大腸桿菌鞭毛研究進(jìn)展

田 延，丁雪燕，岑 雪，周明旭，羊 揚(yáng)*，朱國強(qiáng)*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

鞭毛是位于細(xì)菌表面的長螺旋形可旋轉(zhuǎn)附屬物，長約10 μm，主要與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。鞭毛的驅(qū)動(dòng)力是許多細(xì)菌病原體的重要毒力特征，并且是建立感染所必需的。感染發(fā)生后，鞭毛有利于細(xì)菌到達(dá)侵入部位。大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)一般周身鞭毛，具有運(yùn)動(dòng)性。鞭毛蛋白，又稱為H抗原，是大腸桿菌分類的重要表面抗原。本文對(duì)大腸桿菌鞭毛的結(jié)構(gòu)、功能和H抗原分型作一簡要綜述，旨在為本領(lǐng)域的相關(guān)研究提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 鞭毛的結(jié)構(gòu)

細(xì)菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)分析表明，蛋白質(zhì)折疊成不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)域，即D0-D3。不同細(xì)菌種類鞭毛蛋白的N-和C-末端的D0和D1結(jié)構(gòu)域(分別由FliC的N端和C端保守序列組成)具有很多共同的特征。D0和D1結(jié)構(gòu)域?qū)τ诒廾鞍椎木酆现陵P(guān)重要，通過α螺旋形成鞭毛絲的中心，并且主要隱藏在完整鞭毛的結(jié)構(gòu)內(nèi)部[1]。在許多細(xì)菌中，D1結(jié)構(gòu)域含有被先天性免疫Toll樣受體5(Toll-like receptors 5，TLR5)識(shí)別的區(qū)域[2]。D2和D3結(jié)構(gòu)域在細(xì)菌中具有更高的可變性，并且大部分暴露在鞭毛絲的外層[3]。在很多細(xì)菌種類中，這些結(jié)構(gòu)域被糖部分修飾，這就進(jìn)一步促進(jìn)了菌株之間的多樣性變化[4]。

2 鞭毛的生物合成和裝配

鞭毛的生物合成和裝配過程非常復(fù)雜，需要鞭毛基因亞群的及時(shí)轉(zhuǎn)錄和鞭毛蛋白合成、細(xì)胞內(nèi)加工、折疊和輸出的協(xié)調(diào)一致，以及功能性鞭毛纖維的形成[5]。鞭毛伴侶蛋白對(duì)于鞭毛的生物合成至關(guān)重要，這些蛋白質(zhì)與不同的鞭毛組分相互作用，其中鞭毛組分包括鉤-絲連接蛋白FlgK/FlgL、絲-帽蛋白FliD和鞭毛蛋白亞基[6]。大部分的鞭毛伴侶蛋白不支持蛋白質(zhì)折疊，而是在防止鞭毛蛋白過早折疊和聚合方面起著重要的作用，它們靶向作用鞭毛I(xiàn)II型分泌系統(tǒng)(Flagellar type III secretion system，T3FSS)[7]，從而幫助細(xì)菌正確組裝和輸出鞭毛蛋白。通常，大腸桿菌的FlgN、FliS和FliT伴侶蛋白分別防止鞭毛的FlgK/FlgL、FliC和FliD蛋白的自我聚合[6]。細(xì)菌鞭毛的組裝和功能主要依賴于通過保守的T3FSS進(jìn)行的蛋白質(zhì)輸出，因此T3FSS對(duì)于鞭毛的生物合成和裝配至關(guān)重要。

3 鞭毛的基因調(diào)節(jié)

