忍冬不同藥用部位活性成分的提取及含量分析

李 瓊

(徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校 制藥工程系，江蘇徐州221116)

忍冬(LonicerajaponicaThunb.)為忍冬科忍冬屬植物，其干燥花蕾或其帶有初開(kāi)的花部分被稱為金銀花[1]，又稱忍冬花，可供藥用；莖枝名忍冬藤，也可供藥用。忍冬在我國(guó)大部分地區(qū)多有分布，且不少地方已栽培生產(chǎn)，其中以河南、山東所產(chǎn)最為聞名。忍冬花性寒、味甘，適用于急性熱病的發(fā)熱、皮膚腫毒、咽喉腫痛等[2]。該藥材是我國(guó)衛(wèi)生部、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的貴重品種。近年來(lái)，忍冬花蕾在制藥、香料、化妝品、保健品和食品飲料等領(lǐng)域被廣泛使用。若忍冬的藤、葉和根部也能被開(kāi)發(fā)利用，將能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

目前，我國(guó)學(xué)者已對(duì)忍冬花蕾中的活性成分進(jìn)行了大量研究[2-5]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：忍冬花蕾中主要化學(xué)成分為有機(jī)酸及黃酮類化合物。還有大量研究表明：忍冬葉、藤和嫩根中都含有一定的黃酮、有機(jī)酸等化合物[2-5]。

有機(jī)酸被認(rèn)為是忍冬花蕾中主要起抗菌活性作用的化學(xué)物質(zhì)，也是鑒定及評(píng)價(jià)忍冬花蕾品質(zhì)的標(biāo)志性成分[6]。有機(jī)酸類化合物包括綠原酸、異綠原酸等?！吨袊?guó)藥典》2015年版第一部[1]規(guī)定：綠原酸干燥品質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于1.5%。綠原酸(chlorogenic acid，CHA)是一種多酚類化合物，該化合物除了可以溶解于水，尤其是熱水，還可以溶解于稀乙醇、丙酮等溶劑，是淡黃色的固體，在微酸條件下穩(wěn)定，分子式為C16H18O9，分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 綠原酸分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of CHA

黃酮類化合物泛指2個(gè)具有酚羥基的芳香環(huán)(A-與 B-環(huán))，通過(guò)中央3個(gè)碳原子互相聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為 2-苯基色原酮，常與糖結(jié)合成苷[7]。忍冬花蕾中主要的黃酮類物質(zhì)有木犀草苷、木犀草素和蘆丁等。其中，木犀草苷是用來(lái)區(qū)分忍冬花蕾與山銀花的標(biāo)志性化合物。

本研究以河南省封丘縣所產(chǎn)忍冬整株生藥作為研究對(duì)象，使用乙醇回流提取法、超聲波提取法和索氏提取法3種提取方法對(duì)忍冬的花蕾、藤、葉和根部分進(jìn)行提??；對(duì)提取物使用薄層色譜法(TLC)、紫外光譜法(UV)和高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行定性及定量分析。分析比較幾種提取方法對(duì)各部位的提取物中綠原酸和總黃酮含量的影響，以期為選擇適宜的提取方法提供依據(jù)，也為忍冬資源的綜合開(kāi)發(fā)和高效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

供試藥材為河南封丘縣黃德鎮(zhèn)所種植的忍冬(LonicerajaponicaThunb.)“金封一號(hào)”，采收于2015年11月底。為排除生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)其的影響，選擇生長(zhǎng)環(huán)境相似，長(zhǎng)勢(shì)相近且直徑為5 m內(nèi)的整株忍冬花蕾藥材作為研究對(duì)象。取若干株整株藥材，分階段干燥處理，根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法處理流程如下：

清洗除去異物泥土等→將生藥材的花蕾、藤、葉和根各部分分開(kāi)→30 ℃左右烘2 h→40 ℃左右烘8 h→50 ℃烘10 h→60 ℃烘至干透→研磨成粉末狀→過(guò)孔徑0.425 mm篩后備用。

