抗貓細(xì)小病毒嵌合抗體基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定

薛雨佳，宋彩玲，趙爽爽，李彤彤，王文靜，張 云，劉 明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus，F(xiàn)PV)又名貓泛白細(xì)胞減少癥病毒，最易感染斷奶幼貓并造成幼貓的感染和高死亡率。犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus，CPV)2型，能夠引起6周齡～6月齡快速生長(zhǎng)的幼犬發(fā)生高死亡率的犬細(xì)小病毒病，是引發(fā)犬科動(dòng)物傳染性腹瀉的重要病原[1]。FPV與CPV同屬細(xì)小病毒科，二者的流行特征、臨床癥狀、抗原性高度相似，均為引發(fā)寵物疾病的重要病毒。目前主要通過(guò)弱毒疫苗免疫來(lái)防控細(xì)小病毒病，但由于母源抗體干擾，流行株變化和畜主缺乏免疫意識(shí)往往造成疾病的發(fā)生和流行。FPV與CPV的對(duì)癥治療依賴于抗血清，而市售抗細(xì)小病毒血清多為單克隆抗體(Monoclonal antibody，MAb)或馬血清，雖有一定的療效但不能連續(xù)使用，也易造成過(guò)敏反應(yīng)。同時(shí)異種動(dòng)物抗體Fc段在犬、貓?bào)w內(nèi)不能有效激活補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)，其治療效果明顯低于來(lái)源于同種動(dòng)物的血清抗體。

本實(shí)驗(yàn)室前期制備了一株雜交瘤細(xì)胞株3EB，證實(shí)其分泌的MAb同時(shí)具有抗FPV和CPV的中和活性。本研究通過(guò)融合PCR構(gòu)建了包含MAb 3EB可變區(qū)和犬天然抗體(NAb)恒定區(qū)的鼠-犬融合基因，克隆至桿狀病毒載體后轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞[2-4]表達(dá)了鼠-犬嵌合抗體。相比于鼠源的MAb，本研究表達(dá)的嵌合抗體保留了原MAb對(duì)抗原的高親和力，又因?yàn)槠浜愣▍^(qū)來(lái)源于犬NAb，能夠大幅降低其在犬機(jī)體中引起的副反應(yīng)，可以提高對(duì)CPV病的治療效果。為進(jìn)一步研制細(xì)小病毒臨床治療用藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 3EB雜交瘤細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室制備，其同時(shí)對(duì)FPV、CPV具有中和活性；FPV、CPV病毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離、純化及保存；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ex-TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Maker、pMD18-T載體克隆試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；FITC、HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；BAC/PAC DNA Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；NAb Protein A/G Column抗體純化柱購(gòu)自Thermo公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Thermo公司；超濾離心管(0.5 mL 50 ku)購(gòu)自密理博公司；pFastBac-Dual載體購(gòu)自Invitrogen公司；F81(貓腎細(xì)胞)、Sf9細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Solarbio公司；LA-Bac 培養(yǎng)基由 100 μg/mL X-gal、40 μg/mL IPTG、50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 慶大霉素和 10 μg/mL四環(huán)素LB培養(yǎng)基組成。比格犬血液樣品來(lái)自哈爾濱某寵物醫(yī)院。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)MAb 3EB重鏈可變區(qū)(MH)基因(數(shù)據(jù)未給出)，設(shè)計(jì)引物MH-F/MH-R擴(kuò)增該MAb的MH基因；同時(shí)設(shè)計(jì)引物ML-F/ML-R擴(kuò)增該MAb的輕鏈可變區(qū)(ML)基因；設(shè)計(jì)引物DH-L/DH-R擴(kuò)增犬NAb重鏈恒定區(qū)(DH)基因(數(shù)據(jù)未給出)，引物DL-F/DL-R擴(kuò)增該Nab的輕鏈恒定區(qū)(DL)基因(數(shù)據(jù)未給出)；圖1為擴(kuò)增MAb可變區(qū)、犬NAb恒定區(qū)重鏈、輕鏈引物設(shè)計(jì)示意圖，序列見(jiàn)表1。引物由吉林庫(kù)美生物公司合成。

表1 引物信息

1.3 MAb、犬NAb重輕鏈基因的PCR擴(kuò)增及融合PCR 采用TRIzol試劑提取3EB細(xì)胞株總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用MH-F/R、ML-F/R引物對(duì)MAb的MH、ML基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；按照說(shuō)明書使用外周血淋巴細(xì)胞分離液分離比格犬血液中的淋巴細(xì)胞，TRIzol試劑提取分離的淋巴細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板，利用DH-F/R、DL-F/R引物PCR擴(kuò)增犬血清中NAb的DH、DL部分基因。PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s、55℃45 s、72℃90 s，20個(gè)循環(huán)；72℃10 min?；厥丈鲜銎危謩e將擴(kuò)增的MH、DH部分基因、ML、DL部分基因進(jìn)行融合PCR，PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s、55℃45 s、72℃2 min，20個(gè)循環(huán)；72℃10 min。構(gòu)建ML-DL融合基因(RL)、MH-DH融合基因(RH)。預(yù)期擴(kuò)增片段分別約為700 bp、1 500 bp。2種PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，由吉林庫(kù)美公司測(cè)序鑒定。