控制鞭毛基因表達(dá)的啟動(dòng)子根據(jù)基因在其控制下的表達(dá)時(shí)機(jī)分為3類(圖1)[7]。單個(gè) 1類啟動(dòng)子(PflhDC啟動(dòng)子)編碼兩種蛋白(FlhD和FlhC)，它們一起形成轉(zhuǎn)錄激活物復(fù)合物FlhD4C2。該啟動(dòng)子整合了大量來自全局調(diào)控因子的輸入信號(hào)，并決定細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)還是非運(yùn)動(dòng)[8]。FlhD4C2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于激活2類啟動(dòng)子是必需的，還與大腸桿菌內(nèi)其它毒力因子的共調(diào)節(jié)相關(guān)[9]。2類啟動(dòng)子控制所有構(gòu)成鉤-基體(Hook-basal body，HBB)、絲帽蛋白(FliD)和調(diào)節(jié)子(FliA、FlgM、FliZ和FliT)的蛋白的表達(dá)[10]。Fli-A是鞭毛特異性轉(zhuǎn)錄σ因子(σ28)，負(fù)責(zé)所有3類啟動(dòng)子的激活，而3類啟動(dòng)子控制形成細(xì)絲、運(yùn)動(dòng)蛋白以及趨化蛋白的蛋白表達(dá)[11]。此外，F(xiàn)liA正向調(diào)節(jié)其自身表達(dá)，以及編碼FlgM、FliZ、FliD和FliT的基因的表達(dá)。因此，編碼這5種蛋白質(zhì)的基因受到2類和3類啟動(dòng)子的控制。除了對(duì)轉(zhuǎn)錄的直接控制外，幾種翻譯后調(diào)控的相互作用在調(diào)節(jié)鞭毛裝配過程中也起著重要作用。首先，F(xiàn)lgM(FliA的抗σ因子)與FliA結(jié)合形成FliA-FlgM蛋白復(fù)合物。FlgM對(duì)FliA的螯合不會(huì)在細(xì)胞中留下任何游離的FliA來激活3類啟動(dòng)子[12]。然而，在完成功能性HBB后，F(xiàn)li-A-FlgM復(fù)合物與鞭毛輸出裝置相互作用，從而使FlgM從細(xì)胞分泌出來。FlgM的分泌導(dǎo)致FliA釋放以激活3類啟動(dòng)子。第二個(gè)相互作用涉及帽蛋白FliD及其伴侶蛋白FliT。FliD從HBB中分泌出來并在鞭毛頂部組裝。在完成HBB之前，F(xiàn)liT結(jié)合FliD并在細(xì)胞內(nèi)形成FliD-FliT復(fù)合物。在HBB完成后，F(xiàn)liD通過HBB結(jié)構(gòu)分泌。細(xì)胞內(nèi)游離的FliT與FlhD4C2復(fù)合物相互作用并阻止FlhD4C2依賴性的2類基因的激活[13]。該反饋回路負(fù)調(diào)控鞭毛基因的表達(dá)以響應(yīng)細(xì)胞中FliD分泌的增加[14]。

此外，與fliD和fliT在相同操縱子中表達(dá)的FliS被認(rèn)為是長絲蛋白FliC的伴侶蛋白。已知fliS的缺乏導(dǎo)致鞭毛絲的長度變短[15]。FlgN(在具有抗σ因子FlgM的操縱子中表達(dá))是鉤相關(guān)蛋白(Hook-associated proteins，HAPs)FlgK和FlgL的伴侶蛋白，F(xiàn)lgK和FlgL形成柔性鉤子和剛性長絲之間的連接點(diǎn)[16]。大量的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)促進(jìn)了對(duì)大腸桿菌中控制鞭毛組裝的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的詳細(xì)理解。

4 大腸桿菌鞭毛H抗原分型

根據(jù)鞭毛蛋白超微結(jié)構(gòu)的差異，將大腸桿菌的H抗原分為53種，包括A、B、C、D、E和F共6種形態(tài)[17-18](表1)。盡管大部分H抗原是由fliC基因編碼的，但也有例外，如H17抗原型由flnA基因編碼，H44和H55抗原型由fllA基因編碼等[19-20]。同時(shí)還有一些大腸桿菌表現(xiàn)出兩種不同的H抗原型相態(tài)，其鞭毛蛋白由兩種基因編碼。這種現(xiàn)象表明大腸桿菌在進(jìn)化過程中既具有保守性，又具有多樣性和豐富性。