無(wú)水乙醇、NaOH、HCl(均為化學(xué)純)，乙酸乙酯、乙酸(均為分析純)、超純水，徐州南試化學(xué)試劑公司；甲醇(色譜純)，合肥博美生物有限公司；250 mL圓底燒瓶、100 mL量筒，江蘇太倉(cāng)亞邦玻璃儀器廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FR10型超聲波發(fā)生器，杭州法蘭特超聲波科技有限公司；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠；300 g(精度0.01 g)電子天平，上海華潮電氣有限公司；TLC層析板，青島海晶化工廠；層析缸，自制；Gel Doc XR型Bio-Rad紫外成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)有限公司；10 μL移液槍，徐州南試化學(xué)試劑公司；100 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、100 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品鑒定所；10AVP-10AT型高效液相色譜儀(HPLC)，日本島津公司；T6型紫外(UV)-可見(jiàn)分光光度計(jì)，南京新中惠科學(xué)器材有限公司。

1.3 提取方法

1.3.1 加熱回流提取法

精密稱量忍冬花蕾、藤、葉和根部粉末各10 g，按料液比(g/mL)1∶ 8，分別用體積分?jǐn)?shù)為70%(下同)乙醇溶液混合。在pH為4.0、溫度恒定60 ℃的條件下振蕩回流提取2次，每次提取2 h。此時(shí)所得的提取液不僅濃度過(guò)低，而且還有鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。故先減壓真空抽濾，再加水沉淀上述雜質(zhì)。然后在50 ℃水浴下，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至10 mL(使得藥液中生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL)，經(jīng)121 ℃壓力蒸汽滅菌后冷藏于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 超聲波提取法

精密稱量忍冬花蕾、藤、葉和根部粉末各10.0 g，分別用少量體積分?jǐn)?shù)70%(下同)乙醇溶液將粉末預(yù)浸12 h；按料液比(體積比為1∶ 8)加入70%乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH為4.0，超聲(25 Hz)提取2次，每次0.5 h；同上先加水沉淀鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后在50 ℃水浴下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至10 mL(藥液中生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL)，經(jīng)121 ℃壓力蒸汽滅菌后冷藏于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 索氏提取法

精密稱量忍冬花蕾、藤、葉和根部粉末各10.0 g，按料液比(g/mL)1∶ 8，分別用70%乙醇溶液混合。用超聲波清洗器(25 Hz)處理0.5 h，在pH為4.0、溫度恒定60 ℃的條件下進(jìn)行索氏提取2次，每次提取2 h[9]。以上述方法沉淀操作后，在50 ℃恒溫水浴下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將提取液濃縮至10 mL(藥液中生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL)，經(jīng)121 ℃壓力蒸汽滅菌后冷藏于4 ℃冰箱備用。

為了方便后期數(shù)據(jù)處理，避免混淆和錯(cuò)誤，將3種方法對(duì)忍冬的4個(gè)藥用部位的提取物用代碼A、B、C分別表示(表1)。

表1 用不同提取方法提取忍冬不同藥用部位粗提方案的代碼

1.4 綠原酸的TLC鑒定

實(shí)驗(yàn)步驟：配制流動(dòng)相30 mL，V(乙酸乙酯)∶V(水)∶V(乙酸)為10∶ 3∶ 2；在層析缸中倒入適量流動(dòng)相，準(zhǔn)備表1中的粗提物A1～A4，B1～B4和C1～C4。取10 μL移液槍，逐一吸取以上粗提物溶液，分別點(diǎn)于不同TLC層析板上，待層析板揮發(fā)干后，將其置于層析缸內(nèi)層析，此過(guò)程需保證缸體密閉。20 min后取出層析板，置于通風(fēng)處，揮發(fā)干層析板溶劑后，利用Bio-Rad紫外成像系統(tǒng)獲取層析圖譜。

1.5 綠原酸的HPLC定量分析

1.5.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)的HPLC圖譜測(cè)定

按文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行HPLC測(cè)定。在9.89 min時(shí)檢測(cè)到的物質(zhì)為綠原酸，采用外標(biāo)法(圖2)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性分析。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of CHA standard

1.5.2 線性關(guān)系的考察和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液，精密配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取綠原酸質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL的溶液，設(shè)置進(jìn)樣體積分別為2、4、8、12、16和20 μL。

取已配制好的6個(gè)質(zhì)量濃度(2.0～12.0 μg/mL)的溶液，每個(gè)濃度的進(jìn)樣20 μL，按同樣的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(ρ)為X軸，峰面積(V)為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.5.3 重現(xiàn)性考察

