基于超高效液相色譜法快速測(cè)定短鏈脂肪酸方法的建立

陳和地，任怡琳，耿 燕，許正宏

(1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

近年來，隨著基因文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序手段的革新，腸道微生物在各類疾病中扮演的重要角色也被人熟知。腸道微生物主要通過改變腸屏障功能、分泌代謝產(chǎn)物、改變腸黏膜通透性等途徑維持腸道微生態(tài)的穩(wěn)定及機(jī)體的健康[1]。隨著人們對(duì)腸道微生物研究的深入，高通量測(cè)序、PCR-DGGE技術(shù)、RT-PCR技術(shù)都被廣泛地應(yīng)用于腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的探究之中。同時(shí)，腸道微生物通過代謝各類膳食纖維、脂類等物質(zhì)后產(chǎn)生各種小分子代謝產(chǎn)物，在這些代謝產(chǎn)物中，短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)的產(chǎn)生、吸收及進(jìn)一步代謝愈來愈受到人們的關(guān)注。SCFAs是碳鏈不長(zhǎng)于6的有機(jī)酸，是腸道微生物參與宿主代謝的主要代謝產(chǎn)物，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和異己酸等[2]。SCFAs是結(jié)腸及小腸上皮細(xì)胞能量物質(zhì)[3]，可調(diào)控腸道表面pH，以維持腸道內(nèi)酸堿平衡[4]。SCFAs還可改善體內(nèi)炎性疾病(如飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的結(jié)腸炎)/呼吸道疾病和代謝綜合征甚至結(jié)腸癌癥[5-6]。隨著SCFAs在修復(fù)腸黏膜及促進(jìn)癌細(xì)胞分化與凋亡等方面的作用[7]被發(fā)現(xiàn)，建立快速、全面地檢測(cè)SCFAs的方法用于食品成分分析、評(píng)價(jià)不同食品攝入對(duì)機(jī)體的益生作用等具有重要意義。Ewaschuk等[8]發(fā)現(xiàn)，通過檢測(cè)生物基質(zhì)中SCFAs的變化可以反映出機(jī)體體內(nèi)厭氧菌的變化。因此，檢測(cè)復(fù)雜樣品(如糞便、發(fā)酵液、酒類和果蔬類等)中SCFAs的種類及其分布情況，在檢測(cè)微環(huán)境中相關(guān)菌群代謝變化、評(píng)估機(jī)體健康、篩選高產(chǎn)酸菌株以及評(píng)價(jià)樣品益生效果等方面都有十分重要的應(yīng)用。

SCFAs的測(cè)定方法早期測(cè)定采用滴定法，該法特異性不強(qiáng)、準(zhǔn)確度差。隨著色譜技術(shù)的快速發(fā)展，氣相色譜、高效液相色譜(HPLC)及毛細(xì)管色譜等方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于SCFAs的測(cè)定。但SCFAs極性大、揮發(fā)性強(qiáng)及其來源的生物樣品的復(fù)雜性也為其準(zhǔn)確定量增加了難度。為了快速了解樣品中SCFAs的變化，張萍等[9]采用反相梯度高效液相色譜技術(shù)在30 min內(nèi)完成了甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸和戊酸7種有機(jī)酸的分離；劉娟等[10]采用離子排斥色譜法在25 min內(nèi)對(duì)乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和異戊酸實(shí)現(xiàn)了分離；Gardana等[11]通過UHPLC-HR-MS法成功地在30 min內(nèi)完成對(duì)包含戊酸在內(nèi)的9種SCFAs進(jìn)行檢測(cè)。這些方法雖然都得到了應(yīng)用，但單次分析所耗時(shí)間較長(zhǎng)且所測(cè)SCFAs種類偏少，考慮到SCFAs的不穩(wěn)定性，不利于大批量分析。因此，如何快速全面地分析樣品中SCFAs的含量顯得十分重要。

