貴陽地區(qū)351株幽門螺桿菌藥物敏感性及pbp1多樣性分析

吳芳草，王 瓊，朱 鍵2，胡 越3，潘 科4，蔣 強4，雷靜靜3，劉 芳，文學(xué)琴，糜孟衡，王彩霞，崔古貞，陳崢宏

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種螺旋形、微需氧、革蘭氏陰性桿菌，是人類疾病最常見的慢性致病菌之一[1]，其感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤(MALT)的主要病因, 被認為是胃癌發(fā)生的Ⅰ類致病因子，發(fā)揮誘導(dǎo)和促進胃癌發(fā)生的作用[2]。國內(nèi)外公認的根除幽門螺桿菌治療方案是三聯(lián)療法或四聯(lián)療法[3]，即：質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor, PPI)和兩種抗生素聯(lián)合或PPI、鉍劑和兩種抗生素聯(lián)合(克拉霉素加阿莫西林、甲硝唑加阿莫西林、克拉霉素加甲硝唑等)。但隨著抗菌藥物的廣泛使用和幽門螺桿菌根除治療的普遍開展，該菌的耐藥率逐年上升，且表現(xiàn)出地區(qū)差異[4]。目前阿莫西林耐藥率相對較低，因此是臨床首選的治療幽門螺桿菌感染的β-內(nèi)酰胺類藥物。該藥物通過與細菌的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs)結(jié)合而干擾細菌細胞壁的合成，導(dǎo)致菌細胞裂解死亡[5]。但是，近年來不斷有關(guān)于幽門螺桿菌對阿莫西林耐藥的報道，探討其耐藥機制是幽門螺桿菌耐藥性研究熱點之一。有研究認為，PBP1突變是導(dǎo)致幽門螺桿菌阿莫西林耐藥的主要機制[6-7]，但不同國家不同地區(qū)報道的PBP1氨基酸序列的突變類型及位點存在較大差異。為了解本地幽門螺桿菌耐藥性，特別是對阿莫西林的耐藥性以及本地菌株P(guān)BP1多樣性和耐藥的關(guān)系，本課題對胃病患者胃黏膜分離的幽門螺桿菌進行了藥物敏感性檢測以及對阿莫西林耐藥株和敏感株的pbp1基因序列進行了檢測和分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1樣本來源 選取2016-2018年在貴陽市三家醫(yī)院(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、貴州省腫瘤醫(yī)院、貴航貴陽醫(yī)院)的上消化道疾病患者。納入標準：患者年齡18歲以上且內(nèi)窺鏡檢查前15 d沒有抗幽門螺桿菌治療。排除標準：近15 d內(nèi)接受過抗幽門螺桿菌治療；存在消化道大出血和幽門梗阻等并發(fā)癥；嚴重心、肺、腎功能不全患者。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院人體醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.1.2主要試劑及儀器設(shè)備 瓊脂培養(yǎng)基(Mueller-Hinton, MH；杭州天和微生物試劑有限公司)；尿素酶試紙(珠海市克迪科技開發(fā)有限公司)；抗生素標準品：克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、四環(huán)素、甲硝唑(中國藥品生物制品檢定所)；無菌脫纖維綿羊血(河南圣康生物科技有限公司)；幽門螺桿菌選擇性添加劑(英國 OXOID公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；微需氧產(chǎn)氣袋(日本三菱化學(xué)株式會社)；厭氧罐(日本三菱化學(xué)株式會社)；細菌組DNA提取試劑盒(北京天根生物工程有限公司)；PCR擴增儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)；冷凍高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)、鑒定 在胃內(nèi)窺鏡下取胃竇或胃體黏膜組織1塊，放入含20%蔗糖和10%胎牛血清的腦心浸出液(BHI)無菌保存液中低溫轉(zhuǎn)運至實驗室并在2 h內(nèi)進行處理。無菌操作將活檢標本充分剪碎至無明顯組織塊，接種到已加入幽門螺桿菌添加劑(萬古霉素、頭孢磺啶、甲氧芐氨嘧啶、兩性霉素B)且含10%無菌脫纖維綿羊血的MH培養(yǎng)基，置微需氧環(huán)境培養(yǎng)3～5 d，若平板上出現(xiàn)針尖樣大小、透明或半透明光滑潮濕的單菌落，則挑取單菌落傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)物通過革蘭染色、氧化酶、過氧化氫酶、脲酶試驗及幽門螺桿菌特異性16S rDNA PCR進行鑒定[8]。

