垂體催乳素細胞分化發(fā)育的研究進展

蘇 凱 章衛(wèi)平 曹冬梅

垂體是人體重要的內(nèi)分泌器官，主要由5種內(nèi)分泌細胞組成：生長激素細胞、催乳素細胞、促甲狀腺素細胞、促性腺激素細胞和促腎上腺皮質(zhì)激素細胞，功能涉及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、生長發(fā)育、物質(zhì)代謝、生殖和哺乳等。其中，生長激素細胞和催乳素細胞占腺垂體內(nèi)分泌細胞數(shù)量的半數(shù)以上，兩者在分化上關(guān)系密切，在生物學(xué)功能上部分重疊，而它們分化命運決定的分子機制至今尚不完全清楚。由于出生后垂體中的催乳素細胞數(shù)量仍有很大可塑性，因此催乳素瘤也是臨床上最常見的垂體瘤類型之一。近年來，筆者所在實驗室報道了以垂體催乳素細胞群單一性缺失為表型的基因敲除小鼠，這為催乳素細胞分化命運決定的分子機制研究提供了很好的模型，也使人們對催乳素細胞分化發(fā)育的特異性調(diào)控機制有了更深入的理解，并可能為垂體相關(guān)疾病的防治提供新的靶點。本文就該領(lǐng)域的研究進展做一綜述。

一、垂體催乳素細胞的分化發(fā)育過程

1.胚胎期催乳素細胞的分化起源：胚胎期垂體催乳素細胞、生長激素細胞和促甲狀腺素細胞共同起源于同一群以轉(zhuǎn)錄因子Pit-1(Pou1f1)為標(biāo)志分子的前體細胞。小鼠胚胎第13.5天(E13.5)，上述3群內(nèi)分泌細胞開始分化。小鼠胚胎第14.5天促甲狀腺素細胞分化成熟，其標(biāo)志是在前葉中的部分細胞表達促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone β subunit，TSHβ)。小鼠胚胎第15.5天，生長激素(growth hormone，GH)和催乳素(prolactin，PRL)的表達標(biāo)志著生長激素細胞和催乳素細胞的分化成熟。隨后，生長激素細胞數(shù)量急速增加并延伸至整個前葉的中央和側(cè)面，而催乳素細胞則分布于前葉腹側(cè)面的中央。

在這3群共同起源于Pit-1陽性前體細胞的內(nèi)分泌細胞中，PRL譜系和GH譜系的分化過程關(guān)系最為密切。傳統(tǒng)觀點認為，催乳素細胞的分化成熟過程中會經(jīng)歷一個PRL/GH共表達的過渡階段，即一部分Pit1陽性前體細胞先分化為PRL/GH雙陽性的催乳素生長激素細胞(somatolactotropes)，再分化成PRL單陽性的成熟催乳素細胞。但也有不同意見認為，PRL/GH雙陽性前體細胞并不是催乳素細胞分化的必經(jīng)階段，在成年垂體中只有10%的催乳素細胞經(jīng)PRL/GH雙陽性途徑分化，而另90%的催乳素細胞由Pit-1陽性前體細胞直接分化而來，甚至有研究認為胚胎期垂體中根本就沒有PRL/GH雙陽性細胞的存在。筆者所在實驗室通過免疫組化的雙標(biāo)記檢測結(jié)果顯示，小鼠胚胎第18.5天之前的PRL陽性細胞均為PRL/GH雙陽性表達，且這群雙陽性細胞在出生前并不增殖。從出生后第3天(P3)開始，腺垂體中的催乳素細胞數(shù)量擴增，出生后第4天時PRL/GH雙陽性細胞占催乳素細胞總數(shù)的25%，至出生后第14天時PRL/GH雙陽性細胞僅占催乳素細胞總數(shù)的5%[1]。以上結(jié)果說明，催乳素細胞的分化包括Pit1陽性細胞直接分化途徑和經(jīng)PRL/GH雙陽性細胞途徑兩種方式。經(jīng)PRL/GH雙陽性細胞途徑是小鼠胚胎第18.5天之前催乳素細胞分化的主要方式，但這種方式分化而來的催乳素細胞數(shù)量十分有限。催乳素細胞數(shù)量的大幅擴增主要發(fā)生在出生后，此時經(jīng)PRL/GH雙陽性細胞分化不是催乳素細胞數(shù)量增加的主要方式。至于這兩種分化途徑在催乳素細胞分化過程中的具體占比，有待于進一步研究。PRL/GH雙陽性途徑的存在也提示PRL譜系與GH譜系的分化過程關(guān)系密切，彼此之間很可能存在相互影響。

