(yàn)，收集流出液。靜置2 h后，用70%乙醇以洗脫流速3 BV/h進(jìn)行洗脫試驗(yàn)，洗脫溶劑分別為3、4、5、6、7、8 BV，收集流出液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并參照“2.2.2”項(xiàng)下公式計(jì)算動(dòng)態(tài)解吸量和動(dòng)態(tài)解吸率，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 不同洗脫溶劑體積比較（n＝3）Tab 8Comparison of different volume of eluent（n＝3）

由表8可見(jiàn)，隨著洗脫溶劑體積的增加，動(dòng)態(tài)解吸量、動(dòng)態(tài)解吸率均呈先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)洗脫溶劑體積為5 BV時(shí)，動(dòng)態(tài)解吸量、動(dòng)態(tài)解吸率均最高。其原因可能為隨著洗脫溶劑體積的增加，天麻中總多酚被充分洗脫，此時(shí)再增加洗脫溶劑體積，解吸能力下降，在實(shí)際生產(chǎn)中可能會(huì)增加生產(chǎn)成本[23]。故本研究選擇洗脫液體積為5 BV。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，最優(yōu)純化工藝為上樣液流速2 BV/h、上樣液質(zhì)量濃度4 mg/mL、洗脫溶劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)70%、洗脫流速3 BV/h、洗脫溶劑體積5 BV。經(jīng)驗(yàn)證，此時(shí)天麻中總多酚平均含量為0.381 mg/g（n＝3）。

3 討論

大孔樹(shù)脂是一類不含交換基團(tuán)且?guī)в锌谞罱Y(jié)構(gòu)的高分子吸附樹(shù)脂，是具有濃縮、分離作用的高分子聚合物，已廣泛應(yīng)用于多酚、多糖和生物堿等天然產(chǎn)物的分離、純化，目前采用大孔樹(shù)脂純化的有龍崗總多酚[24]、生姜多酚[15]、刺山柑總酚酸[25]、山葡萄籽多酚[26]等，這都提示了大孔樹(shù)脂精制植食性植物多酚類有效成分的可行性。

本研究采用福林酚比色法測(cè)定了天麻中總多酚的含量，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好。天麻中總多酚在D301型中極性大孔樹(shù)脂中的吸附和解吸能力相對(duì)較好，最優(yōu)純化工藝為上樣液流速2 BV/h、上樣液質(zhì)量濃度4 mg/mL、洗脫溶劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)70%、洗脫流速3 BV/h、洗脫溶劑體積5 BV。純化后天麻中總多酚的解吸率為69.97%，天麻中總多酚含量為0.381 mg/g。

綜上所述，本研究所建含量測(cè)定方法靈敏度高、穩(wěn)定性好；優(yōu)化的純化工藝穩(wěn)定、可行。