重組酪氨酸酚裂解酶催化制備左旋多巴

賴秧秧，吳黎誠，周衛(wèi)國，吳杰群，儲消和

(1．浙江工業(yè)大學(xué)長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310014；2．浙江綠創(chuàng)生物科技有限公司，浙江湖州313200；3．浙江野風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，浙江金華322105)

左旋多巴(3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine，levodopa)是目前治療帕金森病最有效的藥物。目前，工業(yè)上制備左旋多巴一般是通過不對稱合成法[1]制得，但化學(xué)合成法大多需貴金屬催化劑、反應(yīng)條件嚴(yán)苛、底物特異性低[2]、轉(zhuǎn)化率低、立體選擇性低、工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高。從20世紀(jì)70年代開始，學(xué)者們就嘗試生物酶法替代化學(xué)合成法制備左旋多巴，包括酪氨酸酶(tyrosinase)[3-5](圖1(a))、酪氨酸酚裂解酶(TPL，EC 4.1.99.2)[6-8](圖1(b))和對羥基苯乙酸-3-羥基化酶(PAAH)[9](圖1(c))，它們均可用于生物酶法合成左旋多巴，但這幾條工藝路線均存在酶活較低、轉(zhuǎn)化不完全、獲得的產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)不到使用要求等問題。在上述三類酶中，酪氨酸酚裂解酶表現(xiàn)出相對較高的酶活力和生產(chǎn)效率，同時催化底物較為經(jīng)濟且容易大量獲得，是最具備工業(yè)開發(fā)潛力的酶。

圖1 3種酶催化合成左旋多巴Fig.1 Catalytic synthesis of levodopa by tyrosinase,TPL and PAAH

對TPL催化制備左旋多巴的研究可以追溯到20世紀(jì)60年代，并且至今延續(xù)著對它的研究熱度。TPL異源表達(dá)研究情況如表1所示，其產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率水平都在不斷提升。

表1 酪氨酸酚裂解酶制備左旋多巴概況

Wang等[14-16]研究發(fā)現(xiàn)，TPL催化生成左旋多巴體系中的底物丙酮酸會和產(chǎn)物左旋多巴發(fā)生非酶催化的Pictet-Spengler反應(yīng)，生成2種異喹啉副產(chǎn)物(圖2)。左旋多巴是芳香基乙基胺類衍生物，它與丙酮酸上的醛基發(fā)生縮合生成烯胺，活化后的烯胺再與富電子的苯環(huán)反應(yīng)生成新的碳碳單鍵，從而成環(huán)生成副產(chǎn)物Ⅰ。副產(chǎn)物對主反應(yīng)有抑制作用，可能導(dǎo)致酶催化反應(yīng)停止，降低底物轉(zhuǎn)化率，是影響酶催化生產(chǎn)左旋多巴的重要因素。目前還未有文獻(xiàn)報道能解決副產(chǎn)物生成的問題，這些副產(chǎn)物影響了TPL催化生產(chǎn)左旋多巴的工業(yè)化應(yīng)用。

本研究中，筆者將來源于弗氏檸檬酸菌的TPL在大腸桿菌中異源表達(dá)，并以此為基礎(chǔ)，研究不同反應(yīng)條件對TPL催化反應(yīng)的影響以及通過控制副產(chǎn)物生成，以優(yōu)化酶催化生產(chǎn)左旋多巴的工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)依據(jù)。

圖2 2種副產(chǎn)物生成反應(yīng)Fig.2 Isoquinoline by-products reactions

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

酪氨酸酚裂解酶基因tpl(GenBank登錄號CP022049.1)來源于弗氏檸檬酸菌，由常州基宇生物科技有限公司優(yōu)化密碼子并化學(xué)合成，連接于pUC18質(zhì)粒。表達(dá)載體采用pKK223-3，宿主大腸桿菌BL21(DE3)為浙江綠創(chuàng)生物科技有限公司保藏菌株。

1.1.2 主要試劑與工具酶

T4 DNA連接酶，Thermo Scientific；限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和HindⅢ，New England BioLabs(NEB)公司；質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒，Axygen公司；抗生素，Aladdin公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒，BBI Life Sciences。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10;pH 7.0。

TB培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L、酵母提取物24 g/L、K2HPO472 mmol/L、KH2PO417 mmol/L、甘油4 g/L。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

