高密度發(fā)酵重組大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶

晏星辰，黃 璞，王鑫沂，姜艷芝，李斯斯，辛 松，江 凌，黃 和

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800；2.南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇南京211800； 3.南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇南京211800)

海藻糖是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證的功能性低聚糖，在食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)及精細化學品等領域都具有廣闊的市場前景和應用價值[1-2]。目前，工業(yè)上酶法生產(chǎn)海藻糖被廣泛應用，海藻糖合成酶(trehalose synthase，TreS)以麥芽糖為底物，通過分子內轉糖基一步催化反應生成海藻糖[3-4]。海藻糖合成酶的異源表達已經(jīng)有相當好的基礎。Wang等[5]在大腸桿菌BL21(DE3)中表達惡臭假單胞菌的海藻糖合成酶基因，轉化率可達59%；Chen等[6]構建的重組大腸桿菌海藻糖合成酶菌株，轉化率可達68%。通過進一步對發(fā)酵工藝優(yōu)化，快速、高效地獲得高質量的海藻糖合成酶，從而降低生產(chǎn)成本，成為非常有價值的課題。

高細胞密度發(fā)酵(high cell density cultivation，HCDC)是指在一定的條件和培養(yǎng)體系下，更多地或更高效地獲得細胞量，最終提高單位體積單位時間內目的產(chǎn)物的比生產(chǎn)率[7]。通常認為菌體密度超過50 g/L(以細胞干質量來計算，用DCW表示)即為高密度發(fā)酵。目前認為大腸桿菌最高的菌體密度為200 g/L[8-9]。高密度發(fā)酵大腸桿菌X90產(chǎn)胰蛋白酶，菌體密度可達92 g/L[10]；高密度發(fā)酵大腸桿菌HB101產(chǎn)青霉素?；?，菌體密度可達145 g/L，均極大地提升了產(chǎn)酶效率[11]。高密度發(fā)酵可以減少培養(yǎng)體積，縮短生產(chǎn)周期、減少設備投資，進而降低生產(chǎn)成本。高密度發(fā)酵重組大腸桿菌對發(fā)酵條件有非常高的要求。滿足細胞生長所需的營養(yǎng)物質、細胞生長過程中代謝抑制物的積累、培養(yǎng)溫度、pH、溶氧濃度、誘導方式和補料方式等都對高密度發(fā)酵有非常重要的影響[12-14]。其中最重要的則是補料方式的選擇，分批補料技術為目前普遍采用的發(fā)酵方式。分批補料方式包括非反饋補料法和反饋補料法[15-16]。非反饋補料法包括恒速流加補料法、變速流加補料法和指數(shù)流加補料法。其中，指數(shù)流加法可以比較精確地控制細胞的比生長速率，對細胞的生長和蛋白的表達效果較好。但是，它對發(fā)酵環(huán)境的適應性和調節(jié)性不強，不能根據(jù)發(fā)酵環(huán)境和菌體生長的變化作出相應的反饋調節(jié)。反饋補料法包括殘?zhí)菨舛确答伔?，恒溶氧反饋流加法和pH-stat反饋流加法。但是，反饋式補料法有一定的滯后性，無法進行精確的實時調控。因此，研究出既能克服非反饋補料法的適應性和調節(jié)性差的缺點，又能避免反饋補料法的滯后性的全新補料方式，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

本研究中，筆者首先在揺瓶中對高細胞密度發(fā)酵重組大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶的培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件和誘導條件進行確定，再在5 L發(fā)酵罐中對該菌進行批次補料的發(fā)酵實驗，最后采用變指數(shù)-恒pH法的發(fā)酵方式進行高密度發(fā)酵實驗，以期系統(tǒng)地優(yōu)化重組大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶高細胞密度表達的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

重組基因工程菌大腸桿菌BL21(Escherichiacoli)，筆者所在課題組構建，目的基因來自于異常球菌(Deinococcussp.)。

1.2 主要試劑

葡萄糖、麥芽糖、海藻糖標準品，Sigma公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；氨芐青霉素、異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1B(U)型生物凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；HYL-A型恒溫搖床，太倉市強樂實驗設備廠；GA88-II型超聲破碎儀，無錫上佳生物科技有限公司；UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀，Dionex公司；RI-101型示差折光檢測器，Shhodex公司。

