譚鈺清,孫夢(mèng)謠,劉宇婷,張伽宜,李智昊,陳立鋼
(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150000)
乙酰甲胺磷是農(nóng)業(yè)種植過(guò)程使用較多的內(nèi)吸性有機(jī)磷殺蟲劑,具有低毒、廣譜、高效的特點(diǎn),當(dāng)其進(jìn)入人體后會(huì)抑制膽堿酯酶,對(duì)人體傷害很大。所以測(cè)定食品中乙酰甲胺磷殘留至關(guān)重要[1-2]。乙酰甲胺磷殘留的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是采用乙腈提取,再經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析測(cè)定,但該方法選擇性較差,抗干擾能力弱,萃取率低,分析準(zhǔn)確性較低[3-4]。
相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足,本研究引入分子印跡聚合物作為乙酰甲胺磷萃取分離的吸附劑。分子印跡聚合物是一類具有特定功能基團(tuán)、空穴大小形狀的高分子材料,具有穩(wěn)定性好、選擇性高、耐高溫高壓和酸堿的優(yōu)點(diǎn)。其模板分子可與聚合物單體接觸形成多重作用點(diǎn),在聚合中被記憶下來(lái);移除模板分子后,在聚合物中留有多個(gè)與其空間構(gòu)型相匹配且對(duì)模板分子具有選擇識(shí)別特性的空穴[5-7]。
傳統(tǒng)分子印跡聚合物大多采用本體聚合的方式制備,得到的材料孔徑較小,且難以控制,因而吸附容量較低,吸附解吸動(dòng)力學(xué)緩慢。介孔材料是一種具有大比表面積和三維孔結(jié)構(gòu)的新型材料,孔徑介于微孔與大孔(2~50 nm)之間,具有孔道結(jié)構(gòu)規(guī)則有序、孔徑分布狹窄、孔徑大小連續(xù)可調(diào)等特點(diǎn)[8-9]。將其作為分子印跡聚合物的基體,可兼得兩者優(yōu)點(diǎn),使材料吸附性更好。
本實(shí)驗(yàn)采用分子印跡和自組裝技術(shù),通過(guò)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和正硅酸乙酯在中性介質(zhì)下水解、凝聚、縮合,使有機(jī)基團(tuán)與介孔硅膠基體結(jié)合,制備一種新的介孔分子印跡聚合物,并通過(guò)動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)和競(jìng)爭(zhēng)吸附等手段,研究其對(duì)乙酰甲胺磷的吸附機(jī)理和選擇性[10-11]。將其作為基質(zhì)固相分散萃取的分散劑,結(jié)合高效液相色譜法,對(duì)糧食中乙酰甲胺磷殘留進(jìn)行分析。該方法可實(shí)現(xiàn)乙酰甲胺磷的高選擇性萃取分離,且提高了分析速度,節(jié)約了有機(jī)溶劑用量,具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
乙酰甲胺磷(純度99%),毒死蜱(純度99.5%),草甘膦(純度95%),3-氨基丙基三乙氧基硅烷(純度99%),正硅酸乙酯(純度98%),正十二烷胺(DDA,純度95%),甲醇、乙醇、乙腈、冰醋酸(均為分析純),甲醇(色譜純,僅用于配制流動(dòng)相),以上試劑均購(gòu)于上海阿拉丁;實(shí)驗(yàn)用水為純凈水;大米、黃豆、糯米、薏米樣品均購(gòu)于哈爾濱當(dāng)?shù)爻小?/p>
LC-15C高效液相色譜儀配置紫外檢測(cè)器(日本島津公司);FEI Sirion掃描電鏡(荷蘭飛利浦公司);ASAP 2020全自動(dòng)比表面積和孔隙度分析儀(美國(guó)Micromeritics公司);FT-IR360傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司);萃取小柱為3 mL聚丙烯固相萃取空柱。
1.2.1 介孔分子印跡聚合物的制備將100 mg乙酰甲胺磷溶于30 mL乙醇和20 mL水中,加入3 mL APTES,常溫下均勻攪拌10 h;加入2 g DDA(50 mL乙醇溶解)和6 mL正硅酸乙酯,常溫下攪拌反應(yīng)24 h,用乙醇洗滌并以7 000 r/min離心7 min后,置于真空干燥箱中60 ℃烘干15 h,得粉末狀聚合物;用甲醇-乙酸(4∶1,體積比)進(jìn)行索氏提取56 h,以除去模板分子和致孔劑;置于真空干燥箱中60 ℃烘干24 h,即得介孔分子印跡聚合物(MIP)。
采用同法制備介孔非分子印跡聚合物(NIP),僅不加入模板分子乙酰甲胺磷。