2.出生后催乳素細胞的數(shù)量調(diào)節(jié)：催乳素細胞約占成年垂體內(nèi)分泌細胞的20%～30%，在妊娠和哺乳期母鼠垂體中催乳素細胞大量擴增，占比甚至可以超過50%。正是由于成年垂體中催乳素細胞具有很大的增殖潛力和可塑性，臨床上催乳素瘤是垂體腫瘤的最常見類型之一。成年垂體中催乳素細胞的數(shù)量增加主要有兩條途徑：一是通過催乳素細胞的自身增殖，這一過程受局部和全身分泌的各種釋放因子和抑制因子調(diào)控；另一條途徑是通過垂體組織中干細胞的增殖和分化。近年來，對成年垂體干細胞的研究有很大進展。目前認為，出生后的垂體中仍存在大量干細胞，主要位于垂體前葉和中葉交界處的邊緣區(qū)，它們不僅參與了垂體形態(tài)的維持，還在垂體損傷后修復(fù)的過程中發(fā)揮重要作用[2]。但目前尚無一種可靠的標(biāo)志物能鑒定出所有成年垂體干細胞。一項以SOX2為干細胞標(biāo)志和另一項以Nestin為干細胞標(biāo)志的研究顯示了相似的結(jié)果，腺垂體中干細胞在出生后7天時增殖最活躍，體外分離培養(yǎng)的垂體干細胞具有進一步分化為所有類型內(nèi)分泌細胞的能力。雖然SOX2是一種比較公認的干細胞標(biāo)志物，但仍不能代表所有的垂體干細胞，文獻已報道的成年垂體中具有干細胞特性的細胞群有“側(cè)群細胞(side population)”、“SOX2陽性細胞”和“nestin陽性細胞”。筆者所在實驗室的研究顯示，成年垂體中也存在少量PRL/GH雙陽性前體細胞，這可能是干細胞向催乳素細胞分化的中間過程。

二、催乳素細胞分化的分子調(diào)控

1.催乳素系前體細胞的分化調(diào)控機制：胚胎第8.5天，在間腦腹側(cè)神經(jīng)外胚層上皮分泌的骨形態(tài)生成蛋白4(bone morphogenetic proteins 4，BMP4)和Wnt/β-catenin等信號通路調(diào)控下，轉(zhuǎn)錄因子Pitx2開始表達，標(biāo)志著垂體基板的分化出現(xiàn)。胚胎第9.5天，間腦腹側(cè)分泌的成纖維細胞生長因子8(fibroblast growth factor 8，F(xiàn)GF8)和音猬因子(sonic hedgehog，Shh)信號通路共同作用誘導(dǎo)Lhx3表達，顱頰囊(rathke′s pouch，RP)分化出現(xiàn)，形成了早期腺垂體的雛形。胚胎第11.5天開始表達的PROP1轉(zhuǎn)錄因子可以通過激活Zeb2等基因來啟動垂體干細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，使垂體干細胞變?yōu)檫^渡期細胞。在這一過程中，干細胞標(biāo)志物SOX2的表達隨之減少，細胞間的鈣黏蛋白、緊密連接蛋白減少，基質(zhì)金屬蛋白酶表達增多，以便進行下一步的細胞特異性分化[3]。胚胎第13.5天PROP1陽性干細胞中的一部分開始表達Pit-1。接下來Pit-1陽性細胞中的一小部分在胚胎第14.5天分化為促甲狀腺素細胞，其余的在胚胎第15.5天分化出生長激素細胞和催乳素細胞(圖1)。

