基于整體材料的固相萃取與毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)合分離檢測(cè)桑葉中的多酚類物質(zhì)

李曉慧,徐志輝,李利軍,程 昊,馮 軍,3*

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣西 柳州 545005；3.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004)

桑葉為桑科植物桑樹(shù)的葉，既是食品又是藥品，桑葉味甘、苦，性寒，具有潤(rùn)燥清肺、疏風(fēng)散熱、養(yǎng)肝明目等功效[1]。桑葉含有多種多酚類物質(zhì)，如蘆丁[2]、綠原酸[3]、槲皮素[4]等。多酚類物質(zhì)是植物中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、清除自由基、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎癥和抗血小板凝聚等功能[5-7]。因此，對(duì)桑葉中多酚類物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制與分離分析具有重要現(xiàn)實(shí)意義。但由于桑葉的多酚類物質(zhì)含量較低，且組成復(fù)雜，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易氧化分解[8]，與生物堿、多糖等生物大分子可發(fā)生結(jié)合[9]，還能與蛋白質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵發(fā)生不可逆結(jié)合[10]，干擾較多。因此，對(duì)桑葉樣品的預(yù)處理尤其重要[11]。目前，桑葉中多酚類物質(zhì)的分離檢測(cè)主要有高效液相色譜法(HPLC)[12-14]、毛細(xì)管電泳法(CE)[15]等。其中，HPLC分析多酚類物質(zhì)多采用梯度洗脫，但分析時(shí)間較長(zhǎng)且耗費(fèi)有機(jī)試劑[16]；苑廣信等[15]采用CE法分離測(cè)定桑葉中的多酚類物質(zhì)，分析雖較為快速，待測(cè)綠原酸也基本達(dá)到基線分離，但由于樣品基底復(fù)雜引起的基線抬高以及緊隨綠原酸之后的雜質(zhì)峰會(huì)一定程度上影響待測(cè)物質(zhì)的準(zhǔn)確定量。

固相萃取是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型預(yù)處理技術(shù)，具有除雜、富集、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[17]。已有報(bào)道采用固相萃取預(yù)處理方式對(duì)植物多酚類物質(zhì)進(jìn)行分離分析[18]，但其采用C18填充柱為固相萃取柱，預(yù)處理過(guò)程略復(fù)雜。此外，C18填充柱制備過(guò)程復(fù)雜，需要豐富的填柱經(jīng)驗(yàn)和嫻熟的燒塞技術(shù)，且為一次性使用，成本較高[19]。與C18填充柱相比，聚合物整體柱(Monolithic column)采用原位熱聚合的方式制備，無(wú)需特殊填充設(shè)備，具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻、通透性和重現(xiàn)性好、成本低廉，且可根據(jù)待測(cè)樣品的性質(zhì)選擇不同功能的單體等優(yōu)點(diǎn)[20-22]，是分離科學(xué)領(lǐng)域的新發(fā)展方向，目前已在生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[23-24]。

本文以甲基丙烯酸丁酯(BMA)為單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑，正丙醇、1,4-丁二醇為致孔劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，采用熱聚合方式合成了poly(BMA-co-EDMA)整體柱，并考察了單體與致孔劑用量對(duì)整體柱制備的影響。同時(shí)，以該整體柱作為固相萃取柱，與毛細(xì)管電泳聯(lián)用，建立了桑葉中多酚類物質(zhì)富集、純化、分離分析的方法，并對(duì)影響固相萃取的多種因素進(jìn)行了考察。相比于純CE法，本方法進(jìn)一步縮短了分析周期(僅需8 min左右)，預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單，基線平直，具有更寬的線性范圍，定量分析也更為準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7100毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；Frontier傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；Hitachi S-4800冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；優(yōu)普UPH-IV-20T純水/超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

甲基丙烯酸丁酯(BMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、蘆丁對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品(上海阿拉丁試劑有限公司)；正丙醇、乙醚、十水合四硼酸鈉、無(wú)水乙醇(四川西隴化工股份有限公司)；1，4-丁二醇(上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇(廣東光華科技股份有限公司);乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；十二烷基硫酸鈉(化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。所有試劑未特殊說(shuō)明，均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，桑葉產(chǎn)自安徽亳州。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取蘆丁、綠原酸、槲皮素對(duì)照品各25.00 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即得1 mg/mL對(duì)照溶液，按照梯度稀釋至質(zhì)量濃度分別為10、 20、40、80、160 μg/mL的工作對(duì)照品。以上所有對(duì)照品溶液均在4 ℃下避光保存。

1.3 樣品的制備

稱取干燥桑葉粉末1.000 g置于索氏提取器中，用150 mL乙醚連續(xù)脫脂8 h，之后在室溫下冷卻10 min，使殘余的乙醚揮發(fā)完全。將得到的粉末倒入100 mL燒杯中并加入30 mL甲醇，封口超聲30 min，連續(xù)提取2次后，合并2次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中揮發(fā)去甲醇，用25%乙醇定容至50 mL容量瓶中，檢測(cè)前經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.4 poly(BMA-co-EDMA)整體柱的制備

將單體BMA、交聯(lián)劑EDMA、引發(fā)劑AIBN、致孔劑正丙醇和1，4-丁二醇按照表1所示配比，在室溫下超聲20 min混合均勻，通氮?dú)?0 min 除去氧氣，取預(yù)聚液至200 μL移液槍頭(使用前，用體積比為6∶1的MTMS-50%γ-MAPS對(duì)移液槍頭內(nèi)表面進(jìn)行硅烷化修飾)中，兩端封口，置于60 ℃水浴中恒溫，反應(yīng)20 h。反應(yīng)結(jié)束后，分別以甲醇和水沖洗固相萃取柱，除去未反應(yīng)的單體和致孔劑，然后置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，得到poly(BMA-co-EDMA)整體柱，密封保存?zhèn)溆?。同時(shí)，在移液槍頭外，以同樣的比例平行制備整體柱材料，用于SEM表征。