1.2.2 吸附實(shí)驗(yàn)取4 mL 200、160、120、80、60、40、20、10 μg/mL的乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入10 mg MIP和NIP,于25 ℃水浴恒溫振蕩24 h,進(jìn)行等溫吸附實(shí)驗(yàn)。經(jīng)濾膜過(guò)濾后,用高效液相色譜檢測(cè)溶液中乙酰甲胺磷的剩余濃度。根據(jù)公式Q=(C0-Ct)V/m計(jì)算聚合物對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量(Q),其中C0為乙酰甲胺磷的初始濃度(mg/L),Ct為其平衡濃度(mg/L),V為吸附溶液體積(mL),m為聚合物質(zhì)量(mg)。采用Scatchard分析討論聚合物的吸附情況,擬合方程為Q/Ct=(Qmax-Q)/kd,其中Qmax為最大表觀結(jié)合量(mg/g),kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)(mg/L)。
分別在35 ℃和45 ℃下重復(fù)上述步驟,進(jìn)行吸附熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)。
取4 mL 200 μg/mL乙酰甲胺磷溶液分別加入10 mg MIP和NIP,于25 ℃恒溫水浴分別振蕩2~180 min,檢測(cè)乙酰甲胺磷的剩余濃度,進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。
應(yīng)用乙酰甲胺磷、草甘膦和毒死蜱考察MIP的特異性選擇能力。分別取4 mL 200 μg/mL的乙酰甲胺磷、毒死蜱、草甘膦溶液加入10 mg MIP,在室溫下振蕩24 h,檢測(cè)溶液的剩余濃度,進(jìn)行選擇性吸附實(shí)驗(yàn)。用NIP重復(fù)上述步驟。
1.2.3 基質(zhì)固相分散萃取法提取糧食中的乙酰甲胺磷將糧食樣品與MIP按1∶1的質(zhì)量比混合研磨8 min后,裝入萃取小柱中,依次用4 mL乙醇-水(2∶1,體積比)淋洗和4 mL乙腈-乙酸(19∶1,體積比)洗脫,收集洗脫液,氮?dú)獯蹈珊笾匦氯苡?.0 mL色譜流動(dòng)相中。以乙酰甲胺磷的相對(duì)回收率評(píng)價(jià)萃取效果:相對(duì)回收率(%)=(加標(biāo)樣品中乙酰甲胺磷的檢測(cè)濃度-樣品中乙酰甲胺磷的初始濃度)/乙酰甲胺磷的加標(biāo)濃度×100%。
1.2.4 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸(20∶0.5∶80,體積比),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣體積為20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。
圖1 介孔分子印跡聚合物的紅外光譜圖(A)及掃描電鏡圖(B)
Fig.1 Infared spectrum(A) and scanning electron microscopy image(B) of MIP
MIP的N2吸附-脫附等溫線及孔徑分布曲線見(jiàn)圖2。如圖2A所示,其N2吸附-脫附等溫線符合Langmiur Ⅳ型曲線,形成了明顯的滯后環(huán),表明其介孔豐富。如圖2B所示,孔徑分布曲線的波峰位于3~4 nm,證明此處為最可幾孔徑,介孔孔隙最大。儀器檢測(cè)結(jié)果顯示,MIP的比表面積為770.52 m2·g-1,最可幾孔徑為3.99 nm,孔容為1.28 cm3·g-1。
圖2 MIP的N2吸附-脫附等溫線(A)及孔徑分布曲線(B)
Fig.2 Nitrogen adsorption-desorption isotherms(A) and BJH pore size distribution plot(B) of MIP
測(cè)試了MIP和NIP的吸附等溫線,發(fā)現(xiàn)MIP的吸附等溫線隨乙酰甲胺磷濃度的變化趨勢(shì)比NIP明顯(圖3A);在相同濃度下,MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量大于NIP。說(shuō)明MIP對(duì)乙酰甲胺磷的特定識(shí)別使其吸附能力增強(qiáng)。
