體外腫瘤模型在藥敏試驗(yàn)及藥物研發(fā)中的應(yīng)用

徐怡朦 楊亞冬 楊 耿 宋勇飛 張文元

癌癥是全球死亡的主要原因之一，盡管研發(fā)人員和制藥界作出了巨大努力，但腫瘤藥物開發(fā)仍然充滿挑戰(zhàn)，即使是最先進(jìn)的臨床前藥物測試，也難以預(yù)料藥物毒性作用、不良反應(yīng)、藥物耐受及藥物相互作用。腫瘤模型的藥敏試驗(yàn)在指導(dǎo)臨床用藥及個(gè)體化治療方面具有重要作用?？煽康乃幟粼囼?yàn)，可幫助選擇有效的化療藥物，避免藥物毒性不良反應(yīng)，設(shè)計(jì)合理的治療方案，提高治療效果。一個(gè)理想的腫瘤模型應(yīng)與其模擬的腫瘤在分子、形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特征方面有許多共同性，即真實(shí)地仿生[1]。細(xì)胞培養(yǎng)模型一直是抗癌藥物研發(fā)計(jì)劃的核心。為了在體外腫瘤模型中了解腫瘤微環(huán)境的詳細(xì)情況，研究人員開發(fā)了大量二維(2D)和三維(3D)模型。其中3D體外模型正成為傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型之間的橋梁。而3D生物打印腫瘤模型可將細(xì)胞與材料同時(shí)操作，實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)材料的特定空間排布，構(gòu)建比傳統(tǒng)3D模型更為仿真的3D腫瘤模型，以發(fā)揮其在抗癌藥物篩選評估中的作用。

一、二維(2D)腫瘤模型與藥敏試驗(yàn)及藥物研發(fā)

2D細(xì)胞培養(yǎng)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。腫瘤細(xì)胞2D培養(yǎng)模型由于操作簡便，反應(yīng)靈敏，觀察分析快捷，實(shí)驗(yàn)周期短等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為目前生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中最常用的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式。各種癌細(xì)胞系的體外2D培養(yǎng)被廣泛用于腫瘤疾病研究，以及候選藥物高通量篩選評估，是目前廣泛使用的腫瘤模型。然而在從臨床前模型轉(zhuǎn)向人體試驗(yàn)后， 2D培養(yǎng)模型預(yù)測治療方案和策略的有效性值得商榷：①體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞團(tuán)呈三維球形；②腫瘤細(xì)胞在遺傳和表型上呈現(xiàn)多樣化，2D細(xì)胞培養(yǎng)難以模擬如此巨大的克隆多樣性(腫瘤異質(zhì)性)以測試候選藥物的功效和毒性不良反應(yīng)；③腫瘤微環(huán)境非常復(fù)雜，而2D腫瘤模型由于缺乏有效的腫瘤微環(huán)境而不能被認(rèn)為是類腫瘤組織；④2D培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏3D細(xì)胞培養(yǎng)支架的空間深度和細(xì)胞連接性，無法支持細(xì)胞維持適當(dāng)?shù)慕M織功能，而實(shí)體腫瘤耐藥性的產(chǎn)生與其三維立體的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[2,3]。因此，用2D細(xì)胞評估的藥物功效、藥代動(dòng)力學(xué)、作用機(jī)制、毒性不良反應(yīng)、遺傳毒性和致癌性等并不總能準(zhǔn)確預(yù)測人類患者的真實(shí)反應(yīng)。