超高效液相色譜法(UPLC)與傳統(tǒng)的HPLC方法相比，有高分離度、高靈敏度及高速率等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用UPLC方法可有效提高分析物的分離效果及分離所需時(shí)間，對(duì)代謝組學(xué)分析及其他領(lǐng)域的發(fā)展均有較大的促進(jìn)作用。本文中，筆者建立UPLC方法，快速檢測(cè)糞便和腸道微生物體外發(fā)酵液中SCFAs含量，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期用于評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的腸道健康及檢測(cè)糞便體外厭氧發(fā)酵液SCFAs的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

LC-30AD型超高效液相色譜儀、InertSustain AQ-C18色譜柱，Shimadzu公司。

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸、2-乙基丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、正己酸、戊二酸及己二酸，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈為HPLC級(jí)、實(shí)驗(yàn)用其他試劑均為分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為InertSustain AQ-C18(150 mm×2.1 mm,1.9 μm)，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為20 mmol/L NaH2PO4(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.2)與乙腈混合液。

1.2.2 樣品準(zhǔn)備

1)發(fā)酵液取樣、保存及預(yù)處理。取接種糞便微生物體外培養(yǎng)的發(fā)酵液，于1 000 r/min離心5 min，吸取上清至新的2 mL離心管中，于12 000 r/min離心5 min，吸取上清至新的2 mL離心管中，置于4 ℃下避光保存，等待預(yù)處理。

取1 mL發(fā)酵上清液，加入100 μL濃鹽酸后充分振蕩混勻，加入2 mL無水乙醚萃取20 min，于3 000 r/min離心5 min后取上清液，加入500 μL 1.0 mol/L NaOH萃取20 min，3 000 r/min離心5 min后取下層水相，加入100 μL濃鹽酸，0.22 μm水膜過濾后轉(zhuǎn)入液相瓶中待測(cè)[12-13]。

2)糞便取樣、保存及預(yù)處理。抓取適合周齡小鼠，取適量糞便，于-80 ℃凍存待測(cè)。取適量糞便(>50 mg)，按10 mL/g加入25%偏磷酸溶液，充分振蕩使其成勻漿態(tài)，靜置30 min，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清，0.22 μm水膜過濾后轉(zhuǎn)入液相瓶中待測(cè)[14]。

3)白酒、果汁預(yù)處理。取1 mL樣品，加入0.4 mL亞鐵氰化鉀(106 g/L)，0.4 mL硫酸鋅溶液(300 g/L)，振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，吸取上清過0.22 μm水膜過濾后轉(zhuǎn)入液相瓶中待測(cè)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

取適量標(biāo)準(zhǔn)品原液配制標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液(100 mmol/L),于4 ℃暫存。將含甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸、4-甲基戊酸、3-甲基戊酸、正戊酸、戊二酸及己二酸的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液(100 mmol/L)用超純水分別稀釋為100、50、25、10、5及2.5 mmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液。

1.2.4 線性關(guān)系

取不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品按優(yōu)化好的條件進(jìn)行檢測(cè)，將各SCFAs的峰面積(Y)與濃度(X)進(jìn)行線性評(píng)價(jià)。

1.2.5 回收率和精密度

將未檢出分析物的空白培養(yǎng)基配制為4種不同濃度的加標(biāo)樣品(75.0、50.0、5.0及2.5 mmol/L)，各濃度做5次平行實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)回收率及精密度。

將已知SCFAs的糞便樣品配制為4種不同濃度的加標(biāo)樣品(75.0、50.0、5.0及2.5 mmol/L)，各濃度做5次平行實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)回收率及精密度。

1.2.6 氣相色譜法檢測(cè)SCFAs含量

氣相色譜條件參照文獻(xiàn)[15]，色譜柱為DB-WAX 30M (0.32 mm，5 μm)，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃,程序升溫(50 ℃保持3 min后，以6 ℃/min的速率升溫至120 ℃，保持0.5 min后以6 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持5 min)，N2流量為3 mL/min，H2流量為47 mL/min，空氣流量為400 mL/min，分流比為1∶ 3，進(jìn)樣量為1.0 μL。