LC-2030C型高效液相色譜儀，島津公司；Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，安捷倫公司；InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，島津公司；PCR儀，Applied Biosystems公司；EPS-300型電泳儀、HE90型瓊脂糖電泳槽、HE120型蛋白電泳槽、3500型凝膠成像系統(tǒng)，Tannon公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒pUC-TPL經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaⅠ/Hind Ⅲ雙酶切并用純化試劑盒回收TPL基因片段。與SmaⅠ/Hind Ⅲ雙酶切的質(zhì)粒pKK223-3連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKK223-TPL，熱擊法[17]轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性的LB固體平板，挑選陽性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌BL21(DE3)/pKK223-TPL，并酶切和測序驗證。

1.2.2 TPL基因的誘導(dǎo)表達(dá)

從新鮮平板上挑取單菌落接種至LB培養(yǎng)基(50 mL(250 mL錐形瓶)，50 mg/L氨芐青霉素)，在37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)過夜后，接至TB發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L(5 L錐形瓶)，50 mg/L氨芐青霉素)，在37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)至菌體OD達(dá)2～4時，加終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為25 ℃。誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后，菌液于4 000 r/min離心30 min，收集菌體。TPL為胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物，菌體經(jīng)凍融破胞作為粗酶。菌體經(jīng)超聲破胞進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳驗證。

1.2.3 酶催化生成左旋多巴及酶活的測定

酶催化條件：乙酸銨20 g/L、丙酮酸鈉10 g/L、鄰苯二酚12 g/L、Na2SO32 g/L、EDTA 1 g/L、PLP 0.05 g/L，氨水調(diào)pH 8.0，在15 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)15 min，取樣用磷酸調(diào)pH 2.5終止反應(yīng)[13]。

酶活力(U)的定義：在相應(yīng)的轉(zhuǎn)化條件下，每分鐘催化生成1 μmol的產(chǎn)物所需的酶量。酶活通過式(1)計算。

(1)

式中：ρ為左旋多巴質(zhì)量濃度，g/L；V為反應(yīng)體積，L；Mr為左旋多巴分子量(197.19)，g/mol；t為反應(yīng)時間，min；m為投入菌體質(zhì)量，g。

左旋多巴和鄰苯二酚的測定方法為HPLC法：島津LC-2030C型高效液相色譜儀；色譜柱為安捷倫Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)；流動相為水和乙腈，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210 nm，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。0～1.5 min，V(乙腈)∶V(純水)=5∶ 95；2.5～3.5 min，V(乙腈)∶V(純水)=40∶ 60；4.5～6.0 min，V(乙腈)∶V(純水)=5∶ 95。

左旋多巴采用標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)計算含量。本液相方法分析時間短，能同時分析產(chǎn)物和底物，效率高。

1.2.4 不同反應(yīng)條件對酶活的影響

銨鹽及其濃度對TPL酶活性的影響：反應(yīng)體系分別加入 0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mol/L的硫酸銨、乙酸銨、氯化銨，考察銨鹽及其濃度對酶活性的影響。

金屬離子對TPL酶活的影響：在反應(yīng)體系中分別加入1.0 mmol/L的不同金屬離子(Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、K+、Li+、Mg2+、Mn2+、Ni2+和Zn2+)，考察金屬離子對TPL酶活力的影響。

pH對TPL酶活性的影響：在不同的pH(7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6和 8.8)條件下測定酶活，考察pH對酶活的影響。

pH對TPL酶穩(wěn)定性的影響：將菌體分別置不同pH(7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6和 8.8)的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中12 h，每隔1 h檢測一次菌液pH，并調(diào)整pH使之維持在設(shè)定值。12 h后離心回收菌體，然后在同一條件下全細(xì)胞催化檢測酶活，考察TPL酶的pH穩(wěn)定性。

溫度對TPL酶活性的影響：在不同的溫度(15、25、35、45和55 ℃)條件下，測定TPL酶活，考察溫度對TPL酶活的影響。

溫度對TPL酶穩(wěn)定性的影響：將菌體分別置于不同溫度(15、25、35、45和55 ℃)條件下的水浴鍋中保溫12 h，離心回收菌體，然后在同一條件下全細(xì)胞催化檢測酶活。

1.2.5 催化條件對反應(yīng)過程中副產(chǎn)物生成的影響

在鄰苯二酚質(zhì)量濃度為12 g/L的條件下，考察不同質(zhì)量濃度(5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 g/L)丙酮酸鈉對反應(yīng)過程中副產(chǎn)物生成的影響，補料反應(yīng)12 h。

考察不同pH(7.0、7.25、7.5、7.75和8.0)對反應(yīng)過程中副產(chǎn)物生成的影響，補料反應(yīng)12 h，每隔0.5 h檢測一次反應(yīng)體系pH，并調(diào)整pH使之維持在設(shè)定值。