1.4 重組桿粒Bacmid-RL-RH的構(gòu)建和鑒定 將回收得到的RH基因和RL基因分別克隆至pFast-Bac-Dual質(zhì)粒的p10啟動(dòng)子(酶切位點(diǎn)XhoⅠ、NheⅠ)和多角體啟動(dòng)子(酶切位點(diǎn)BamHⅠ、HindⅢ)后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac-Dual-RL-RH并測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆接種于LA-Bac液體培養(yǎng)基，用BAC/PAC DNA Kit提取重組桿粒(Bacmid)，采用通用引物pUC/M13對(duì)提取的重組桿粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的重組桿粒命名為Bacmid-RL-RH。

1.5 嵌合抗體RL-RH的表達(dá) 取適量重組桿粒Bacmid-RL-RH與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合轉(zhuǎn)染6孔板中的Sf9昆蟲細(xì)胞，置27℃培養(yǎng)，72 h后收集細(xì)胞上清(P1代)。將P1接種Sf9細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)獲得病毒(P2代)。通過(guò)病毒空斑試驗(yàn)[5]測(cè)定P2代滴度后，以5 MOI接種新培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞。72 h后分別收集Sf9培養(yǎng)上清及Sf9細(xì)胞。

1.6 嵌合抗體RL-RH的表達(dá)及純化的檢測(cè) 將1.5步驟中收集的Sf9細(xì)胞超聲破碎離心后，收集上清和沉淀。將超聲后的上清用NAb Protein A/G Column對(duì)表達(dá)的嵌合抗體進(jìn)行純化。將超聲后的上清、沉淀和純化后的抗體各取 20 μg進(jìn)行 SDSPAGE檢測(cè)，并以未轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞超聲上清作為對(duì)照。直接用HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG進(jìn)行western blot鑒定嵌合抗體的反應(yīng)原性及抗體純化效果。

1.7 嵌合抗體RL-RH的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)將FPV接種于96孔板中F81細(xì)胞中，置37℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)棄掉培養(yǎng)液，PBST洗3次，用預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定細(xì)胞。以1.5步驟中收集的Sf9培養(yǎng)上清(1∶20)為一抗，以FITC標(biāo)記的兔抗犬IgG(1:100)為二抗，經(jīng)IFA檢測(cè)嵌合抗體與FPV的特異性結(jié)合情況。

1.8 嵌合抗體RL-RH對(duì)FPV和CPV的中和活性測(cè)定 將FPV和CPV病毒液10倍倍比稀釋(10-1～10-10)，分別取每個(gè)稀釋度的病毒液100 μL，接種于96孔板中的F81單層細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種一列。置37℃培養(yǎng)，在24 h～72 h之間監(jiān)測(cè)CPE出現(xiàn)情況。用Reed-Muench法[6]計(jì)算FPV、CPV的TCID50。用固定病毒稀釋抗體的方法進(jìn)行中和試驗(yàn)：將純化后的嵌合抗體 2倍倍比稀釋(1∶8～1∶256)，分別與100 TCID50的FPV、CPV病毒液等體積混合，37℃孵育1h。每一稀釋度取100 μL上述上清和病毒的混合液接種96孔板的F81細(xì)胞。每日觀察CPE情況，檢測(cè)嵌合抗體對(duì)FPV、CPV的中和活性，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 嵌合抗體RL-RH基因的擴(kuò)增及融合PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取3EB MAb細(xì)胞株總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板，擴(kuò)增MH、ML基因，得到約為420 bp、400 bp的基因片段，與預(yù)期MAb相應(yīng)輕鏈基因大小相符；以犬淋巴細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增犬血清NAb DH、DL基因片段大小分別約為1 200 bp、400 bp。用融合PCR將ML基因與DL基因、MH基因與DH基因融合后，得到重組的嵌合重鏈基因(RH)、輕鏈基因(RL)基因片段。經(jīng)測(cè)序顯示，RL基因片段全長(zhǎng)752 bp、RH基因全長(zhǎng)1 523 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。表明正確構(gòu)建了鼠-犬嵌合輕鏈基因RL和鼠-犬嵌合重鏈基因RH。

2.2 重組桿粒的構(gòu)建與鑒定 將嵌合輕鏈基因與嵌合重鏈基因克隆至pFastBac-Dual質(zhì)粒中，對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac-Dual-RL-RH測(cè)序，結(jié)果顯示嵌合輕鏈與嵌合重鏈正確克隆至質(zhì)粒。將pFastBac-Dual-RL-RH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliDH10Bac，用 BAC/PAC DNA Kit提取篩選的陽(yáng)性重組桿粒，使用通用引物pUC/M13對(duì)其進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增出約5 000 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。表明正確構(gòu)建了重組桿粒Bacmid-RL-RH。