利用氣相色譜法及建立的UPLC方法對(duì)同一混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，對(duì)2種方法在保留時(shí)間、SCFAs的檢出數(shù)量等方面進(jìn)行比較，以考察UPLC法檢測(cè)的優(yōu)越性。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC方法的確定

對(duì)糞便及發(fā)酵液中SCFAs的測(cè)定方法已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2,11]，多采用氣相色譜法進(jìn)行探究，主要針對(duì)乙酸、丙酸和丁酸等幾種主要SCFAs進(jìn)行分析，而全面地對(duì)大部分含量較少但作用不可忽視的有機(jī)酸研究則較少。通過對(duì)梯度洗脫程序的優(yōu)化，同時(shí)兼顧樣品的分離度及保留時(shí)間，在0.5 mL/min流速下最優(yōu)的梯度洗脫條件如表1所示。

表1 SCFAs分析的UPLC洗脫程序

由表1可知，樣品檢測(cè)程序僅需10 min，在該條件下，各SCFAs均能較好地分離。色譜圖如圖1所示。

2.2 SCFAs標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

采用外標(biāo)法，以11種SCFAs的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示。

由表2可知：各SCFAs濃度為2.5～100 mmol/L時(shí)呈現(xiàn)較好的線性，回歸系數(shù)均高于0.999，可用于定量分析。所測(cè)定的相關(guān)系數(shù)(R2)及儀器檢出限(LOD，S/N=3),定量限(LOQ，S/N=10)見表2。

2.3 方法驗(yàn)證

由于生物基質(zhì)的復(fù)雜性，需要對(duì)建立方法進(jìn)行加標(biāo)回收率及精密度的檢測(cè)。以1.2.5節(jié)的方法用不同濃度(75.0、25.0、2.5和1.0 mmol/L)的11種SCFAs對(duì)糞便及空白培養(yǎng)基進(jìn)行加標(biāo)回收率及精密度評(píng)價(jià)，結(jié)果如表3所示。

由表3可知：加標(biāo)培養(yǎng)基中各SCFAs回收率為95.15%～107.01%，精密度為0.58%～7.33%，加標(biāo)糞便樣本中各SCFAs回收率為98.43%～105.14%，精密度為1.13%～5.20%。說明本方法有較好的準(zhǔn)確度與精密度，可用于糞便及接種糞便微生物體外發(fā)酵所得發(fā)酵液中SCFAs的測(cè)定。

2.4 UPLC法與常用氣相色譜檢測(cè)法對(duì)比

將所建立UPLC法與常用氣相色譜法對(duì)統(tǒng)一樣品進(jìn)行對(duì)比，色譜圖如圖2所示。

由圖2可知：氣相色譜法可以檢測(cè)出7種SCFAs，這些SCFAs的出峰時(shí)間主要集中于10～20 min；未檢出的SCFAs中，甲酸是較難檢測(cè)的有機(jī)酸，戊二酸及己二酸則是由于他們的沸點(diǎn)較高，己酸的出峰時(shí)間滯后，需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間才出峰。而UPLC方法可在10 min內(nèi)快速檢測(cè)11種SCFAs，能快速全面地對(duì)樣品中SCFAs含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1—甲酸；2—乙酸；3—戊二酸；4—丙酸；5—己二酸；6—正丁酸；7—異戊酸；8—正戊酸；9—3-甲基戊酸；10—4-甲基戊酸；11—正己酸；IS—2-乙基丁酸圖1 糞便與發(fā)酵液及其相應(yīng)加標(biāo)溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of fermentation broth,feces and their spiked samples

表2 11種SCFAs的保留時(shí)間、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢測(cè)限

Table 2 Retention time,linear ranges,correlation coefficients,detection limits,quantitative limits of SCFAs