考察不同溫度(15、20、25、30和35 ℃)對反應(yīng)過程中副產(chǎn)物生成的影響，補料反應(yīng)12 h。

副產(chǎn)物測定方法：島津LC-2030C型高效液相色譜儀，色譜柱為島津InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為V(0.1%的三氟乙酸水)∶V(四氫呋喃)=97∶ 3，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，時間為30 min。

由于無副產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，采用內(nèi)標(biāo)法檢測副產(chǎn)物濃度，選用的內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二酚，具體計算見(2)～(4)。

(2)

(3)

nb=nb1+nb2

(4)

式中：nb1為生成副產(chǎn)物Ⅰ的量，mol；nb2為生成副產(chǎn)物Ⅱ的量，mol；Sb1為副產(chǎn)物Ⅰ峰面積；Sb2為副產(chǎn)物Ⅱ峰面積；Si為鄰苯二酚峰面積；ni為消耗鄰苯二酚的量，mol；nb為副產(chǎn)物總量。

1.2.6 酶轉(zhuǎn)化制備左旋多巴

綜合酪氨酸酚裂解酶酶活、酶穩(wěn)定性和副產(chǎn)物產(chǎn)生情況，選擇最適宜轉(zhuǎn)化左旋多巴的條件制備左旋多巴，考察底物轉(zhuǎn)化左旋多巴的效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證

雖然pET系列載體的T7啟動子功能強大、專一性強，是當(dāng)今研究者們設(shè)計原核表達(dá)的首選，但是TPL是一個四聚體酶，太強的啟動子會使TPL在細(xì)胞內(nèi)的折疊和組裝速度跟不上其表達(dá)速度。載體pKK223-3的啟動子為tac啟動子，強度適中，表達(dá)速度與蛋白質(zhì)的折疊、組裝的速度較匹配，更有利于TPL的異源表達(dá)。筆者挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒雙酶切，進(jìn)行電泳驗證，結(jié)果見圖3。由圖3可知：酶切后得到大小分別為1 410 bp與4 553 bp的片段，分別與TPL和pKK223-3基因片斷大小相符。結(jié)合測序結(jié)果，證實表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 pKK223-TPL質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.3 Nucleic acid electrophoresis of pKK223-TPL cutby SmaⅠ and Hind Ⅲ

2.2 酪氨酸酚裂解酶SDS-PAGE驗證

已知酪氨酸酚裂解酶編碼基因大小1 410 bp，編碼470個氨基酸，預(yù)測分子量為5.17×105。工程菌大腸桿菌BL21 (DE3)/pKK223-TPL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收得菌體，超聲破胞，SDS-PAGE驗證，結(jié)果見圖4。由圖4可知，發(fā)現(xiàn)蛋白電泳圖譜中，分子量5.00×105附近有特異性條帶出現(xiàn)，且表達(dá)量相當(dāng)高，與酪氨酸酚裂解酶的蛋白分子量大小一致。

圖4 SDS-PAGE法分析大腸桿菌BL21(DE3)/pKK223-TPL表達(dá)產(chǎn)物Fig.4 Expression product of E. coli BL21(DE3)/pKK223-TPL by SDS-PAGE analysis

2.3 反應(yīng)條件對酪氨酸酚裂解酶酶活的影響結(jié)果

2.3.1 銨鹽對酪氨酸酚裂解酶酶活的影響

圖5 不同銨鹽對酪氨酸酚裂解酶酶活的影響Fig.5 Effects of ammonium salts on TPL enzyme activity

2.3.2 金屬離子對酪氨酸酚裂解酶酶活的影響

金屬離子對TPL的活性影響十分顯著?？疾觳煌x子對TPL酶活的影響，由于反應(yīng)體系本身含有大量Na+，因此本文中筆者未考察Na+對TPL酶活的影響，以1.2.3節(jié)的條件測得的酶活(1 260 U)為對照，計算各條件下的相對酶活，結(jié)果見圖6。

圖6 金屬離子對酪氨酸酚裂解酶酶活的影響Fig.6 Effects of metal ions on TPL enzyme activity

由圖6可知：K+、Li+、Mg2+、Ca2+和Mn2+對TPL酶活有激活作用，其中K+的激活作用最佳，此時酶活達(dá)1 537 U，而Co2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+和Zn2+對酶活有不同程度的抑制作用。因此，可以選用K+為TPL催化制備左旋多巴的激活劑。