1.4 主要溶液與培養(yǎng)基

IPTG(1 mmol/L)：10 mL無菌水溶解2 g IPTG，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃貯存。

氨芐青霉素(Amp,100 mg/mL)：10 mL無菌水溶解1 g氨芐青霉素鈉，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃貯存。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂 20 g，定容至1 L。滅菌冷卻后加入Amp母液，使其終質量濃度為50 mg/L。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，定容至1 L。接種時加入Amp母液，使其終質量濃度為50 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L(單配)、KH2PO413.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.39 g/L、酵母粉3 g/L、(NH4)2HPO44 g/L、NH4Cl 2.7 g/L、一水檸檬酸 1.89 g/L。微量元素為FeSO4·7H2O 5 mg/L、MnSO4·H2O 2 mg/L、ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L、CoCl21.6 mg/L。

1.5 試驗方法

1.5.1 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶

揺瓶培養(yǎng)：初始種子接入到含有50 mg/L的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。轉接體積分數(shù)2%的種子液到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp)中，溫度37 ℃，轉速200 r/min，培養(yǎng)種子6～7 h時，加入誘導劑IPTG，使其終濃度為0.8 mmol/L。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：在5、15和50 L發(fā)酵罐中裝入1/3體積的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，補料體積為1/3發(fā)酵罐體積。接種量5%。初始溶氧可控階段，通過串聯(lián)攪拌和通氣量使溶氧(DO)保持在15%以上，直至不可控。發(fā)酵初始pH為7.0，控制發(fā)酵pH維持在7.0±0.1。

指數(shù)流加：根據(jù)菌體生長需要營養(yǎng)物質和發(fā)酵液體積的變化，指數(shù)補料流加葡萄糖，控制平均比生長速率在0.1及0.2 h-1左右。

變指數(shù)-恒pH混合流加：在發(fā)酵開始階段，控制比生長速率0.2 h-1，在誘導階段控制比生長速率0.1 h-1，并在整個發(fā)酵過程中，保持pH恒定。

酶液的制備：發(fā)酵培養(yǎng)出來的發(fā)酵液經(jīng)離心、洗滌、1/2體積重懸。細胞懸液經(jīng)超聲破碎、離心之后獲得酶液。酶液保存于4 ℃，用作催化生產(chǎn)海藻糖。

1.5.2 海藻糖合成酶的酶活力測定方法

取麥芽糖試劑(化學純)5.4 g，溶解于100 mL、pH 7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，使其終濃度為150 mmol/L。800 μL麥芽糖溶液與200 μL細胞懸浮液混勻(每組3個平行)，1 mL反應體系在25 ℃反應30 min，之后沸煮8 min，用來滅酶。6 000 r/min離心8 min，取上清液用來測定得到的海藻糖的含量。

酶活力定義：在25 ℃下，每1 min生成1 μmol海藻糖所需要的海藻糖合成酶的量為1個酶活力單位U。

1.5.3 高效液相色譜法測定產(chǎn)物與底物

使用高效液相色譜法測定樣品中麥芽糖、葡糖糖和海藻糖的含量。測定條件為流動相V(乙腈)∶V(水)=3∶ 1，流速0.6 mL/min；選用氨基柱(柱溫35 ℃)，Shodex RI-101示差檢測器。

2 結果與討論

2.1 最佳接種時間的確定

分批培養(yǎng)種子的過程中，細胞從延滯期開始慢慢復蘇，之后進入比生長速率最大的對數(shù)生長期；進入發(fā)酵后期，細胞的增殖速度減慢甚至為負增長[17]。所以選擇對數(shù)生長的中后期為接種時間，此時細胞活力和質粒的穩(wěn)定性都較強，可以縮短發(fā)酵周期，降低染菌的可能性，保證重組蛋白的高效表達。通過搖瓶實驗測定一代種子和二代種子的生長曲線，以確定最佳接種時間，結果如圖1所示。