使用2D培養(yǎng)模型進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選，越來越被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤耐藥/腫瘤惡化及抗癌治療失敗的主要原因。因?yàn)椋w內(nèi)存在的實(shí)體瘤是一個(gè)3D細(xì)胞團(tuán)，所有細(xì)胞均處于3D空間之中，包括增殖旺盛的細(xì)胞、靜止細(xì)胞和壞死組織等，具有明顯的異質(zhì)性，可使腫瘤耐藥物性提高[4]。而目前使用較多的2D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)未能真實(shí)地模擬出腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)所處的狀態(tài)，往往造成耐藥性消失。而3D腫瘤細(xì)胞模型卻易產(chǎn)生耐藥性[5，6]。另外，動(dòng)物模型的組織微環(huán)境與人類不同，也存在無法控制的變量，這限制了在分子水平上理解疾病進(jìn)展的機(jī)制的定量分析。藥物測試結(jié)果提示，動(dòng)物模型可能由于種間差異而不能準(zhǔn)確預(yù)測人類患者的結(jié)果[7]。并且在藥物篩選領(lǐng)域的評價(jià)技術(shù)中，動(dòng)物篩選模型存在種屬差異和周期長，裸鼠飼養(yǎng)條件苛刻，價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。而且動(dòng)物模型和體內(nèi)研究都存在不可預(yù)測的特性和倫理認(rèn)同的問題。因此，建立一個(gè)在生理上相對真實(shí)的3D模型變得十分重要。

二、三維(3D)腫瘤模型與藥敏試驗(yàn)及藥物研發(fā)

3D細(xì)胞培養(yǎng)是繼2D細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型之后的第3個(gè)模型，在創(chuàng)建含有活細(xì)胞的復(fù)雜支架方面顯示出明顯的優(yōu)勢，同時(shí)它也是一種低成本，高通量和高重現(xiàn)性的有效方法。由細(xì)胞聚集形成的多細(xì)胞腫瘤球體模型因簡單易用而被認(rèn)為是3D癌癥模型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]。3D體外癌癥模型提供了維度和生理相關(guān)度高于常規(guī)2D模型的方法，更便于研究致瘤及耐藥現(xiàn)象。與2D模型比較，3D模型在細(xì)胞增殖，基因表達(dá)和抗癌藥物反應(yīng)方面都表現(xiàn)出了與實(shí)體瘤更為相似的行為，更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的自然生長環(huán)境，人體活細(xì)胞的生物打印可在體外進(jìn)行更有效真實(shí)地復(fù)制，可用于高通量藥敏試驗(yàn)及新藥開發(fā)篩選[9，10]。研究表明，與2D癌細(xì)胞培養(yǎng)模型比較，3D培養(yǎng)癌細(xì)胞間的相互作用明顯增強(qiáng)，具有更強(qiáng)的抗輻射和抗化學(xué)活性，顯示了異質(zhì)性的增加和對細(xì)胞凋亡抗性的提高[11，12]。

惡性腫瘤的異質(zhì)性可導(dǎo)致不同個(gè)體治療效果相去甚遠(yuǎn)，其耐藥性是影響化療治療效果和預(yù)后的重要因素，這將對常規(guī)診斷及患者管理決策造成影響，造成診斷不一致和治療性抵抗，以及造成化療藥物的多藥耐藥和嚴(yán)重的藥物毒性不良反應(yīng)等缺陷，是腫瘤化療失敗的主要原因[13，14]。因此，建立合適的體外3D耐藥模型是耐藥研究的關(guān)鍵所在，體外腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)尤為重要，將為惡性腫瘤的個(gè)體化治療提供有力的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。從而實(shí)現(xiàn)“個(gè)體化”化療以取代經(jīng)驗(yàn)性、盲目性化療。

與傳統(tǒng)的二維單層比較，3D腫瘤球狀體模型更忠實(shí)地再現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤的宏觀結(jié)構(gòu)，能更好地反映體內(nèi)腫瘤的生長和發(fā)育情況，是一種更接近體內(nèi)癌細(xì)胞病變特性的腫瘤模型，可更準(zhǔn)確地預(yù)測藥物在體內(nèi)的治療效果，對腫瘤學(xué)研究、癌癥個(gè)體化治療和抗癌藥物研發(fā)等都會產(chǎn)生重要的促進(jìn)作用[15]。并可對抗癌藥物的篩選、作用和抵抗進(jìn)行分析，具有重要的臨床意義[14]。