精密稱取忍冬花干粉末6份，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇至刻度。用功率250 W、頻率35 Hz超聲處理30 min，放冷后用甲醇補(bǔ)足體積，搖勻后濾過(guò)，用移液管精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)樣6次。

1.5.4 精密度考察

取配制好的供試液，按上述同樣的色譜條件下進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)樣6次。

1.5.5 供試品溶液的制備

參照文獻(xiàn)[11]的方法，取以上3種提取方法所得的粗提物A1～A4、B1～B4和C1～C4，用移液管精密量取1 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W、頻率33 kHz)30 min，待冷卻后稱定質(zhì)量，使用50%甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻后濾過(guò)，準(zhǔn)確量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度即得。

1.5.6 供試品的測(cè)定

逐一量取待測(cè)樣品，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。然后根據(jù)峰面積及回歸方程計(jì)算各粗提物中綠原酸的濃度。

1.6 總黃酮的UV定量分析

1.6.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品37.50 mg(由于蘆丁易吸水受潮，為了準(zhǔn)確起見(jiàn)，稱量前需將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品放入120 ℃恒溫箱干燥至質(zhì)量恒定)，置于50 mL容量瓶中，加入適量95%乙醇溶解，超聲1～2 min助溶后用95%乙醇定容至50 mL，搖勻備用。

1.6.2 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

參照文獻(xiàn)[12]的方法：首先，準(zhǔn)備25 mL棕色容量瓶，精密量取上述已配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液后混勻；再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻；加入10%NaOH溶液10 mL，再加入 95%乙醇至25 mL，搖勻。取顯色后的溶液適量，于波長(zhǎng)400～600 nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)為505 nm。因此，確定505 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，配制0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的溶液，以95%乙醇溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸收度A，以質(zhì)量濃度(ρ)為X軸，吸收度(A)為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 樣品的制備

參照文獻(xiàn)[13]的方法：精密稱取3種提取方法提取的忍冬各部位的粗提物各10 mL，各取15 mL的乙酸乙酯加入粗提物中，混勻后萃取3次，取上層液，置于60 ℃水浴蒸干后得浸膏。將浸膏加入100 mL容量瓶，用0.5% Na2CO3溶液定容至刻度后，精密量取4 mL該溶液至250 mL容量瓶中，用0.5%Na2CO3溶液定容至刻度，搖勻備用[14]。

1.6.5 樣品的測(cè)定

取樣品溶液，以提取試劑為空白，在505 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次后計(jì)算平均值。

1.6.6 精密度試驗(yàn)

取忍冬花蕾樣品適量(以黃酮計(jì)約6.9 mg/mL)，顯色后測(cè)定5次。

1.6.7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的忍冬花蕾樣品1 mL，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，測(cè)定并計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠原酸的TLC定性測(cè)定結(jié)果

經(jīng)薄層色譜法(TLC)鑒定，層析20 min后，粗提物A1～A4、B1～B4和C1～C4的圖譜見(jiàn)圖3。由圖3可知：其比移值Rf值為0.68，分離效果較好；說(shuō)明此方法可以確定忍冬的花蕾、葉、藤和根部中均含有綠原酸。

圖3 綠原酸的TLC定性測(cè)定圖譜Fig.3 TLC qualitative determination of CHA

2.2 綠原酸的HPLC定量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系的考察結(jié)果

記錄不同進(jìn)樣量下峰面積的變化，進(jìn)樣量與峰面積對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表2。

表2 HPLC法線性關(guān)系考察

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(ρ)為X軸，峰面積(V)為Y軸作圖，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=51 794X-5 779，R=0.999 2。由此可知在2～12 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖4)。

圖4 綠原酸HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 CHA standard curve of HPLC

2.2.3 重現(xiàn)性的考察結(jié)果

在同等條件下將6份供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：綠原酸含量的RSD為2.47%，表明該方法重復(fù)性較好。

圖5 忍冬藤-乙醇回流提取的HPLC圖譜Fig.5 HPLC spectrum of honeysuckle-ethanol reflux extraction

表3 HPLC法的重復(fù)性考察

Table 3 Investigation of repeatability relationship by HPLC

序號(hào)藥物質(zhì)量/g峰面積/mm2綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%RSD/%11.003 49453.5821.003 59453.5931.006 69583.8041.001 29233.3751.005 59513.7661.005 69513.762.47