圖1 一代種子和二代種子生長曲線Fig.1 Growth curves of the first and second seed

由圖1可知：一代種子的2～8 h為菌體的對數(shù)生長期，二代種子的2～6 h為菌體的對數(shù)生長期。在對數(shù)生長期之后，菌體的比生長速率開始下降。因此，一代種子培養(yǎng)6～7 h即可接種，二代種子培養(yǎng)4～5 h即可接種，即當達到該體系下最大OD600的1/3至1/2時即可接種。由此可以看出，二代種子的活性明顯強于一代種子。為了避免傳代次數(shù)過多而導致質粒丟失，種子活化到二代即可。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖濃度的優(yōu)化

大腸桿菌高密度發(fā)酵使用的半合成培養(yǎng)基，其各成分的濃度及比例對發(fā)酵影響很大[18]。碳源是大腸桿菌高密度發(fā)酵的最關鍵因素，而目前最常用的碳源是葡萄糖。如果葡萄糖濃度過高，一方面會導致菌體生長過快，造成質粒丟失，影響目的蛋白的表達；另一方面，后期會抑制菌體生長，導致葡萄糖效應，使得菌體總量偏低[19]。筆者研究不同葡萄糖濃度對OD600和酶活的影響，結果如表1所示。

表1 葡萄糖質量濃度對OD600和酶活的影響

由表1可知：重組大腸桿菌在10 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中生長迅速，培養(yǎng)10 h后，菌體OD600達到5.6±0.3，海藻糖合成酶酶活也達到(3 245±250) U/mL，高于含5 g/L和15 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基所獲得的OD600和酶活。同樣的，培養(yǎng)基中初糖質量濃度為10 g/L時，重組大腸桿菌的菌體密度以及其他異源蛋白(如谷胱甘肽(GSH)、重組人骨形成蛋白-2A)的表達量亦均達到了高值[20-21]。研究表明，如果培養(yǎng)基中糖濃度過高，則會導致大量乙酸形成，而糖質量濃度超過50 g/L時，重組大腸桿菌的生長將受到抑制[22]。

2.2.2 氮源的選擇

除碳源外，培養(yǎng)基中的氮源對大腸桿菌發(fā)酵也有較大影響[23]。常用的氮源包括有機氮源和無機氮源。微生物吸收無機氮源快于有機氮源，但在含有有機氮源的培養(yǎng)基中常表現(xiàn)出生長旺盛、菌體濃度較高的特點。因此，筆者選用酵母粉、(NH4)2HPO4、NH4Cl、有機氮源和無機氮源相結合的培養(yǎng)基，不同氮源對OD600和酶活的影響，結果如表2所示。

表2 氮源對OD600和酶活的影響

由表2可知：選用有機氮源和無機氮源相結合的培養(yǎng)基，發(fā)酵10 h得到菌體OD600為5.2±0.1，酶活為(6 500±150) U/mL，高于只含單一有機氮源培養(yǎng)基得到的OD600和酶活。所以選擇有機氮源和無機氮源一起作為培養(yǎng)基的氮源，酵母粉3 g/L、(NH4)2HPO44 g/L、NH4Cl 2.7 g/L。

2.2.3 微量元素的選擇

表3 微量元素對OD600和酶活的影響

由表3可知：加入微量元素的培養(yǎng)基發(fā)酵10 h得到的OD600為5.2±0.3，酶活為(3 221±270) U/mL，高于不添加微量元素的培養(yǎng)基相同培養(yǎng)條件下得到的OD600和酶活。所以，培養(yǎng)基中添加一定濃度的微量元素。

2.3 培養(yǎng)條件及誘導條件的優(yōu)化

2.3.1 pH的優(yōu)化

培養(yǎng)基的初始酸堿度直接影響培養(yǎng)基中的物質和菌體中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響菌體對營養(yǎng)物質的新陳代謝[25]，大腸桿菌適合生長的pH為6.5～7.5，如果生長pH不在此范圍內，菌體的生長就會受到抑制甚至死亡。本實驗中，筆者考察發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為6.6、7.0和7.4時對菌體生長和蛋白表達的影響，結果如表4所示。