以Q/Ct對(duì)Q作圖得到Scatchard分析曲線,如圖3B所示,MIP擬合為折線型,說(shuō)明MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附非均一,聚合物的結(jié)合位點(diǎn)呈各向異性。兩條擬合直線說(shuō)明該聚合物對(duì)乙酰甲胺磷有兩種結(jié)合方式,計(jì)算其截距和斜率[12-13]為:Qmax1=47.03 mg/g,kd1=57.14 mg/L;Qmax2=90.31 mg/g,kd2=188.68 mg/L。該方法制得的介孔MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附總量為137.34 mg/g(Qmax1+Qmax2),遠(yuǎn)大于采用傳統(tǒng)方法制得的非介孔MIP對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的吸附量(27.38 mg/g)[14]。如圖3C所示,NIP擬合為直線型,說(shuō)明NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附均一,聚合物的結(jié)合位點(diǎn)呈等價(jià)性,由擬合直線的截距和斜率求得:Qmax=35.58 mg/g,kd=208.33 mg/L。通過(guò)比較最大表觀結(jié)合量,說(shuō)明MIP的結(jié)合能力高于NIP。
測(cè)試了MIP和NIP的吸附動(dòng)力學(xué)曲線,結(jié)果顯示,MIP的前期吸附速率高,15 min左右達(dá)到吸附總量的85%,在40~50 min時(shí)達(dá)到吸附平衡,快速的吸附平衡表明聚合物中識(shí)別位點(diǎn)對(duì)乙酰甲胺磷表現(xiàn)出較好的親和性。前10 min的吸附曲線斜率較大,是由于此時(shí)印跡位點(diǎn)空穴較多,粒子內(nèi)的擴(kuò)散速度較大;50 min后的吸附曲線較為平緩,可能是由于吸附接近平衡后,印跡位點(diǎn)多被占據(jù),剩余的吸附質(zhì)濃度較低,粒子內(nèi)的擴(kuò)散速度變緩所致。NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附動(dòng)力學(xué)曲線變化趨勢(shì)與MIP類似,但其吸附量整體低于MIP。
MIP和NIP的吸附熱力學(xué)曲線如圖4A、B所示,結(jié)果顯示MIP和NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量均隨反應(yīng)溫度的升高而降低;相同溫度下,MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量大于NIP。表明MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附為放熱過(guò)程,低溫更利于兩者的結(jié)合使其吸附能力增強(qiáng)。
分別計(jì)算得到25、35、45 ℃下MIP的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附速率常數(shù)分別為8.0×10-7、3.7×10-7、2.0×10-7min-1,并以lnk2對(duì)1/T作圖,擬合方程為lnk2=-ΔH0/(RT)+ΔS0/R,其中T為溫度(K),ΔH0為焓變(J/mol),ΔS0為熵變 J/(mol·K)。如圖4C所示,lnk2與1/T呈較好的線性關(guān)系,由斜率可求得MIP吸附乙酰甲胺磷的焓變?yōu)?637.48 J/mol,由截距可求得熵變?yōu)?8.307 J/(mol· K)。ΔH0為負(fù)值表明吸附為放熱過(guò)程,ΔS0為正值表明吸附為焓推動(dòng)過(guò)程。將ΔH0和ΔS0代入方程ΔG0=ΔH0-TΔS0,計(jì)算在25、35、45 ℃下乙酰甲胺磷的ΔG0分別為-6.09、-6.28、-6.46 kJ/mol,ΔG0均小于0,表明吸附為自發(fā)過(guò)程。
考察了MIP和NIP對(duì)乙酰甲胺磷、草甘膦及毒死蜱的吸附情況。由于草甘膦和乙酰甲胺磷的結(jié)構(gòu)較為相似,且具有相同的官能團(tuán)(如羥基和亞氨基),故以其作為乙酰甲胺磷的結(jié)構(gòu)類似物,此外選用結(jié)構(gòu)差異較大的毒死蜱為參照物。結(jié)果顯示,MIP對(duì)乙酰甲胺磷和草甘膦的吸附率(分別為92%和33%)明顯大于NIP(分別為38%和29%),說(shuō)明MIP對(duì)兩者均有良好的選擇性吸附;MIP和NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附率最大(分別為92%和38%),對(duì)毒死蜱的吸附率最小(分別為5%和4%)。表明MIP對(duì)于模板分子乙酰甲胺磷具有良好的選擇性。