2.2.4 精密度的考察結(jié)果

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，在同等條件下測(cè)定并計(jì)算各成分峰面積的 RSD，結(jié)果表明：綠原酸峰面積的RSD為0.11%，說(shuō)明精密度良好。

2.2.5 供試品的測(cè)定結(jié)果

在同樣色譜條件下，逐一取待測(cè)樣品，進(jìn)樣測(cè)定峰面積。在9.957 min時(shí)檢測(cè)到的物質(zhì)為綠原酸，采用外標(biāo)法計(jì)算，由于樣品較多，僅選用乙醇回流提取的忍冬藤提取物的HPLC圖譜作為代表，結(jié)果見(jiàn)圖5。

根據(jù)測(cè)定的峰面積和回歸方程計(jì)算各粗提物中綠原酸的濃度，得3種提取法對(duì)忍冬各部位提取物中綠原酸的含量，在忍冬所有部位中均檢測(cè)到了綠原酸，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知：同一提取條件下，綠原酸的含量高低依次為花蕾、葉、藤、根部。提取效率最高的是索氏提取法，最低的是乙醇回流法。

2.3 總黃酮含量的UV法測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取配制好的質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的溶液，以95%乙醇溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度值，以質(zhì)量濃度(ρ)為X軸，吸光度(A)為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=12.124ρ-0.020 7(R2=0.999 7)，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系良好。

表4 HPLC法測(cè)定綠原酸含量

圖6 UV測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of rutin by UV

2.3.2 樣品的測(cè)定結(jié)果

取配制好的樣品溶液，以提取試劑為空白，在505 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次計(jì)算平均值。根據(jù)吸光度值計(jì)算黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知：同一提取條件下，總黃酮的含量高低依次為忍冬葉、花蕾、藤、根，以索氏提取法的提取效率最高，各部位的黃酮含量普遍較高。

表5 UV法測(cè)定總黃酮含量

2.3.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

取忍冬花蕾樣品適量(以黃酮計(jì)約6.9 mg/mL)，顯色后測(cè)定5次并計(jì)算RSD值，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知：黃酮濃度的RSD為0.65%，表明精密度良好。

表6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

取已知含量的忍冬花蕾樣品1 mL，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知：平均回收率為100.05%，RSD值為0.46%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)回收率較好。

表7 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

1)乙醇加熱回流法、超聲提取法和索氏提取法3種提取方法所得的粗提物，通過(guò)TLC定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這3種提取方法對(duì)忍冬的花蕾、葉、藤和根的粗提物中都檢測(cè)到了綠原酸。

2)3種提取方法所得的粗提物，通過(guò)HPLC法對(duì)各部位含有的綠原酸定量實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：綠原酸的含量從高到低依次為花蕾、葉、藤和根部。由此可知：綠原酸含量在花蕾中含量最高，符合《中國(guó)藥典》(2015版)規(guī)定。

3)3種提取方法所得的粗提物，通過(guò)UV法對(duì)各部位含有的總黃酮定量實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：各部位總黃酮的含量從高到低依次為葉、花蕾、藤和根部。由此可知：總黃酮含量在忍冬葉中含量最高。而忍冬葉的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于忍冬花蕾，約為花的10倍。如果能夠合理開(kāi)發(fā)利用忍冬葉，不僅可以節(jié)約能源，還能產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

4)提取效率從低到高排列是乙醇回流提取法、超聲提取法和索氏提取法。索氏提取法提取的忍冬花蕾、葉、藤和根部中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.7%、3.0%、3.2%和2.1%，總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.9%、9.2%、3.6%和1.9%。4個(gè)部位中所含的綠原酸都超過(guò)了《中國(guó)藥典》2015版中規(guī)定的1.5%?？梢?jiàn)選擇合適的提取方法，對(duì)于提高忍冬的綜合利用率很有好處。

綜上所述，本研究通過(guò)3種提取方法的對(duì)比，得出了提取效率最高的方法，為提高忍冬的提取效率提供了理論基礎(chǔ)。對(duì)比同一提取條件下整株忍冬不同部位中的綠原酸和總量酮含量，為忍冬的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。