圖1 腺垂體Pit-1陽性細胞譜系的分化過程

在催乳素細胞分化命運決定方面，Pit-1一直以來被認為是調(diào)控其分化發(fā)育的特異性和關(guān)鍵性分子。胚胎第13.5天，Wnt/β-catenin信號和轉(zhuǎn)錄因子Prop1、Atbf1開始誘導(dǎo)Pit-1表達，胚胎第16.5天Pit-1與自身基因啟動子區(qū)結(jié)合，通過正反饋作用維持表達，直到圍產(chǎn)期Pit-1的表達才減少至消失。然而，由于Pit-1的靶基因除Prl外，還包括Gh、Tshβ和Ghrhr，因此在調(diào)控催乳素細胞分化上并不特異。該基因缺失小鼠表現(xiàn)為GH、PRL和TSH的聯(lián)合缺失，臨床上Pit-1突變患者大多也表現(xiàn)為GH和PRL的聯(lián)合缺失，伴或不伴有TSH缺失。近年來筆者所在實驗室發(fā)現(xiàn)并報道了轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20可能是決定催乳素細胞分化特異性的關(guān)鍵分子[1]。ZBTB20起始表達于胚胎第14.5天的RP，該基因全身敲除小鼠表現(xiàn)出以催乳素細胞群特異性缺失為特征的垂體發(fā)育不良，這是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個缺失后只影響催乳素細胞單譜系分化發(fā)育的基因。ZBTB20可能作用于Pit-1陽性前體細胞向催乳素細胞直接分化以及PRL/GH雙陽性過渡細胞向催乳素細胞終末分化的過程。

2.出生后催乳素細胞數(shù)量的調(diào)控機制：出生后垂體催乳素細胞的分化和增殖主要受體內(nèi)激素和來自下丘腦信號的共同調(diào)節(jié)，其中雌激素和PRL釋放因子促進PRL的合成釋放及催乳素細胞的增殖，而多巴胺和PRL抑制因子則抑制PRL的合成釋放及催乳素細胞的增殖。參與調(diào)節(jié)的信號通路包括cAMP和PKA信號通路、MAPK信號通路、PI3K信號通路、TGF信號通路、Hippo信號通路和CK2信號通路[4]。在ZBTB20基因敲除小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，ZBTB20分子可促進垂體生長激素細胞的增殖，其在成年垂體中對催乳素細胞的增殖以及干細胞向催乳素細胞分化的影響有待于進一步研究[1]。

三、PRL的生理功能和表達調(diào)控

催乳素細胞分化成熟的標(biāo)志是產(chǎn)生和分泌PRL，PRL入血后作為重要的信使分子參與靶器官的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)。PRL和GH以及胎盤催乳激素(placental lactogen，PL)三者同屬于一個激素家族。人垂體PRL基因編碼產(chǎn)物為227個氨基酸的激素前體，包含28個氨基酸的信號肽和199個氨基酸的成熟PRL。大小鼠的成熟PRL蛋白則由197個氨基酸構(gòu)成。經(jīng)典的PRL功能包括參與生殖腺和乳腺發(fā)育、調(diào)節(jié)泌乳過程和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。最早報道的PRL全身敲除小鼠主要表現(xiàn)為雌性小鼠不育和乳腺發(fā)育不全，以及泌乳期母性行為的改變。然而，隨后的研究發(fā)現(xiàn)乳腺、卵巢、前列腺、睪丸、淋巴細胞、腦和脂肪等多種外周組織也可表達PRL[5, 6]。目前已知，PRL的功能涉及免疫調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運、血小板聚集、脂肪細胞分化和胰島功能調(diào)節(jié)等生理學(xué)過程，以及腫瘤生長和圍產(chǎn)期心肌病等病理過程[7～9]。