事實(shí)上，越來越多的癌癥研究正在利用3D培養(yǎng)模型，并且觀察到許多與傳統(tǒng)2D模型明顯不同的反應(yīng)。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NSC 23766在三維水凝膠中刺激了U87 GBM細(xì)胞的遷移，而在二維單層培養(yǎng)基中抑制了細(xì)胞的活性，表明3D水凝膠研究腫瘤細(xì)胞侵襲的優(yōu)勢。此外，Eguchi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，基于納米培養(yǎng)板的3D環(huán)境使細(xì)胞能夠形成類多能干細(xì)胞腫瘤體，并在形態(tài)和基因表達(dá)水平上更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)腫瘤狀態(tài)。先進(jìn)的體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)克服了許多2D系統(tǒng)的局限性，比較真實(shí)地反映腫瘤體內(nèi)的情況。因此，細(xì)胞在3D條件下更能代表其在體內(nèi)條件下的響應(yīng)，藥物篩選更有效。體外3D腫瘤模型替代現(xiàn)有2D腫瘤模型用于藥物篩選與藥物研發(fā)是腫瘤藥篩技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。

三、3D打印腫瘤模型的發(fā)展

腫瘤組織是由微環(huán)境中生存的惡性細(xì)胞與基質(zhì)組成，基質(zhì)在癌癥惡化中起著關(guān)鍵作用。因此，光有3D是不夠的，還需要建立一個(gè)對細(xì)胞有觸發(fā)性的微環(huán)境，用于腫瘤間質(zhì)微組織的構(gòu)建[18]。3D打印技術(shù)通過將計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)逐層沉積生物墨水(生物材料基質(zhì)與細(xì)胞混合)來制造復(fù)雜3D生物結(jié)構(gòu)，并將具有3D結(jié)構(gòu)不同材料基質(zhì)的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在載體的3D空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成3D細(xì)胞-載體基質(zhì)復(fù)合物的一種方法[19]。

近年來，3D打印技術(shù)在組織工程等學(xué)科領(lǐng)域發(fā)展迅速。相比于來自2D培養(yǎng)、傳統(tǒng)組織工程3D模型及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤模型，3D生物打印的腫瘤模型具有如下優(yōu)點(diǎn)：①可以在打印前設(shè)計(jì)模型的大小和形狀;②可以根據(jù)打印機(jī)的噴嘴和相關(guān)匹配參數(shù)控制水凝絲的粗細(xì);③可以將幾種不同類型的細(xì)胞與材料基質(zhì)同時(shí)精確地組合打印;④可以在多層次上制作雙重分子(不同的營養(yǎng)與氧氣濃度)梯度。一方面，可以在生物打印的腫瘤樣組織上呈現(xiàn)內(nèi)部和外部雙分子梯度；另一方面，內(nèi)部和外部生物分子也可以呈現(xiàn)在水凝膠薄片中。因?yàn)殡p分子梯度在趨化性和癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在非黏附條件下細(xì)胞在水凝膠形成的球體中生長，形成營養(yǎng)和氧氣的梯度，更能模擬人體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)濃度，以及藥物篩選中藥物分子的濃度梯度。生物材料是組織工程的核心部分，可以提供促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖的分子和機(jī)械信號，并增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白沉積和組織形成?？赏ㄟ^精確設(shè)計(jì)，模擬體內(nèi)腫瘤組織，用于研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展，腫瘤異質(zhì)性，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，以及進(jìn)行抗癌藥物敏感性研究。