2.6.1 研磨時(shí)間與混合物比例的確定將一定比例的MIP和樣品混合物分別研磨2~15 min,用相同的溶液淋洗和洗脫,結(jié)果顯示,MIP的吸附能力隨研磨時(shí)間的增加而增強(qiáng);研磨8 min時(shí)得到的回收率為94.6%,此后增加研磨時(shí)間,回收率無(wú)明顯增強(qiáng),故選擇最佳研磨時(shí)間為8 min。隨后將MIP和樣品按不同質(zhì)量比(1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1)混合研磨8 min,淋洗并洗脫,結(jié)果表明,當(dāng)樣品和MIP的質(zhì)量比為1∶1時(shí)回收率最大(為96.7%),故確定兩者比例為1∶1。
2.6.2 淋洗劑種類及比例的確定將MIP和樣品按上述確定的條件混合,分別用相同比例的乙腈-水、乙醇-水和甲醇-水淋洗并用相同的溶液洗脫,得到回收率分別為35.6%、98.2%和73.4%,因此確定采用乙醇-水為淋洗劑。進(jìn)一步對(duì)乙醇和水的體積比進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)乙醇含量增多可洗脫更多雜質(zhì),但損失的乙酰甲胺磷也增多,使得回收率降低。綜合考慮,選擇體積比為2∶1的乙醇-水為淋洗劑。
圖5 加標(biāo)大米樣品中乙酰甲胺磷的液相色譜圖(加標(biāo)0.05 μg/g)Fig.5 Chromatogram of acephate in spiked rice sample(spiked 0.05 μg/g)
2.6.3 洗脫劑種類及體積的確定將MIP和樣品按上述確定的條件混合并淋洗,分別用體積比為19∶1和18∶2的乙腈-乙酸溶液、乙醇-乙酸溶液和甲醇-乙酸溶液洗脫,結(jié)果顯示采用乙腈-乙酸溶液(19∶1)洗脫得到的回收率最高(達(dá)92.9%),因此選擇乙腈-乙酸溶液(19∶1)為洗脫劑。相同條件下,對(duì)乙腈-乙酸溶液(19∶1)的體積(1~5 mL)進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)洗脫劑體積小于4 mL時(shí)回收率較低(<80%),洗脫劑體積大于4 mL時(shí)回收率無(wú)明顯增長(zhǎng)。因此確定洗脫劑的最佳體積為4 mL。
2.6.4 MIP普用性考察在最優(yōu)條件下分別對(duì)大米、黃豆、糯米和薏米中的乙酰甲胺磷進(jìn)行萃取分離,回收率均能達(dá)到90%以上,表明制備的MIP適用于多種糧食中乙酰甲胺磷的萃取。
將制備得到的介孔分子印跡聚合物用于基質(zhì)固相分散萃取空白大米中的乙酰甲胺磷,萃取條件如“1.2.3”所示,將得到的萃取空白溶液對(duì)乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋,得到標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,然后按“1.2.4”條件進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),得到乙酰甲胺磷的回歸方程為A=1 019.9c+19 722(A為峰面積,c為乙酰甲胺磷濃度),r2=0.998 9,線性范圍為0.03~0.3 μg/g,以3倍信噪比計(jì)算檢出限為0.015 μg/g??瞻状竺讟悠分屑訕?biāo)乙酰甲胺磷的液相色譜圖如圖5所示。根據(jù)國(guó)標(biāo)[16]可知,乙酰甲胺磷在谷物類中限量值為0.2 mg/kg,其他食品中為0.5 mg/kg,故本方法滿足檢測(cè)要求。
從哈爾濱當(dāng)?shù)刭?gòu)買大米、黃豆、糯米、薏米4種糧食,采用本方法進(jìn)行檢測(cè),均未檢出乙酰甲胺磷。隨后對(duì)該4種糧食樣品在3個(gè)濃度下(0.03、0.1、0.3 μg/g)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,得到回收率為92.5%~97.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%~3.7%,表明本方法可用于糧食中乙酰甲胺磷的分離分析。
本文以乙酰甲胺磷為模板分子,采用溶膠凝膠技術(shù)制備了介孔分子印跡聚合物,對(duì)其進(jìn)行等溫吸附、動(dòng)力學(xué)吸附、熱力學(xué)吸附及Scatchard分析。結(jié)果顯示該聚合物對(duì)乙酰甲胺磷具有較好的吸附效果。且由于其具有介孔結(jié)構(gòu),比表面積大,因此對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量高于傳統(tǒng)的分子印跡聚合物。將所制得的MIP應(yīng)用于基質(zhì)固相分散萃取糧食中的乙酰甲胺磷,并采用高效液相色譜法進(jìn)行分析,得到了理想的回收率。該方法將固體樣品的萃取和凈化在一個(gè)體系中同步完成,減少了樣品預(yù)處理步驟,分離速度快,準(zhǔn)確度高,具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。