垂體外PRL和垂體PRL雖然在蛋白序列、構(gòu)象和功能上完全一致，但它們的表達調(diào)控機制完全不同。兩者有著不同的轉(zhuǎn)錄起始位點，使得垂體外PRL mRNA的5′端多了150bp的非編碼外顯子(exon 1a)。由于垂體PRL是催乳素細胞分化成熟的標(biāo)志物，因此多年來，研究者試圖通過闡明垂體PRL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制來揭示催乳素細胞和生長激素細胞分化差異的分子開關(guān)。利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型分析PRL基因近端(垂體)啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)，其5′端3kb序列足以調(diào)控垂體PRL的表達。該序列包含一個近端啟動子區(qū)(-422～+33bp)和一個遠端增強子區(qū)(-1.8～-1.5kb)(圖2)。近端啟動子區(qū)含有Pit-1、Ets-1和Pitx的結(jié)合位點，介導(dǎo)各種刺激對PRL的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。其中，Pit-1和Ets-1相互作用介導(dǎo)FGF和促甲狀腺素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)經(jīng)Ras/MAPK通路誘導(dǎo)的PRL表達。Pit-1還能與Pitx1、Pitx2和C/EBP相互作用介導(dǎo)PRL表達[10]。但上述轉(zhuǎn)錄因子和共作用分子的缺失往往影響多群內(nèi)分泌細胞的分化。PRL基因的遠端增強子區(qū)含若干個Pit-1結(jié)合位點(PRL-1P)和一個雌激素受體反應(yīng)元件(estrogen receptor element，ERE)，Pit-1和雌激素受體(estrogen receptor，ER)相互作用可特異性介導(dǎo)雌激素誘導(dǎo)的PRL轉(zhuǎn)錄。除了正調(diào)節(jié)因子外，PRL的表達還受一些負調(diào)節(jié)因子的影響。最經(jīng)典的通路是，下丘腦分泌的多巴胺與催乳素細胞表面的多巴胺D2受體(dopamine receptor D2，DRD2)結(jié)合，DRD2與抑制型G蛋白偶聯(lián)，下調(diào)胞內(nèi)的cAMP和鈣，并募集共抑制因子組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)，從而抑制PRL的表達。此外，還有文獻報道，在大鼠垂體瘤細胞系中C/EBP可與Pit-1蛋白競爭性結(jié)合PRL基因上游的Pit-1結(jié)合位點，從而抑制PRL表達[10]。但是，無論ER還是DRD2的敲除都不影響催乳素細胞的分化出現(xiàn)。

圖2 垂體PRL基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模式圖

在參與催乳素細胞分化發(fā)育調(diào)控的眾多轉(zhuǎn)錄因子中，ZBTB20是目前已知的特異性最高的調(diào)控分子。ZBTB20是筆者所在實驗室率先發(fā)現(xiàn)并報道的BTB鋅指蛋白家族成員，由741個編碼氨基酸組成。ZBTB20的生物學(xué)功能廣泛，已報道的包括參與體內(nèi)糖脂代謝、海馬發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、疼痛和傷害感受調(diào)節(jié)、肝細胞再生、軟骨發(fā)育、垂體發(fā)育、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)以及肝癌發(fā)生等[1,11～19]。ZBTB20基因敲除小鼠的垂體表現(xiàn)為催乳素細胞群的完全缺失，而其他內(nèi)分泌細胞的分化不受影響，這也是目前唯一的以垂體催乳素細胞單一性缺失為表型的基因敲除小鼠模型。在其他組織中，ZBTB20既可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子也可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用[15，17，20]。而ZBTB20調(diào)控垂體PRL表達的分子機制尚未完全闡明，目前已知垂體ZBTB20通過與PRL基因啟動子直接結(jié)合從而激活其轉(zhuǎn)錄，但其具體結(jié)合的位點和可能的共作用因子有待進一步研究[1]。

四、展 望

盡管人們對于垂體內(nèi)分泌細胞的分化發(fā)育過程已有相當(dāng)多研究，但是精細的調(diào)控機制尚未完全闡明，尤其是有著共同分化起源的生長激素細胞和催乳素細胞的分化命運決定機制依舊存在許多的未知有待進一步探索。近年來，筆者所在實驗室發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20可能是決定催乳素細胞分化特異性的重要分子，這為闡明催乳素細胞分化發(fā)育的機制提供了很好的研究方向。當(dāng)然，有關(guān)催乳素細胞的分化發(fā)育過程以及ZBTB20發(fā)揮作用的具體機制方面仍有以下很多問題值得研究：①明確經(jīng)PRL/GH雙陽性細胞分化或由Pit-1陽性前體細胞直接分化這兩種分化方式在成熟催乳素細胞中的所占比例，從而評價這兩種分化方式在催乳素細胞分化過程中的重要性；②ZBTB20調(diào)控PRL表達的具體機制，及與已知的信號分子和轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用；③成年期垂體ZBTB20在細胞分化和增殖中的作用，及與垂體瘤之間的關(guān)系。

綜上所述，由于垂體發(fā)育及其相關(guān)疾病具有多樣性和復(fù)雜性，關(guān)于垂體內(nèi)分泌細胞發(fā)育機制，信號的調(diào)控、干細胞醫(yī)療仍然具有許多值得探索開拓的領(lǐng)域。這也是為未來可能出現(xiàn)的基因療法、胚胎治療、早期阻斷等先進的診療手段提供準(zhǔn)確的理論基礎(chǔ)。