由于高通量篩選和細(xì)胞篩選模型與體內(nèi)環(huán)境差異大，藥物篩選準(zhǔn)確率低。因此，可用細(xì)胞3D打印技術(shù)制造仿真的組織器官模型，并構(gòu)建更準(zhǔn)確的藥物篩選模型。目前已經(jīng)開發(fā)了皮膚復(fù)制模型來模擬黑色素瘤，以研究腫瘤細(xì)胞球狀體的疾病機(jī)制和藥物篩選。有研究利用永生化肝細(xì)胞與ECM衍生水凝膠構(gòu)建的肝模型不僅可恢復(fù)部分肝功能，也可用于體外評估肝毒性的高通量藥物篩選。3D打印細(xì)胞培養(yǎng)模型將有助于抗癌新藥的鑒定，毒理學(xué)分析，以及精準(zhǔn)藥物的研發(fā)。

包含腫瘤微環(huán)境的多個(gè)特征并代表癌癥進(jìn)展的3D生物打印癌癥模型正在出現(xiàn)，并用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究，以及藥物篩選測試研究[20]。3D生物打印腫瘤模型在創(chuàng)建快速、廉價(jià)、高度仿真3D癌癥組織模型方面已邁出重要一步，為研究癌癥遷移提供了強(qiáng)有力的工具。利用創(chuàng)新的生物學(xué)方法和技術(shù)開發(fā)更復(fù)雜的系統(tǒng)用來研究腫瘤微環(huán)境，對于改進(jìn)藥物發(fā)現(xiàn)實(shí)踐及抗癌藥物研發(fā)至關(guān)重要。

藥敏試驗(yàn)及藥物計(jì)劃失敗的一個(gè)主要原因是缺乏臨床療效和相關(guān)毒性不良反應(yīng)問題。鑒于3D生物打印結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生更好的腫瘤組織模型，可以降低臨床前研究和藥物開發(fā)過程的成本。在臨床評估的重要階段，準(zhǔn)確的臨床前期治療效果和毒性不良反應(yīng)測定將降低新藥物的失敗率。在3D生物打印的人體器官上進(jìn)行藥物測試可以消除從臨床前動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)研究中得出不確定結(jié)論的可能性。為了準(zhǔn)確預(yù)測候選藥物在臨床試驗(yàn)中不需要的參數(shù)，可以使用各種現(xiàn)有的和新興的技術(shù)(模型)，例如球狀體，凝膠包埋培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)和3D組織模型等。預(yù)計(jì)技術(shù)創(chuàng)新將擴(kuò)大腫瘤工程的范圍，允許操縱特定于腫瘤的因素，從而促進(jìn)未來的癌癥藥物發(fā)現(xiàn)實(shí)踐。

四、展 望

雖然傳統(tǒng)3D腫瘤模型具有很高的應(yīng)用潛力，但是它存在固有的局限性，仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)之一是滿足組織工程應(yīng)用要求的理想材料仍難以捉摸，是目前最大的瓶頸。另外，傳統(tǒng)3D模型通常僅模擬單個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，或者腫瘤發(fā)生、發(fā)展的某個(gè)階段。

至今研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種方法來模擬復(fù)雜的3D癌癥模型，現(xiàn)在正在采取同時(shí)滿足腫瘤復(fù)雜性和異質(zhì)性的方案，這一努力將能夠使癌癥模擬的領(lǐng)域更加準(zhǔn)確和先進(jìn)。先進(jìn)的腫瘤建模有助于通過對新分子治療藥物的鑒定和(或)驗(yàn)證來解決腫瘤復(fù)雜性和異質(zhì)性問題，增加對新致癌驅(qū)動(dòng)因素和生物標(biāo)志物的理解，為腫瘤模型和生物標(biāo)志物開發(fā)鋪平道路。除了識別和評估新的化學(xué)實(shí)體外，更多創(chuàng)新的腫瘤模型在預(yù)測精密藥物，以及在患者個(gè)體化藥物治療功效方面得到真正體現(xiàn)。隨著科技的發(fā)展，將來有可能將整個(gè)腫瘤生態(tài)納入3D模型系統(tǒng)之中。總之，3D生物打印技術(shù)的進(jìn)步將為腫瘤研究開辟新的前沿，一個(gè)漸進(jìn)式臨床癌癥療法時(shí)代即將到來。