表1 大腸桿菌H抗原分類和特征

5 鞭毛的相關(guān)功能

5.1 趨化性和運(yùn)動(dòng)性 為了更好地生存，細(xì)菌每時(shí)每刻都需要適應(yīng)環(huán)境的變化，其中最簡單的方法就是運(yùn)動(dòng)。而趨化行為是運(yùn)動(dòng)生物體的一般屬性，能夠使生物朝向或遠(yuǎn)離化學(xué)物質(zhì)和各種刺激。細(xì)菌的趨化系統(tǒng)能夠識(shí)別和傳導(dǎo)多種化學(xué)信號(hào)，如pH值、營養(yǎng)和滲透壓等，繼而引發(fā)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，且其運(yùn)動(dòng)方向由鞭毛的轉(zhuǎn)動(dòng)方向所控制。很多具有致病性的細(xì)菌就是利用運(yùn)動(dòng)性和趨化性來實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的定植和侵襲，而運(yùn)動(dòng)性本身也與細(xì)菌的毒力相關(guān)[21]。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O113:H21無運(yùn)動(dòng)性突變株在體外黏附試驗(yàn)中雖然與野生菌株具有相似的黏附能力，但其毒力明顯減弱[22-23]。為了更好地了解細(xì)菌的致病機(jī)理，細(xì)菌趨化性、運(yùn)動(dòng)性和致病性之間復(fù)雜的關(guān)系還有待進(jìn)一步的挖掘研究。

5.2 鞭毛參與細(xì)菌的黏附和侵襲 細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)(如定植因子和菌毛[24])可以介導(dǎo)其對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和定植，而鞭毛因其顯著的運(yùn)動(dòng)性一直被認(rèn)為不參與細(xì)菌的黏附和侵襲等毒力過程。然而，越來越多的研究表明多種大腸桿菌致病型菌株可以通過鞭毛直接黏附于宿主細(xì)胞。新生兒腦膜炎大腸桿菌鞭毛基因缺失后，其對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力明顯低于其相應(yīng)的野生菌株[25]。豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌可借助鞭毛黏附于仔豬上皮細(xì)胞，同時(shí)純化得到的鞭毛蛋白可直接粘附于細(xì)胞[26]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F107/86菌株對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞的黏附和侵襲試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，motA(鞭毛馬達(dá)蛋白編碼基因)基因缺失株與野生菌株相比其侵襲能力顯著上升[27]。此外，鞭毛還參與禽致病大腸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌等致病菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲過程[27]。但以上過程涉及到的更加精確的分子機(jī)制還有待深入探究。

此外，鞭毛在大腸桿菌與非生物表面粘附中也發(fā)揮作用。研究野生型和鞭毛敲除菌株的粘附性試驗(yàn)證實(shí)鞭毛增強(qiáng)了對(duì)疏水性底物的粘附，而缺乏鞭毛的細(xì)菌未顯示出對(duì)疏水性底物的優(yōu)選親和力，這一性質(zhì)使得具有鞭毛的細(xì)胞可以穩(wěn)定水性培養(yǎng)物和十二烷的乳液[28]。這項(xiàng)工作有助于我們對(duì)非特異性細(xì)菌粘附的整體理解，并證實(shí)鞭毛除了運(yùn)動(dòng)性以外，可能在表面粘附中起重要作用。

5.3 鞭毛介導(dǎo)生物被膜的形成 生物被膜是由細(xì)菌粘附于接觸表面后分泌纖維蛋白等將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物，可以增強(qiáng)致病菌對(duì)抗生素的耐藥性并幫助細(xì)菌躲避宿主免疫系統(tǒng)的清除。生物被膜形成過程中可能涉及到多種表面結(jié)構(gòu)蛋白，如菌毛、自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鞭毛[24]。在對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌株的研究中發(fā)現(xiàn)fliC基因缺失株無法形成微菌落結(jié)構(gòu)，同時(shí)其形成生物被膜的能力顯著低于野生菌株[29]。尿道致病性大腸桿菌的鞭毛基因缺失菌株因?yàn)橹荒苄纬尚《∈璧木涠鴮?dǎo)致生物被膜不能進(jìn)一步成熟[30]。另外，運(yùn)動(dòng)性也是影響生物被膜形成的重要因素之一。與K12大腸桿菌的野生菌株相比，其有鞭毛但無運(yùn)動(dòng)性的motA缺失株和無鞭毛的fliA缺失株的生物被膜形成能力均明顯下降[26]。