2.3.3 酪氨酸酚裂解酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

pH對TPL活性和穩(wěn)定性的影響十分明顯?？疾靝H對酶活的影響，以及酶在該pH條件下的穩(wěn)定性變化，并以pH 8.0條件下測得的酶活(1 260 U)為對照，計算各pH條件下的相對酶活和酶活保留值，結(jié)果見圖7。由圖7可知：TPL的最適反應(yīng)pH為8.4，此時酶活達(dá)1 606 U。推測在此條件下，酶活性中心、底物和輔酶的解離程度最適它們的結(jié)合。然而堿性越強，酶越容易失活，隨著反應(yīng)pH的升高，酶的穩(wěn)定性快速下降。

圖7 酪氨酸酚裂解酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性Fig.7 Optimal reaction pH and pH stability of TPL

2.3.4 酪氨酸酚裂解酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

溫度對酶活性有很大的影響?？疾觳煌瑴囟葘PL酶活的影響以及酶在該溫度條件下的穩(wěn)定性變化，以15 ℃條件下的酶活(1 260 U)為對照，計算各溫度條件下的相對酶活和酶活保留值，結(jié)果見圖8。由圖8可知：TPL的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，此時酶活達(dá)1 581 U。隨著溫度升高，酶的穩(wěn)定性下降，尤其當(dāng)溫度高于45 ℃后，穩(wěn)定性顯著下降，酶大量失活。

圖8 酪氨酸酚裂解酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.8 Optimal reaction temperature andtemperature stability of TPL

2.4 考察催化條件對反應(yīng)過程中副產(chǎn)物生成的影響

TPL催化生產(chǎn)左旋多巴的反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物會抑制酶催化反應(yīng)，因此，應(yīng)盡量提高底物轉(zhuǎn)化率，減少副產(chǎn)物的生成，保證左旋多巴的產(chǎn)量。Enei等[10]認(rèn)為2種異喹啉副產(chǎn)物的生成是產(chǎn)物左旋多巴和底物丙酮酸發(fā)生了非酶催化反應(yīng)，丙酮酸濃度、pH和溫度等是影響副產(chǎn)物生成的主要因素。筆者考察了上述幾種影響因素對副產(chǎn)物生成的具體影響，為工業(yè)上TPL生產(chǎn)左旋多巴提供進(jìn)一步指導(dǎo)。

本文所用的HPLC方法中，副產(chǎn)物的出峰情況如圖9所示。由圖9可知：副產(chǎn)物Ⅰ和副產(chǎn)物Ⅱ的保留時間分別為5.4 min和5.8 min，在這個HPLC方法中，產(chǎn)物左旋多巴和底物鄰苯二酚的保留時間分別為7.1 min和27.5 min。

圖9 HPLC法檢測副產(chǎn)物Fig.9 Analysis of by-products by HPLC

2.4.1 丙酮酸鈉濃度對副產(chǎn)物生成的影響

丙酮酸是生成副產(chǎn)物的底物，丙酮酸濃度越高，副產(chǎn)物生成速度越快。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，副產(chǎn)物累積得越多，對TPL的抑制作用越明顯，在維持鄰苯二酚濃度不變的條件下，考察了丙酮酸鈉濃度對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖10。由圖10可知：當(dāng)反應(yīng)過程控制鄰苯二酚12 g/L、丙酮酸鈉質(zhì)量濃度小于7.5 g/L時，底物轉(zhuǎn)化率均大于95%；當(dāng)丙酮酸質(zhì)量濃度較低(小于7.5 g/L)時，雖然底物轉(zhuǎn)化率高，但是多巴的產(chǎn)量并不高；當(dāng)增加丙酮酸質(zhì)量濃度(大于7.5 g/L)時，副產(chǎn)物累積明顯，反應(yīng)受抑制，多巴產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率隨之降低。因此，反應(yīng)過程控制鄰苯二酚12 g/L、丙酮酸鈉7.5 g/L，既能保證左旋多巴的產(chǎn)量，又能兼顧底物的轉(zhuǎn)化率。

圖10 丙酮酸鈉濃度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.10 Effects of sodium pyruvate concentration and the conversion rate

2.4.2 反應(yīng)pH對副產(chǎn)物生成的影響

經(jīng)典的Pictet-Spengler反應(yīng)通常發(fā)生在酸性條件下，而在中性或弱堿性條件下，以酚類化合物作為Pictet-Spengler反應(yīng)的底物生成異喹啉產(chǎn)物的反應(yīng)，反應(yīng)的區(qū)域會選擇性消失[18]，副產(chǎn)物的類型明確?？疾觳煌琾H對轉(zhuǎn)化率和副產(chǎn)物生成的影響，結(jié)果見圖11。由圖11可知：pH 7.0～8.0范圍內(nèi)，隨著pH升高，副產(chǎn)物生成量增加，底物轉(zhuǎn)化率降低，左旋多巴產(chǎn)量則在pH 7.5達(dá)到最大值。綜合考慮pH對TPL酶活和穩(wěn)定性的影響，建議反應(yīng)過程中控制pH 7.25～7.5。