表4 pH對OD600和酶活的影響

由表4可知：初始pH 為7.0時，OD600達到5.2±0.3，酶活達到(3 345±250) U/mL，均高于初始pH 6.6和初始pH 7.4時的OD600以及酶活。尤其在偏堿性條件下，重組大腸桿菌質粒丟失嚴重，幾乎沒有酶活。因此，選用初始pH 7.0作為發(fā)酵條件。

2.3.2 誘導溫度的優(yōu)化

培養(yǎng)溫度是菌體生長和新陳代謝的重要因素。在不同發(fā)酵階段,基因工程菌的最適溫度需要綜合考慮。在菌體處于生長期、重組產(chǎn)物還沒有表達時，較高的溫度有利于菌體量的積累，并可縮短培養(yǎng)周期。較高培養(yǎng)溫度會降低基因工程菌的質粒穩(wěn)定性，并且較低的溫度培養(yǎng)能提高目的重組產(chǎn)物的表達量[26]。所以，發(fā)酵到目的重組產(chǎn)物表達時期，應該采用低溫培養(yǎng)。筆者研究不同溫度對OD600和酶活的影響，結果如表5所示。

表5 溫度對OD600和酶活的影響

由表5可知：本實驗在發(fā)酵生長期采用37 ℃條件培養(yǎng)菌體，在產(chǎn)物表達時期采用32 ℃條件誘導菌體。相較于采用37 ℃恒溫條件培養(yǎng)，OD600基本保持不變，但酶活有顯著提高。因為高溫條件下利于菌體生長，當菌體積累到一定數(shù)量時，發(fā)酵受到各種限制因子的影響，菌體數(shù)量不再增加。此時，采用低溫條件培養(yǎng)，菌體生長活性降低，將更多的能量用于自身蛋白的表達，有利于獲得更多的目的蛋白。因此，后期選用32 ℃作為誘導條件。

2.3.3 誘導劑添加時間的優(yōu)化

由于IPTG對菌體有毒害和增加菌體代謝負擔的作用，所以添加IPTG的時間對菌體的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的積累有直接影響。添加時間過早不利于獲得較高的生物量和產(chǎn)物總量，添加時間過晚，增加了發(fā)酵后期的生產(chǎn)成本。分別在發(fā)酵2、4和6 h，即分別為揺瓶最大生物量的1/6、1/2和2/3時添加IPTG，其他培養(yǎng)條件相同，發(fā)酵10 h，研究IPTG添加時間對OD600和酶活的影響，結果如表6所示。

表6 IPTG添加時間對OD600值和酶活的影響

由表6可知：發(fā)酵4 h時添加IPTG效果最佳，OD600為6.2±0.3，酶活為(6 345±250) U/mL；發(fā)酵2 h時添加IPTG，由于菌體濃度過低，IPTG對菌體的毒害效果顯著，導致菌體數(shù)量和酶活都非常低；而發(fā)酵6 h時添加IPTG，雖然對菌體數(shù)量沒有影響，但是由于菌體此時表達蛋白能力的降低和誘導時間的不足，獲得的酶活效果并不理想。如果增加誘導時間，則會導致發(fā)酵時間的增加，也增加了成本。因此選用OD600為最大生物量的1/2時添加IPTG。

2.4 分批發(fā)酵

經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)的初步研究，基本確定了培養(yǎng)的各個參數(shù)，但搖瓶的培養(yǎng)環(huán)境和參數(shù)與發(fā)酵罐相比相差很大。發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐對pH、溶氧等因素的可控程度很高。因此，先在5 L發(fā)酵罐上進行分批發(fā)酵實驗，作為發(fā)酵罐的分批補料發(fā)酵實驗的基礎，結果如圖2所示。

圖2 分批方式下重組大腸桿菌的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curves of recombinant E. coli underthe conditions of batch fermentation

由圖2可知：在發(fā)酵過程中，利用NaOH控制pH在7.0，通過攪拌和改變通氣量來維持溶氧20%以上，至達到攪拌和通氣量上限，便不再維持。由于pH值和溶氧在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中是可控參數(shù)，發(fā)酵罐中的環(huán)境特別適合菌體生長，菌體密度比揺瓶有了顯著提高。OD600達到12，酶活最終達到了(6 010±120) U/mL。發(fā)酵6 h，葡萄糖已經(jīng)基本消耗完畢，之后菌體生長放緩。由于營養(yǎng)物質缺乏，所以菌體密度和海藻糖合成酶活力還有很大的提升空間。此分批發(fā)酵實驗為分批補料奠定了基礎。