5.4 鞭毛的免疫調(diào)節(jié)作用 鞭毛蛋白是鞭毛的亞基蛋白，是一種能夠使細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的鞭狀附屬物。鞭毛蛋白現(xiàn)在已成為一種有效的免疫激活劑，可以在微生物感染期間形成先天和適應(yīng)性的免疫武器。先天性免疫細(xì)胞通過TLR的結(jié)構(gòu)相關(guān)受體對(duì)各種刺激(包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌感染)作出反應(yīng)。TLR能夠感應(yīng)細(xì)菌的脂磷壁酸、脂多糖和鞭毛蛋白等多種成分[31]。這種感應(yīng)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致各種促炎癥和免疫反應(yīng)基因的激活。促炎細(xì)胞因子通過上調(diào)共刺激分子和粘附分子提供增強(qiáng)的信號(hào)，這對(duì)于獲得性免疫細(xì)胞的激活以及隨后發(fā)生的針對(duì)非自身感染性抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答是必不可少的[32]。

關(guān)于鞭毛蛋白促炎作用的第一篇報(bào)道[33]表明沙門氏菌鞭毛蛋白是亞納摩爾濃度的前單核細(xì)胞系中細(xì)胞因子的有效誘導(dǎo)劑。后來，McDermott等人報(bào)道單核細(xì)胞中促炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)涉及到鞭毛蛋白與存在于先天免疫細(xì)胞中的表面受體之間的高親和力的相互作用[34]。這種表面受體負(fù)責(zé)鞭毛蛋白的炎癥和先天性免疫活性，后來被Hayashi等[35]證明是TLR5，并得到了許多其他研究人員的證實(shí)。進(jìn)一步的研究表明，缺乏高變區(qū)的重組蛋白不存在佐劑活性受損現(xiàn)象。因此，D1和D2結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧R(shí)別TLR5是必不可少的，并足以誘導(dǎo)促炎反應(yīng)[36]。Arnon等首先報(bào)道了鞭毛蛋白的佐劑潛力，并對(duì)其與多種細(xì)菌、病毒或寄生蟲抗原相結(jié)合的佐劑活性進(jìn)行了相應(yīng)的測試[37]。以鞭毛蛋白作為佐劑的安全有效疫苗已經(jīng)產(chǎn)生，并且一些疫苗最終進(jìn)入了人類臨床試驗(yàn)[38]。更重要的是，鞭毛蛋白具有抗腫瘤和輻射防護(hù)的活性，并已顯示出巨大的潛力來對(duì)抗腫瘤生長和輻射相關(guān)的組織損傷[39]。近年來，許多微生物組分已被用作佐劑來增強(qiáng)免疫原性不良疫苗的免疫應(yīng)答。盡管迄今為止所研究的佐劑均被證明是有效的，但TLR5激動(dòng)劑鞭毛蛋白因?yàn)闆]有任何嚴(yán)重的副作用而更有希望成為理想的佐劑。

6 小結(jié)和展望

大腸桿菌作為細(xì)菌研究的模式生物，其菌體結(jié)構(gòu)和毒力因子等正在被逐步挖掘。鞭毛除了作為細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官外，還參與蛋白分泌、黏附侵襲以及生物被膜的形成等多種重要的毒力過程，甚至還參與免疫調(diào)節(jié)過程。大腸桿菌鞭毛復(fù)雜的生物學(xué)功能提示我們要想更加全面的了解和認(rèn)識(shí)大腸桿菌，就必須充分重視鞭毛的存在及其與其它毒力因子之間形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，這將會(huì)成為日后研究的熱點(diǎn)。