圖11 pH對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.11 Effects of reaction pH on the conversion rate

2.4.3 反應(yīng)溫度對副產(chǎn)物生成的影響

溫度升高對副產(chǎn)物生成的促進(jìn)作用尤其明顯，特別是促進(jìn)副產(chǎn)物Ⅰ脫羧生成副產(chǎn)物Ⅱ。考察反應(yīng)溫度對副產(chǎn)物生成的影響，結(jié)果如圖12所示。由圖12可知：在所考察溫度范圍內(nèi)，酶的穩(wěn)定性相近，酶活應(yīng)隨溫度升高而增加，然而在反應(yīng)過程中，左旋多巴的產(chǎn)量卻并沒有呈遞增趨勢，在25 ℃出現(xiàn)最大值，副產(chǎn)物產(chǎn)量反而呈遞增趨勢。因此，為了減少副產(chǎn)物的生成，提高底物轉(zhuǎn)化率與左旋多巴產(chǎn)量，應(yīng)降低反應(yīng)溫度，將反應(yīng)溫度控制在不高于25 ℃為宜。

圖12 溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.12 Effects of reaction temperatureon the conversion rate

2.5 最佳條件酶催化制備左旋多巴

基于以上研究結(jié)果，本研究確定了TPL催化制備左旋多巴的轉(zhuǎn)化體系：乙酸銨31 g/L(約0.4 mol/L)、丙酮酸鈉7.5 g/L、鄰苯二酚12 g/L、Na2SO32 g/L、EDTA 1 g/L，0.1 mmol/L K+為激活劑，反應(yīng)總體積為500 mL，反應(yīng)條件為pH 7.5、20 ℃、200 r/min，反應(yīng)結(jié)果見圖13。反應(yīng)過程中取樣經(jīng)液相分析計算剩余底物濃度，通過補加等量的固體鄰苯二酚和丙酮酸鈉，維持體系鄰苯二酚(12±2) g/L、丙酮酸鈉(7.5±2) g/L、乙酸銨(31±2) g/L，補加過程見圖14。由圖14可知：在此條件下，反應(yīng)12 h，最終鄰苯二酚總消耗量約69.4 g時，每升反應(yīng)體系的左旋多巴產(chǎn)量達(dá)122.8 g，底物鄰苯二酚的轉(zhuǎn)化率達(dá)98.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)(表1)報道的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率。這說明，本研究所優(yōu)化的TPL催化制備左旋多巴的反應(yīng)條件與體系具有較好的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價值。

圖13 最佳條件酶催化制備左旋多巴Fig.13 Enzymatic preparation of levodopaunder optimal conditions

圖14 鄰苯二酚和丙酮酸鈉的補加過程Fig.14 Supplementary process of catecholand sodium pyruvate

3 結(jié)論

將來源于弗氏檸檬酸菌的酪氨酸酚裂解酶tpl基因在大腸桿菌BL21(DE3)異源表達(dá)，并考察反應(yīng)底物、金屬離子、pH及溫度等條件對酪氨酸酚裂解酶的酶活的影響，并考察丙酮酸鈉濃度、pH和溫度對反應(yīng)副產(chǎn)物生成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：丙酮酸濃度過高時容易生成副產(chǎn)物，不利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)；在降低丙酮酸的絕對濃度的同時，維持體系丙酮酸相對濃度低于鄰苯二酚濃度，這樣不僅能夠降低副產(chǎn)物的生成還有利于提高底物轉(zhuǎn)化率；雖然較高的反應(yīng)pH和溫度使左旋多巴的合成速度加快，但同時也會造成副產(chǎn)物的大量生成，加之酶穩(wěn)定性受到影響，不利于左旋多巴的工業(yè)化生產(chǎn)。

在pH 7.5、20 ℃條件下，控制鄰苯二酚12 g/L、丙酮酸鈉7.5 g/L，以0.4 mol/L乙酸銨為氨來源，0.1 mmol/L K+為激活劑時是左旋多巴的最佳合成條件。在最終確定的最佳轉(zhuǎn)化工藝條件下，反應(yīng)12 h，左旋多巴產(chǎn)量達(dá)到122.8 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)98.7%，高于目前已有研究報道的水平，具備工業(yè)化應(yīng)用潛力。