組分保留時(shí)間/min線性范圍/(mmol·L-1)相關(guān)系數(shù)定量限/(mmol·L-1)檢測(cè)限/(mmol·L-1)甲酸0.943 8±0.0192.5～1000.999 90.760.25乙酸1.250 7±0.0112.5～1000.999 90.800.27戊二酸2.045 8±0.0242.5～1000.999 90.330.11丙酸2.251 5±0.0322.5～1000.999 80.810.27己二酸3.020 5±0.0172.5～1000.999 00.330.11正丁酸3.923 8±0.0192.5～1000.999 40.860.28異戊酸5.590 8±0.0072.5～1000.999 70.730.24正戊酸5.876 0±0.0102.5～1000.999 70.730.243甲基戊酸7.648 0±0.0152.5～1000.999 81.220.404甲基戊酸7.964 2±0.0452.5～1000.999 51.300.43正己酸8.440 0±0.0132.5～1000.999 51.550.51

表3 UPLC分析樣品中SCFAs的準(zhǔn)確度與精密度

1—甲酸；2—乙酸；3—戊二酸；4—丙酸；5—己二酸；6—正丁酸；7—異戊酸；8—正戊酸；9—3-甲基戊酸；10—4-甲基戊酸；11—正己酸；IS—2-乙基丁酸圖2 不同方法SCFAs色譜圖對(duì)比Fig.2 Chromatograms of short chain fatty acid by different chromatography methods

2.5 UPLC法測(cè)量發(fā)酵液及小鼠糞便中SCFAs分布

腸道微生物在宿主腸道中能利用碳水化合物、膳食纖維、脂肪酸等物質(zhì)進(jìn)行厭氧代謝，產(chǎn)生利于機(jī)體健康的小分子代謝產(chǎn)物。通過建立的方法可全面地比較不同疾病小鼠糞便中SCFAs的差異，進(jìn)而尋找與疾病相關(guān)的關(guān)鍵代謝物。此外，對(duì)腸道微生物體外發(fā)酵液測(cè)量SCFAs可用于篩選腸道菌群中產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株，對(duì)體外篩選菌株有較大的幫助。

根據(jù)1.2.2節(jié)的方法對(duì)糞便及發(fā)酵液樣品進(jìn)行預(yù)處理，再利用1.2.6節(jié)方法進(jìn)行UPLC檢測(cè)，樣品中各SCFAs含量如表4所示。同時(shí)對(duì)白酒及蘋果汁樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的除蛋白步驟，應(yīng)用文中所示方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。

由表4可知：在人、大鼠及小鼠的糞便中，乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸及正戊酸都有明顯的差異，表明不同宿主腸道微生物產(chǎn)生有機(jī)酸的能力有較大差異。糖尿病小鼠及高脂肥胖小鼠糞便SCFAs的含量差異也表明宿主在疾病狀態(tài)下，腸道中SCFAs會(huì)發(fā)生顯著性變化，影響宿主代謝。通過檢測(cè)糞便微生物體外發(fā)酵液中SCFAs的增加，可推測(cè)出產(chǎn)乙酸、丁酸微生物的富集時(shí)間。通過檢測(cè)發(fā)酵液中SCFAs含量，可確定各菌株的生長(zhǎng)周期，以提供體外篩選產(chǎn)酸菌株的最佳時(shí)間。此外，在白酒與蘋果汁樣本中應(yīng)用本方法也能快速檢測(cè)相應(yīng)的SCFAs含量，體現(xiàn)出本方法良好的應(yīng)用前景，對(duì)白酒釀造及果汁發(fā)酵過程中有機(jī)酸的檢測(cè)提供一定幫助。

表4 不同樣品中SCFAs分布情況

3 結(jié)論

本方法可用于快速、全面、準(zhǔn)確地檢測(cè)糞便或發(fā)酵液中11種有機(jī)酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、戊二酸、己二酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸及正己酸)的含量。樣品預(yù)處理程序主要利用液-液萃取法，無衍生化步驟，UPLC運(yùn)行時(shí)間為10 min，經(jīng)驗(yàn)證其線性、精度、準(zhǔn)確度、LOD和LOQ均處在指定范圍。因此，本方法可用于機(jī)體腸道代謝物的評(píng)價(jià)、體外厭氧菌群的篩選，還可用于酒類和果蔬中有機(jī)酸的檢測(cè)。