1.2.2 幽門螺桿菌藥物敏感性試驗

1.2.2.1抗生素原液的制備 配制抗生素藥液，終濃度為1 000 μg/mL，-20 ℃保存。參照美國臨床實驗標準化協(xié)會(CLSI)指南[9]，不同生素的溶劑與稀釋劑不同，見表1。

1.2.2.2幽門螺桿菌菌懸液的制備 從MH血瓊脂平板上刮取培養(yǎng)72 h且狀態(tài)良好的幽門螺桿菌，以無菌生理鹽水制備菌懸液，菌液濃度相當于2.0麥氏單位(6×108CFU/ mL)。

表1 抗生素稀釋

Tab.1 Dilution of antibiotics

抗生素溶劑 稀釋劑克拉霉素(CLA)冰醋酸(AceticAcid)磷酸鹽(pH6.5,0.1mol/L)阿莫西林(AMX)磷酸鹽(pH6.0,0.1mol/L)磷酸鹽(pH6.0,0.1mol/L)四環(huán)素(TET)水(H2O)H2O左氧氟沙星(LVX)氫氧化鈉(NaOH,0.1mol/L)H2O甲硝唑(MET)二甲亞砜(DMSO)H2O

1.2.2.3幽門螺桿菌臨床分離株的藥物敏感性試驗制備含藥的界值平板(含10%脫纖維羊血)，藥物濃度為：阿莫西林、克拉霉素和左氧氟沙星為1 μg/ mL, 四環(huán)素為2 μg/ mL，甲硝唑為8 mg/μL[10-12]。取10 μL菌液(濃度為6×108CFU/ mL)點種于含藥的MH血瓊脂平板上，每一菌株同時接種5種藥敏平板，同時取10 μL菌液點種于不含藥的MH血瓊脂平板上為對照，以標準菌株ATCC 26695(受贈于山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所)作為質(zhì)控菌株[13-14]。37 ℃微需氧培養(yǎng)，72 h觀察結(jié)果?？死顾亍⒛髁?、左氧氟沙星、四環(huán)素、甲硝唑的耐藥判斷標準：所有平板無污染，不含藥的MH血瓊脂平板上均生長，在耐藥界值平板上生長判為耐藥，未生長判為敏感。

1.2.3幽門螺桿菌pbp1基因突變的檢測及分析

1.2.3.1pbp1基因引物序列pbp1基因引物序列見參考文獻[15]，由生工生物(上海)科技有限公司合成。各基因引物序列如下：pbp1，正向引物5′-GCGTCTAATGAAGATGAAGA-3′，反向引物5′-TTAAAGTCCCTATAGCCATG-3′。

1.2.3.2pbp1基因片段的PCR擴增 選擇幽門螺桿菌阿莫西林耐藥株20株和敏感株20株，以細菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株新鮮培養(yǎng)物基因組DNA，采用NanoDrop2000超微量紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度。以提取的幽門螺桿菌基因組DNA模板，PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×TaqPCR Master MIX 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 6 μL，H2O 15 μL。pbp1基因PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性1 min；55 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.3.3pbp1基因片段的測序和氨基酸序列分析 PCR產(chǎn)物送生工生物(上海)科技有限公司進行測序，將所得序列在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行BLAST后采用DNAStar軟件將DNA序列轉(zhuǎn)換為氨基酸，分別與GenBank中幽門螺桿菌ATCC 26695的PBP1氨基酸序列進行比對并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件對單一耐藥組、雙重耐藥組和多重耐藥組耐藥率最高的抗生素或抗生素組合的耐藥率進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1幽門螺桿菌臨床分離株藥物敏感性 351株幽門螺桿菌藥敏檢測結(jié)果顯示：克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、甲硝唑和四環(huán)素5種藥物的耐藥率分別為34.60%、13.27%、40.28%、71.56%、17.06%，見表2。

表2 351株幽門螺桿菌臨床分離菌株藥敏試驗結(jié)果

Tab.2 Antibiotic susceptibility of 351H.pyloriclinicalisolates

抗生素耐藥菌株(n)敏感菌株(n)耐藥率/%CLA11623534.60AMX4930213.27LVX13521640.28LVX24011171.56TET6029117.06

注：CLA克拉霉素；AMX阿莫西林；LVX左氧氟沙星；LVX甲硝唑；TET四環(huán)素。

根據(jù)臨床菌株不同的耐藥情況分為單一耐藥組、雙重耐藥組、多重耐藥組和全敏感組，統(tǒng)計不同耐藥組合耐藥率。結(jié)果顯示貴陽地區(qū)全敏感率僅為14.5%；單一藥物耐藥菌株數(shù)占總菌株數(shù)的35.61%，雙重耐藥率占25.64%；多重(3種及以上藥物耐藥)耐藥占24.22%。單一耐藥組中耐藥率最高為甲硝唑(23.65%)，雙重耐藥組耐藥率最高組合為甲硝唑+左氧氟沙星(11.97%)，多重耐藥組耐藥率最高組合為甲硝唑+左氧氟沙星+克拉霉素(5.41%)，甲硝唑、甲硝唑+左氧氟沙星、甲硝唑+左氧氟沙星+克拉霉素的耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.42，P<0.01)，見表3。

表3 351株幽門螺桿菌不同藥物耐藥情況

Tab.3 Drug resistance of 351 strains ofHelicobacterpyloriin different groups

耐藥組合菌株數(shù)所占比例/%①抗生素耐藥菌株數(shù)耐藥率①單一耐藥12535.61CLA195.41AMX10.28LVX195.41TET30.85MET8323.65雙重耐藥9025.64CLA+AMX20.57CLA+LVX82.28CLA+TET20.57CLA+MET195.41AMX+MET61.71AMX+LVX20.57LVX+MET4211.97TET+MET92.56多重耐藥8524.22CLA+AMX+LVX61.71CLA+AMX+MET51.42CLA+LVX+MET195.41CLA+TET+MET82.28AMX+LVX+MET20.57AMX+TET+MET20.57LVX+TET+MET113.13CLA+AMX+LVX+TET20.57CLA+AMX+LVX+MET61.71CLA+AMX+TET+MET20.57CLA+LVX+TET+MET82.28AMX+LVX+TET+MET30.85CLA+AMX+LVX+TET+MET113.13全敏感5114.48CLA+AMX+LVX+TET+MET0-

注：① 該抗生素或抗生素組合在351株分離菌株中的耐藥率。

2.2貴陽地區(qū)幽門螺桿菌PBP1氨基酸序列的多態(tài)性 選取幽門螺桿菌阿莫西林耐藥株20株、敏感株20株、標準菌株ATCC26695的pbp1基因片段的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外檢測儀下觀察均可見分子量分別約為1 050 bp大小的DNA條帶。各臨床菌株pbp1序列經(jīng)DNAStar軟件翻譯為氨基酸后與ATCC26695的PBP1氨基酸序列比對，阿莫西林耐藥株及敏感株中PBP1氨基酸多態(tài)性分布為：D479E、N504D、M515I、D535N、S589G、K648Q、R649K；僅出現(xiàn)在阿莫西林耐藥株中而敏感株中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸差異包括：S543R、T556S、I563V、594插入G、596插入S、N641D、A611T、S638L，各菌株多態(tài)性見表4。

表4 40株H.pylori臨床分離株P(guān)BP1氨基酸多態(tài)性

Tab.4 Amino acids diversity of PBP1 in 40H.pyloriclinical isolates

多態(tài)性位點氨基酸差異敏感菌①(n=20)耐藥菌①(n=20)479D→E519504N→D516515M→I413535D→N614543S→R015556T→S03563I→V04589S→G616594插入G08596插入S05611A→T03638S→L04641N→D012648K→Q617649R→K517

注：① 列下各數(shù)字為在該位點存在多態(tài)性的菌株數(shù)。

3 討 論

幽門螺桿菌感染被認為是消化系統(tǒng)最常見的細菌感染之一[16]，其耐藥性的流行程度在不同國家、不同地區(qū)有所不同，并且許多國家的耐藥率在不斷增加。Ghotaslou[17]等對2009—2014年來自PubMed，MEDLINE，Science Direct，Google Scholar和Scielo manuscripts，關(guān)于全球地區(qū)幽門螺桿菌抗生素耐藥性的研究進行了系統(tǒng)性回顧，得出了部分抗生素的耐藥性趨勢，結(jié)果表明甲硝唑總體對幽門螺桿菌的耐藥率為47.22%(30.5%～75.02%)，克拉霉素為19.74%(5.46%～30.8%)，左氧氟沙星為18.94%(14.19%～25.28%)，阿莫西林為14.67%(2%～40.87%)，四環(huán)素為11.70%(0%～50%)，呋喃唑酮為11.5%(0%～23%)，利福布汀為6.75%(1%～12.45%)。在我國，韓一凡[18]等通過檢索共725篇相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，在全國范圍內(nèi)，左氧氟沙星耐藥率為8.9%，甲硝唑耐藥率為83.7%，克拉霉素耐藥率為20.8%，阿莫西林耐藥率為8.7%，四環(huán)素耐藥率為7.6%，呋喃唑酮耐藥率為7.0%。而各類抗生素耐藥率在南北方地區(qū)有所區(qū)別，例如，在北方地區(qū)，左氧氟沙星耐藥率為17.7%，在南方為7.5%，北方地區(qū)耐藥率明顯高于南方；在北方地區(qū)，甲硝唑耐藥率為51.7%，在南方為88.6%，南方地區(qū)耐藥率明顯高于北方；而克拉霉素耐藥率在南北地區(qū)相似。四川省幽門螺桿菌對左氧氟沙星、克拉霉素的耐藥率分別為32.05%和30.76%[19]；上海地區(qū)幽門螺桿菌對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐藥率為分別19.8%、57.0%和29.1%[20]；山西省幽門螺桿菌對甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、呋喃唑酮的耐藥率分別為75.3%、7.4%、7.4%、12.4%和8.6%[21]。本研究顯示，貴陽地區(qū)分離株除了甲硝唑耐藥率略低于國內(nèi)的耐藥率，阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率均高于國內(nèi)平均耐藥率，其原因之一為抗生素不合理使用，尤其是存在無處方亦可購買到抗生素的現(xiàn)象。左氧氟沙星和甲硝唑的高耐藥率也與此類藥物廣泛應(yīng)用于各種肺部感染、口腔疾病以及婦科疾病等有關(guān)，導(dǎo)致耐藥率逐年增加[22-23]。與文獻[24-25]報道一致,四環(huán)素的耐藥率相對較低，與其對牙齒和骨骼的毒性作用及在臨床較少使用有關(guān)。本研究中351株幽門螺桿菌的四環(huán)素耐藥率為17.06%，并且單一耐藥較少，多為多重耐藥，提示細菌藥物外排泵機制在其耐藥形成中有重要意義。阿莫西林的原發(fā)性耐藥十分罕見[26]，因此也是目前臨床首選的治療幽門螺桿菌感染的抗生素。但本實驗351株幽門螺桿菌阿莫西林的耐藥率達到13.27%，除了與抗生素濫用有關(guān)，也與阿莫西林的廣譜抗菌作用使得阿莫西林的使用率逐漸增加有關(guān)[27]。

近年來，幽門螺桿菌出現(xiàn)多發(fā)性和混合性感染[28]，多重耐藥現(xiàn)象也不斷出現(xiàn)[11]，有報道嘉興市4年間有586株幽門螺桿菌出現(xiàn)了對2種抗生素混合耐藥，雙重耐藥率高達34.45%，以克拉霉素和甲硝唑雙重耐藥率最高，為15.23%[29]；青島地區(qū)臨床分離的幽門螺桿菌株雙重耐藥率最高是克拉霉素和左氧氟沙星組合(10.40%)[30]；浙江地區(qū)甲硝唑和克拉霉素雙重耐藥率也較高，為15.47%[31]。本研究顯示，貴陽市三家醫(yī)院幽門螺桿菌的雙重耐藥率達到25.64%，其中甲硝唑和左氧氟沙星混合耐藥率最高為11.97%。可見不同地區(qū)幽門螺桿菌的雙重耐藥都較為嚴重，但不同地區(qū)最為嚴重的耐藥組合稍有差異。而本研究的351株幽門螺桿菌三重耐藥達到24.22%，嚴重影響本地區(qū)抗幽門螺桿菌治療藥物的選擇。本實驗結(jié)果提供了近期貴陽幽門螺桿菌耐藥數(shù)據(jù)，對于本地治療該菌感染選擇抗菌藥物有一定的參考價值。

綜合文獻，目前幽門螺桿菌對阿莫西林較為敏感，也是臨床首選的藥物，但是耐藥率也有增加的趨勢，因此阿莫西林耐藥機制是近年來幽門螺桿菌耐藥性研究的熱點之一。大多數(shù)研究認為青霉素結(jié)合蛋白的突變是導(dǎo)致幽門螺桿菌對阿莫西林耐藥的主要原因[5]。青霉素結(jié)合蛋白是細菌的一種特殊膜蛋白，具有糖基轉(zhuǎn)移酶和?；D(zhuǎn)肽酶活性，參與肽聚糖的生物合成。轉(zhuǎn)肽酶功能域中有3個青霉素結(jié)合基序是β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合的關(guān)鍵序列，這些序列的突變將導(dǎo)致PBPs與阿莫西林親和力下降而發(fā)生耐藥[6]。β-內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合的3個關(guān)鍵性青霉素結(jié)合基序為：SXXK338-341，SXN402-404和KTG555-557[32]，Gerrits[33]等報道了在第二(SKN402-404)和第三(KTG555-557)保守的青霉素結(jié)合蛋白基序中或鄰近的幾個氨基酸變異可以介導(dǎo)其對阿莫西林耐藥。2003年，Dong H.Kown[7]通過對幽門螺桿菌阿莫西林耐藥株的DNA序列比對時發(fā)現(xiàn)，pbp1基因中發(fā)生36個堿基的突變導(dǎo)致了pbp1序列上10個氨基酸的替代，認為pbp1突變是導(dǎo)致該菌阿莫西林的重要機制。不同國家和地區(qū)幽門螺桿菌阿莫西林耐藥株的PBP1氨基酸多態(tài)性不同，如位點S414R和A480V突變僅發(fā)現(xiàn)于荷蘭；而韓國耐藥株中PBP1氨基酸突變主要包括T556S和N562Y；巴西耐藥株中PBP1氨基酸突變主要包括S417T和D508N。

本次研究發(fā)現(xiàn)，與幽門螺桿菌26695相比，幽門螺桿菌阿莫西林耐藥株及敏感株中PBP1氨基酸存在共同的差異，其中D479E位點氨基酸變化與文獻報道相同[34]，耐藥菌株與敏感菌株均存在此位點差異。本地菌株中，有8個PBP1氨基酸差異是阿莫西林耐藥株特有的，其中S543R出現(xiàn)頻率為75%，其次是N641D為60%。提示S543R為本地阿莫西林耐藥菌株P(guān)BP1氨基酸高頻突變位點，但這些僅在阿莫西林耐藥株中出現(xiàn)的氨基酸差異并非存在于所有耐藥株菌株，可能與多位點的聯(lián)合突變導(dǎo)致耐藥有關(guān)。本實驗室下一步計劃通過將耐藥菌pbp1基因轉(zhuǎn)化至敏感菌，以及構(gòu)建pbp1基因特定突變菌株，進一步明確某一個位點或幾個位點突變與阿莫西林耐藥之間的關(guān)系。在本實驗中，阿莫西林耐藥菌株多為多重耐藥菌株，這些菌株耐藥的機制可能不僅僅是由于pbp1等與藥物結(jié)合靶位相關(guān)的基因突變有關(guān)，還與細菌外排機制有關(guān)[7, 35-36]。

綜上所述，本地幽門螺桿菌耐藥較全國平均水平嚴重，并且雙重耐藥與多重耐藥在總體耐藥中所占比例較大，在臨床治療中應(yīng)重視菌株的分離培養(yǎng)和耐藥性檢測。阿莫西林耐藥菌株P(guān)BP1氨基酸存在多位點突變，與阿莫西林耐藥相關(guān)的突變值得進行深入研究，以期建立快速篩查阿莫西林耐藥菌，避免抗生素濫用。

利益沖突：無

引用本文格式：吳芳草，王瓊，朱鍵，等. 貴陽地區(qū)351株幽門螺桿菌藥物敏感性及pbp1多樣性分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35(7):587-593. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.092