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    實(shí)驗(yàn)用小型豬封閉群中OB基因多態(tài)性的研究分析

    2019-07-29 05:26陳志雄胡志剛王洪洋張鶯鶯曹建國吳華莉談永松涂尾龍
    國外畜牧學(xué)·豬與禽 2019年6期
    關(guān)鍵詞:多態(tài)性位點(diǎn)基因型

    陳志雄 胡志剛 王洪洋 張鶯鶯 曹建國 吳華莉 談永松 涂尾龍

    摘 ?要:為研究分析實(shí)驗(yàn)用小型豬封閉群中肥胖(Obese,OB)基因型,本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測了實(shí)驗(yàn)用小型豬封閉群核心群中30頭小型豬的OB基因。結(jié)果表明,OB基因有三種基因型:AA\AB\BB,在30個檢測個體中,5個個體為AA基因型,19個個體為AB基因型,6個個體為BB基因型。

    關(guān)鍵詞:小型豬;肥胖基因;多態(tài)性;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)

    中圖分類號:S813.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1001-0769(2019)06-0019-03

    實(shí)驗(yàn)用小型豬是我國寶貴的物種資源,也是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最廣的實(shí)驗(yàn)動物之一。由于小型豬體型小,操作方便,同時小型豬的血液生理生化指標(biāo)和人的比較接近,皮膚等器官和人的比較相似,就目前來說小型豬應(yīng)該是人類疾病動物模型的最佳實(shí)驗(yàn)動物。作為實(shí)驗(yàn)豬,小型豬的體型對實(shí)驗(yàn)操作者來說尤為重要。在對小型豬進(jìn)行育種的時候,所采用的方法與商品豬的不一樣,并不是挑選體型大的留種。因此,研究小型豬肥胖基因?qū)τ谛⌒拓i育種非常重要。

    肥胖(Obese,OB)基因在調(diào)控實(shí)驗(yàn)豬繁殖和采食等代謝方面發(fā)揮著極其重要的功能,其表達(dá)的產(chǎn)物是調(diào)控動物機(jī)體能量平衡和脂肪細(xì)胞分泌的重要作用。豬OB基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成,定位于18號染色體上,5端是97 bp的先導(dǎo)序列,3端是3.7 kb的非編碼序列。目前,OB基因一直是國內(nèi)外學(xué)者的重要研究方向,有研究表明該基因的多態(tài)性和豬的多個性狀相關(guān),如肉質(zhì)性狀和繁殖性狀等。由于我國對實(shí)驗(yàn)用小型豬的研究起步較晚,因此有關(guān)實(shí)驗(yàn)用小型豬OB基因的研究鮮見報道。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)方法檢測實(shí)驗(yàn)用小型豬OB基因的多態(tài)性,為實(shí)驗(yàn)用小型豬育種提供分子標(biāo)記輔助育種,積累實(shí)驗(yàn)用小型豬的基礎(chǔ)資料,更好地對實(shí)驗(yàn)用小型豬選種選育。

    1 ?材料與方法

    1.1 試驗(yàn)試劑

    本次試驗(yàn)的常用試劑:2×Taq Master Mix(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技有限公司,貨號:P112;Pvu Ⅱ和Hinf Ⅰ購自New England Biolabs公司,貨號分別為:R0151S和R0155T;DL2000 DNA Maker購自上海翊圣生物科技有限公司,貨號:10501ES60;血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,貨號:DP304。

    1.2 試驗(yàn)動物

    試驗(yàn)動物選自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)用小型豬封閉群核心群中30頭實(shí)驗(yàn)用小型豬,年齡在2~3月。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 豬耳朵組織基因組提取

    試驗(yàn)時稱取0.3 mg豬耳朵組織,將其放入組織破碎機(jī)中破碎,將破碎的組織樣品放入1.5 mL的EP管中,使用天根公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA,并將30個樣品分別標(biāo)記。

    1.3.2 OB基因3 469位點(diǎn)檢測(PCR-RFLP)

    設(shè)計(jì)針對OB位點(diǎn)的引物,并委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

    OB-F:5-GAG CCA ACA TCT CTC TCG CTG AG -3

    OB-R:5-GAC TCC TGG AAG CTC AGG TTT CTT C-3

    1.3.3 PCR反應(yīng)體系

    按照表1配置PCR反應(yīng)體系。

    94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

    1.3.4 酶切反應(yīng)體系

    酶切反應(yīng)體系如表2所示。酶切溫度37 ℃,時間30 min。

    2 ?結(jié)果

    2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

    配置3%瓊脂糖凝膠,電壓120 V,時間12 min,結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示。

    2.2 統(tǒng)計(jì)基因型

    從酶切結(jié)果條帶分析,實(shí)驗(yàn)用小型豬OB基因的基因型如表3所示。

    3 ?討論與分析

    嚴(yán)燕等對圩豬OB基因單核苷酸多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn),OB基因存在C/T、A/G、C/T和G/T這4個多態(tài)位點(diǎn),群體存在A和B等位基因,表現(xiàn)3種基因型:AA\AB\BB。Jiang等研究發(fā)現(xiàn),4個多態(tài)位點(diǎn)分別位于867 bp、1 112 bp、3 469 bp和3 714 bp處。OB基因目前在動物體內(nèi)有著非常廣泛的生理功能,不僅會影響動物的許多疾病,還與非常多的經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)。Stephens對豬染色體研究發(fā)現(xiàn),OB基因定位于18號染色體上,與已有研究的神經(jīng)肽Y(NeuroPeptide Y,NPY)基因表達(dá)產(chǎn)物NPY一樣,都能增強(qiáng)促黃體素(Luteinizing Hormone,LH)的釋放,對豬的繁殖性能有很大的影響。但是,在小型豬方面,和肥胖相關(guān)的OB基因鮮見報道。本研究重點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)用小型豬的OB基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測,在30個個體中,5個個體為AA基因型,19個個體為AB基因型,6個個體為BB基因型。檢測主要是為了填補(bǔ)實(shí)驗(yàn)用小型豬基礎(chǔ)資料,并為小型豬選育選種提供分子標(biāo)記輔助育種。由于實(shí)驗(yàn)用小型豬封閉群數(shù)量有限,需要等封閉群數(shù)量擴(kuò)大,下一步對群體進(jìn)行OB基因檢測,對基因型頻率進(jìn)行檢測,更進(jìn)一步的掌握實(shí)驗(yàn)用小型豬的OB基因型,為小型豬選育更適合實(shí)驗(yàn)動物提供有力支撐?!酢?/p>

    參考文獻(xiàn):(6篇,略)

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