2.3 嵌合抗體RL-RH的表達(dá)與純化檢測(cè)結(jié)果 重組桿粒Bacmid-RL-RH轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，收集細(xì)胞并超聲離心，對(duì)超聲后的上清、沉淀及純化后的嵌合抗體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示，獲得了兩條分別約為55 ku和25 ku的目的蛋白條帶，與預(yù)期相符，且純化效果較好(圖4A)。表明嵌合抗體RL-RH能夠在昆蟲細(xì)胞中正確表達(dá)。以HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG進(jìn)行western blot鑒定，結(jié)果顯示在55 ku處有1條特異性反應(yīng)條帶(4B)。表明抗犬IgG能夠與嵌合抗體RL-RH發(fā)生特異性結(jié)合。表明嵌合抗體RL-RH的相應(yīng)區(qū)域已經(jīng)替換為犬源的相應(yīng)區(qū)域。

2.4 嵌合抗體的IFA鑒定結(jié)果 待感染FPV的F81細(xì)胞出現(xiàn)CPE后以純化后的嵌合抗體作一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗犬IgG為二抗，經(jīng)IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)81細(xì)胞出現(xiàn)特異綠色熒光(圖5)。嵌合抗體能夠與FPV發(fā)生特異性結(jié)合，表明嵌合抗體保留了原MAb可變區(qū)對(duì)FPV的特異性結(jié)合能力，同時(shí)原MAb的鼠源恒定區(qū)已經(jīng)替換為犬源恒定區(qū)。

2.5 嵌合抗體中和活性的測(cè)定結(jié)果 根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算出FPV的TCID50=10-6.6/0.1 mL，CPV的TCID50=10-5.9/0.1 mL。通過(guò)3次平行試驗(yàn)測(cè)定嵌合抗體對(duì)FPV、CPV的中和活性，結(jié)果顯示當(dāng)嵌合抗體1∶16稀釋時(shí)仍能夠完全中和100 TCID50的FPV、CPV。表明昆蟲細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗體保留了原來(lái)MAb對(duì)FPV和CPV的中和活性。

3 討論

抗病毒抗體在治療CPV中起著十分重要的作用。但作為異種動(dòng)物的抗體，無(wú)論是鼠源的MAb還是馬源的多抗血清，均會(huì)由于異源抗體的免疫原性而引發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗-抗體反應(yīng)[7]。對(duì)CPV來(lái)說(shuō)，抗體的免疫原性是影響治療效果主要原因。而將MAb的鼠源恒定區(qū)替換為同種動(dòng)物源恒定區(qū)，可以顯著降低這種免疫原性，但由于其可變區(qū)仍是鼠源序列，有時(shí)仍會(huì)對(duì)異種動(dòng)物產(chǎn)生免疫原性[8]。根據(jù)對(duì)抗體序列及空間構(gòu)象的相關(guān)研究顯示，抗體的可變區(qū)可以進(jìn)一步分為骨架區(qū)(Framework region，F(xiàn)WR)和互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity determining region，CDR)[9]。有的研究者為了進(jìn)一步減弱疫原性，將抗體的FWR也進(jìn)行了替換，阿侖單抗(CAMPATH-1H)便是由此而來(lái)[10]，目前該嵌合抗體現(xiàn)已經(jīng)在50多個(gè)國(guó)家獲得批準(zhǔn)用于人的復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥的治療[11]。

阿侖單抗雖然是進(jìn)一步減弱了免疫原性的成功例子，但有報(bào)道稱某些抗體FWR中的某些關(guān)鍵氨基酸殘基起著穩(wěn)定抗體結(jié)構(gòu)的作用，并且在抗體與抗原結(jié)合過(guò)程中起到變構(gòu)作用[12]。本研究將3EB MAb的重輕鏈可變區(qū)替換為犬源NAb可變區(qū)，獲得的嵌合抗體保留了對(duì)FPV和CPV的中和活性。雖然沒(méi)有進(jìn)一步替換MAb可變區(qū)的FWR，一方面是因?yàn)橄鄬?duì)于人源抗體，犬的天然抗體結(jié)構(gòu)及功能的研究[13-14]相對(duì)較少，貿(mào)然替換FWR可能會(huì)造成嵌合抗體喪失對(duì)病毒的中和活性。而且在替換FWR時(shí)，還需要對(duì)MAb及犬NAb結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[9]。另一方面是目前還無(wú)犬源嵌合抗體上市，將鼠源MAb恒定區(qū)部分替換分為犬源的嵌合抗體的研究及應(yīng)用也未見(jiàn)報(bào)道。與進(jìn)一步減弱MAb的免疫原性相比，保持原有MAb對(duì)病毒的中和活性才是目前研發(fā)嵌合抗體的重點(diǎn)。本研究為嵌合抗體及犬源化MAb的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，對(duì)臨床用犬源抗體藥物研究具有重要的參考價(jià)值。