2.5 分批補料技術

2.5.1 指數(shù)流加法

分批補料技術是指在微生物分批發(fā)酵過程中流加一定營養(yǎng)物質，用來提高菌體密度和目的蛋白含量的技術[27]。Riesenberg等[28]采用非反饋分批補料技術中的指數(shù)流加法，控制大腸桿菌比生長速率為0.11 h-1，獲得110 g/L的生物量(以DCW計)。非反饋控制的系統(tǒng)中，物料的程序是預先設定的。但在實際培養(yǎng)過程中，菌體的生長不會和理論設想一致，非反饋補料法便不能發(fā)揮其原有的調節(jié)作用。因此，非反饋補料法靈活性不強，不能根據(jù)菌體生長的實際情況作出相應的調節(jié)，所以往往蛋白表達量不理想。表7為指數(shù)流加試驗結果。

表7 指數(shù)流加試驗結果

由表7可知，指數(shù)流加方式極大地提高了菌體密度。當比生長速率μ為0.2 h-1時，在較短的時間里獲得了較高的菌體密度。采用指數(shù)流加策略，可以控制基本恒定的比生長速率(0.2 h-1)。

2.5.2 變指數(shù)流加-恒pH法

圖3 5 L罐變指數(shù)流加-恒pH流加方式下重組大腸桿菌發(fā)酵曲線Fig.3 Fed-batch fermentation profiles using combinedfeeding strategy in 5-L fermentator

圖4 50 L罐變指數(shù)流加-恒pH流加方式下重組大腸桿菌發(fā)酵曲線Fig.4 Fed-batch fermentation profiles using combinedfeeding strategy in 50-L fermentator

由圖3可知：在發(fā)酵初始階段，首先采用指數(shù)流加培養(yǎng)(μ=0.2 h-1)，開始誘導時，降低比生長速率為μ=0.1 h-1，在整個發(fā)酵過程中，保持恒定的pH值在7.0左右，直到發(fā)酵結束。這種補料方式成功克服了單一流加方式的缺點，成功地避免了發(fā)酵過程中乙酸的大量積累，為大腸桿菌的高密度生長創(chuàng)造了條件。50 L罐的發(fā)酵結果如圖4所示。由圖4可知：由于50 L罐設備的環(huán)境更好，各個參數(shù)可控程度更高，溶氧充足，發(fā)酵32 h后，OD600達到97，酶活達到(24 000±350) U/mL，實現(xiàn)了大腸桿菌的高密度發(fā)酵。

3 結論

采用全新的變指數(shù)-恒pH法高密度發(fā)酵重組大腸桿菌，對生產(chǎn)海藻糖合成酶條件進行系統(tǒng)優(yōu)化。首先在揺瓶中，根據(jù)大腸桿菌高密度發(fā)酵條件范圍，對本實驗的基因工程菌進行培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和誘導條件的優(yōu)化。得到培養(yǎng)基組成：葡萄糖10 g/L(單配)，KH2PO413.5 g/L、MgSO47H2O 1.39 g/L，酵母粉3 g/L、(NH4)2HPO44 g/L、NH4Cl 2.7 g/L、一水檸檬酸 1.89 g/L。微量元素為FeSO4·7H2O 5 mg/L、MnSO4·H2O 2 mg/L、ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L、CoCl21.6 mg/L。發(fā)酵條件：二代種子培養(yǎng)4～5 h接種，pH 7.0，發(fā)酵初期溫度37 ℃，誘導溫度32 ℃，當達到發(fā)酵體系最大生物量的1/3～1/2時添加誘導劑。然后采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，在5 L和50 L發(fā)酵罐中，對該菌進行批次發(fā)酵和批次補料發(fā)酵實驗。最后確定變指數(shù)-恒pH法高密度發(fā)酵重組大腸桿菌，OD600達到97，海藻糖合成酶酶活達到(24 000±350) U/mL，實現(xiàn)了重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶。