芍藥湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織機(jī)械屏障及細(xì)胞因子的影響

陳大光，曹 暉，李 令，吳東升，劉震宇，陳鴻飛，田 娜

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，常以腹痛、腹瀉和黏液膿血便反復(fù)發(fā)作為臨床表現(xiàn)[1]。本病屬于中醫(yī)學(xué)“痢疾”“休息痢”“泄瀉”“腸澼”范疇，基本病機(jī)為脾失健運(yùn)、濕熱內(nèi)生、內(nèi)蘊(yùn)腸腑、氣血瘀滯。因此，在治療上應(yīng)以清熱燥濕、調(diào)和氣血為主。芍藥湯為古今臨床治療本病的經(jīng)驗方[2]，有清熱燥濕解毒、調(diào)氣和血、促進(jìn)腸道潰瘍愈合的作用，臨床療效顯著，但是其作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在基于結(jié)腸組織機(jī)械屏障和炎癥細(xì)胞因子角度，探討芍藥湯治療UC的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 41只SD大鼠，雌性20只，雄性21只，體質(zhì)量(150±20)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2016-0002]。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物中心實驗室，飼養(yǎng)溫度為24～26℃，濕度為50%～70%。

1.2 藥物 ①芍藥湯按鄧中甲主編的《方劑學(xué)》[2]中確定的藥物組成和劑量：芍藥30 g，當(dāng)歸、黃連、黃芩各15 g，大黃9 g，檳榔、木香、炙甘草各6 g，肉桂5 g。所有中藥飲片均購自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)水煎煮2次，混合過濾后，濃縮制備成含藥濃度為1 g/mL的藥液，經(jīng)滅菌后置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆?。②對照藥物：美沙拉嗪緩釋顆粒劑(批號 H20143164，上海愛的發(fā)制藥有限公司)，用9.0 g/L氯化鈉注射液配成21 mg/mL的溶液備用。③用于復(fù)制模型的藥物：2，4，6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)，美國Sigma;50%乙醇。

1.3 主要儀器 Leica UC7超薄切片機(jī)：德國Leica；Ultra 45°鉆石切片刀：瑞士Daitome；HT7700透射電子顯微鏡：日本Hitachi；其他所需耗材均為國產(chǎn)。

1.4 主要試劑 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)試劑盒(批號 201803)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4)試劑盒(批號 201803)、內(nèi)毒素(endotoxin, ET)試劑盒(批號 201803)：武漢基因美生物技術(shù)有限公司；電鏡固定液(貨號 G1102)：武漢賽維爾生物科技有限公司；812包埋劑(貨號 90529-77-4)：美國SPI；其他試劑均為國產(chǎn)。

2 方法

2.1 UC模型復(fù)制與動物分組 按照文獻(xiàn)[3]的方法，采用TNBS/乙醇法復(fù)制UC模型。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)抽取31只大鼠(雌性15只，雄性16只)，禁食、不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉成功后，采取頭低腳高位，將直徑約2 mm聚乙烯管，自肛門緩慢插入直腸約8 cm，灌入TNBS原液100 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，取頭低尾高位，呈20°～30°角，持續(xù)30 s，放置籠中，清醒后自由飲食，及時觀察大鼠情況。

將31只UC模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為3組：模型組(n=10)、美沙拉嗪組(n=10)、芍藥湯組(n=11)，剩余10只為空白對照組。4組均以普通飼料喂養(yǎng)，飲用蒸餾水。模型復(fù)制后第7天，空白對照組、模型組各隨機(jī)抽取2只大鼠剪取結(jié)腸組織病理切片后進(jìn)行模型評價。第8天開始，對各組大鼠進(jìn)行灌胃給藥，每日1次，連續(xù)1周。美沙拉嗪組每日給予美沙拉嗪混懸液0.42 g/kg灌胃。芍藥湯組每日給予芍藥湯濃縮液11.24 g/kg，每次灌胃容積均為3 mL?？瞻讓φ战M、模型組大鼠均灌胃生理鹽水3 mL。灌胃給藥7 d后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)將動物麻醉，無菌操作，經(jīng)腹正中線剖腹，從腹主動脈取血，立即全血離心(3 000 r/min)2 min后分裝血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。于肛門上端8 cm處，剪取病變結(jié)腸組織約2 cm，縱向剖開，生理鹽水清洗，備用。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 一般情況觀察 實驗開始后每天觀察大鼠體質(zhì)量、血便情況、泄瀉程度、UC活動指標(biāo)等，并按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)評分。

2.2.2 DAI評分 包括體質(zhì)量下降情況、大便性狀和血便。①體質(zhì)量下降0，計0分；下降1%～5%，計1分；下降5%～10%，計2分；下降10%～15%，計3分；下降15%以上，計4分。②大便性狀：正常，計0分；大便松散，計2分；稀便，計4分。血便：無血便，計0分。③大便隱血：陽性，計2分；肉眼血便，計4分。

2.2.3 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察 環(huán)形切取結(jié)腸組織1 cm，采用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，石蠟包埋制片，切片脫蠟處理后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色。用顯微鏡觀察切片標(biāo)本有無潰瘍面、充血、腸絨毛排列情況以及炎癥細(xì)胞浸潤等變化。按照病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[5]對結(jié)腸組織形態(tài)進(jìn)行評分：結(jié)腸組織無明顯損傷，計0分；損傷表面上皮，計1分；黏膜層潰瘍，固有層炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層水腫，計2分；透壁性炎癥和潰瘍，上皮變形壞死脫落，計3分；透壁性炎癥和潰瘍，略見正常黏膜，計4分；透壁性炎癥和潰瘍，無正常黏膜，計5分。

2.2.4 血清TNF-α、IL-4和ET表達(dá)水平檢測 采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-4和ET表達(dá)水平。

2.2.5 結(jié)腸組織緊密連接 透射電鏡下觀察結(jié)腸組織緊密連接形態(tài)，包括緊密連接連續(xù)性、擴(kuò)張程度及染色情況。

3 結(jié)果

3.1 各組UC大鼠一般情況比較 空白對照組大鼠自由飲食，排便正常，無黏液膿血便，體質(zhì)量持續(xù)上升。模型復(fù)制第2天開始，模型組、美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠均出現(xiàn)黏液血便，精神不振，食量下降，毛發(fā)散亂，體質(zhì)量逐漸下降。模型復(fù)制3 d后，大鼠體質(zhì)量下降至最低點，可見稀便，肉眼可見少量血絲、黏液。模型復(fù)制7 d，從空白對照組、模型組各隨機(jī)抽取2只大鼠，取結(jié)腸組織，作病理切片后進(jìn)行模型評價。模型復(fù)制9 d，灌胃失誤致模型組1只大鼠死亡。給藥后美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠體質(zhì)量逐漸回升，大便黏液肉眼血便減少，逐漸成形，進(jìn)食增加，精神和毛發(fā)情況逐漸好轉(zhuǎn)。與模型組比較，美沙拉嗪組、芍藥湯組DAI評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠臨床癥狀較模型組減輕；美沙拉嗪組與芍藥湯組DAI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示美沙拉嗪與芍藥湯在緩解臨床癥狀方面作用相當(dāng)。見圖1。

注：A.空白對照組(n=8)；B.模型組(n=7)；C.美沙拉嗪組(n=10)；D.芍藥湯組(n=11)；與模型組比較，*P<0.05

圖1各組UC大鼠DAI評分比較

3.2 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化比較

3.2.1 肉眼下各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化比較 空白對照組大鼠結(jié)腸組織顏色淡紅，黏膜連續(xù)完整，無明顯充血水腫及潰瘍；模型組大鼠結(jié)腸組織距肛門7 cm處顏色發(fā)黑，伴有明顯的潰瘍面；美沙拉嗪組及芍藥湯組結(jié)腸組織7 cm以下可見黏膜充血，無明顯潰瘍面。見圖2。

圖2肉眼下各組大鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)比較

3.2.2 光鏡下各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化比較 空白對照組大鼠結(jié)腸上皮組織均完整，組織結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組黏膜層欠完整，可見一潰瘍面深達(dá)肌層，腺體排列不規(guī)則，大量炎癥細(xì)胞浸潤及明顯毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結(jié)腸組織上皮尚完整，黏膜層稍有缺損，無深達(dá)肌層的潰瘍面，有較多炎癥細(xì)胞浸潤，腺體排列尚規(guī)則，有毛細(xì)血管充血。見圖3。與模型組比較，美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結(jié)腸病理變化較模型組改善，而美沙拉嗪組與芍藥湯組大鼠結(jié)腸形態(tài)學(xué)評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.美沙拉嗪組；D.芍藥湯組

圖3光鏡下各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化比較(HE染色，10×40倍)

3.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-4、ET水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，芍藥湯組和美沙拉嗪組大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與美沙拉嗪組比較，芍藥湯組大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)。見表1。

注：A.空白對照組(n=8)；B.模型組(n=7)；C.美沙拉嗪組(n=10)；D.芍藥湯組(n=11)；與模型組比較，*P<0.05

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)評分比較表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-4、ET水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05

3.4 透射電鏡下各組大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接變化比較 電鏡下空白對照組大鼠結(jié)腸組織緊密連接形態(tài)完整、連續(xù)，無明顯擴(kuò)張及染色增強(qiáng)現(xiàn)象。模型組大鼠結(jié)腸組織緊密連接形態(tài)尚完整連續(xù)，但有明顯擴(kuò)張增寬現(xiàn)象，周圍可見大量染色帶包裹。美沙拉嗪組及芍藥湯組大鼠結(jié)腸組織緊密連接形態(tài)尚完整連續(xù)，擴(kuò)張增寬現(xiàn)象較模型組輕，周圍有少量染色帶。結(jié)果表明模型組較空白對照組緊密連接明顯破壞，與UC模型大鼠的臨床表現(xiàn)相符。與模型組比較，美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結(jié)腸組織緊密連接形態(tài)破壞情況明顯減輕。見圖5。

4 討論

炎癥反應(yīng)與黏膜屏障損傷是UC病程中的重要病理變化[6-8]。IL-4是機(jī)體中關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子之一，其失調(diào)可能導(dǎo)致一系列炎癥疾病狀態(tài)，包括UC[9]。IL-4是關(guān)鍵的Th2細(xì)胞因子，并且用于指導(dǎo)免疫應(yīng)答，在活動期UC中，IL-4能在大量浸潤單核細(xì)胞的損傷部位聚集。TNF-α是一種加速炎癥發(fā)展并促成炎癥腸病發(fā)病的細(xì)胞因子[10]，IL-4、TNF-α可能導(dǎo)致患者腸上皮單層細(xì)胞受損，上皮細(xì)胞缺失，杯狀細(xì)胞耗竭，炎癥細(xì)胞浸潤，水腫形成，出血和血管擴(kuò)張[11]。腸黏膜表面上皮細(xì)胞形成的選擇性滲透屏障具有營養(yǎng)物質(zhì)交換和宿主防御功能。這些功能依賴于完整的腸上皮細(xì)胞層，這些細(xì)胞層由細(xì)胞側(cè)膜上的細(xì)胞-細(xì)胞附著物通過緊密連接和附近的粘附連接構(gòu)成[12]。緊密連接具有選擇性地允許某些離子物質(zhì)的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，可特異性調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性、細(xì)胞旁屏障功能，從而限制細(xì)胞旁擴(kuò)散過程及調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通道功能[13]。因此，當(dāng)UC發(fā)生時，機(jī)體炎癥反應(yīng)釋放大量炎癥因子，損傷腸上皮細(xì)胞緊密連接，破壞腸黏膜機(jī)械屏障，ET經(jīng)破損的腸黏膜進(jìn)入機(jī)體，二次損傷腸黏膜，從而加重臨床癥狀。目前國際上UC管理指南中已公認(rèn)美沙拉嗪為治療UC的臨床一線用藥[14]。研究發(fā)現(xiàn)，美沙拉嗪能夠恢復(fù)腸道炎癥期間在TNF-α誘導(dǎo)下出現(xiàn)的E-鈣黏蛋白膜表達(dá)的喪失。且美沙拉嗪可以阻止TNF-α對p38MAPK途徑的下調(diào)作用，有效激活p38MAPK途徑，通過調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)途徑恢復(fù)黏膜腸上皮細(xì)胞屏障功能穩(wěn)態(tài)。緊密連接在維持腸黏膜上皮屏障功能穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，而將緊密連接蛋白募集到頂側(cè)膜是關(guān)閉細(xì)胞間隙的關(guān)鍵步驟。然而，緊密連接的合成在很大程度上依賴于黏附連接(如E-鈣黏蛋白)形成[15]。美沙拉嗪能通過干擾素-γ恢復(fù)E-鈣黏蛋白和β連環(huán)蛋白的膜定位促進(jìn)緊密連接的合成與募集，從而降低屏障通透性[16]。

注：放大3 000倍時，標(biāo)尺示2 μm；放大8 000倍時，標(biāo)尺示1 μm，箭頭示結(jié)腸黏膜緊密連接

中醫(yī)認(rèn)為，UC病機(jī)屬脾失健運(yùn)，濕熱蘊(yùn)結(jié)腸腑、氣滯血瘀。治宜清熱燥濕、調(diào)和氣血為主。芍藥湯中黃芩、黃連性味苦寒，入大腸經(jīng)，可清熱燥濕、解毒瀉火，以祛除病因，二藥共為君藥；白芍養(yǎng)血和營、緩急止痛，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，木香、檳榔行氣導(dǎo)滯，四藥相配，調(diào)氣和血，共為臣藥；大黃苦寒沉降，瀉熱通便，以少量肉桂防苦寒傷中，二藥共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，與芍藥相配可緩急止痛，為佐使。諸藥合用，清熱燥濕解毒、調(diào)氣和血，下痢可愈。

本研究表明，美沙拉嗪、芍藥湯均能明顯降低UC大鼠結(jié)腸組織的DAI評分和血清IL-4、TNF-α、ET含量，減輕UC模型大鼠結(jié)腸組織緊密連接結(jié)構(gòu)損傷，且兩者的作用相當(dāng)。

綜上所述，芍藥湯可能是通過減少血清TNF-α、IL-4、ET含量，修復(fù)腸上皮組織緊密連接，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障而發(fā)揮治療UC的作用。