表1 不同組成的聚合物溶液制備的poly(BMA-co-EDMA)整體柱Table 1 Different composition of polymer solution for preparation of poly(BMA-co-EDMA) monolithic column

1.5 固相萃取方法

將制備的整體柱安裝在5 mL注射器上，用5 mL甲醇以0.5 mL/min流速活化poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱后，取2 mL提取液移至固相萃取柱，用0.5 mL pH 3.0磷酸緩沖液進(jìn)行預(yù)洗脫，再以0.5 mL乙腈作為洗脫液對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈珊螅眉状既芙猓?.45 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.6 毛細(xì)管電泳條件

Agilent高效毛細(xì)管電泳熔融石英毛細(xì)管(總長(zhǎng)度65 cm,有效長(zhǎng)度56 cm,內(nèi)徑75 μm)，電泳緩沖溶液為15 mmol/L pH 8.5硼砂溶液(含5 mmol/L十二烷基硫酸鈉)、分離高壓20 kV，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

圖1 BMA單體(a)及poly(BMA-co-EDMA)整體柱(b)的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of BMA monomer(a)and poly(BMA-co-EDMA) monolithic column(b)

圖2 單體與致孔劑比例為30∶70的整體柱SEM圖Fig.2 SEM image of monolithic column with monomer to porogen ratio of 30∶70

2 結(jié)果與討論

2.1 poly(BMA-co-EDMA)整體柱的表征

2.2 poly(BMA-co-EDMA)整體柱聚合條件的優(yōu)化

整體柱的滲透性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等性質(zhì)受到聚合反應(yīng)中各組分比例的影響。為了制備內(nèi)部結(jié)構(gòu)與孔徑均勻、柱通透性良好、柱效高的poly(BMA-co-EDMA)整體柱，考察了單體及致孔劑之間的比例對(duì)整體柱萃取效率的影響。

圖3 不同單體與致孔劑比例整體柱萃取后的電泳譜圖Fig.3 Electropherograms of different ratios 0.5 of monomer to porogen after monolithic column extraction

2.2.1 單體與致孔劑比例的優(yōu)化單體與致孔劑的比例直接影響整體柱的制備，當(dāng)單體比例減小、致孔劑比例增大時(shí)，聚合物的孔徑和粒徑增大，結(jié)構(gòu)疏松，硬度降低。如表1中A1～C2所示，本實(shí)驗(yàn)考察了單體與致孔劑的質(zhì)量比分別為40∶60、30∶70、20∶80時(shí)，制備的poly(BMA-co-EDMA)整體柱的SEM圖。結(jié)果顯示，當(dāng)致孔劑含量為70%時(shí)，整體柱的硬度合適，孔徑均勻，疏松多孔(圖2)。從圖3中可以看出，蘆丁、綠原酸、槲皮素經(jīng)比例為40∶60整體柱固相萃取后，雜質(zhì)峰仍較多，未完全達(dá)到除雜效果。經(jīng)比例為20∶80整體柱固相萃取后，待測(cè)樣品未能很好保留。而經(jīng)比例為30∶70整體柱固相萃取后，蘆丁、綠原酸、槲皮素均有較好的保留，且能達(dá)到充分除雜的目的。因此，實(shí)驗(yàn)選取單體與致孔劑的比例為30∶70的整體柱。

圖4 正丙醇與1,4-丁二醇比例為76∶24的整體柱SEM圖Fig.4 SEM image of a monolithic column with a ratio of n-propanol to 1,4-butanediol of 76∶24

2.2.2 致孔劑比例的優(yōu)化在單體與致孔劑的比例為30∶70基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化致孔劑中不同正丙醇與1,4-丁二醇比例(70∶30、76∶24、80∶20，即表1 D、E、F組)對(duì)制備poly(BMA-co-EDMA)整體柱的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)正丙醇的比例增大，1,4-丁二醇的比例減小時(shí)，聚合物的孔徑會(huì)增大。當(dāng)正丙醇與1,4-丁二醇的比例為76∶24時(shí)，聚合物整體柱的孔徑及顆粒大小均勻(圖4)。最終確定單體與致孔劑的比例為30∶70，致孔劑正丙醇與1,4-丁二醇的比例為76∶24制備整體柱(表1 E組)。

2.3 poly(BMA-co-EDMA)整體柱固相萃取條件的優(yōu)化

通常多酚類物質(zhì)的預(yù)處理主要采用C18固相萃取柱，由于多酚類物質(zhì)具有一定的極性，本實(shí)驗(yàn)制備的poly(BMA-co-EDMA)整體柱骨架表面的丁基具有疏水性，可用于固相萃取桑葉中的多酚類物質(zhì)。為了獲得最佳的萃取率，實(shí)驗(yàn)考察了淋洗液種類、淋洗液流速和體積、洗脫液種類對(duì)萃取效率的影響。

2.3.1 淋洗液的選擇選擇合適的淋洗液對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)洗脫，不僅能除去保留在固相萃取柱上的干擾物，而且不會(huì)對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生影響。取制備好的固相萃取整體柱，按照“1.5”方法進(jìn)行預(yù)處理，考察了pH 3.0磷酸鹽緩沖液和15%甲醇溶液的預(yù)洗脫能力。結(jié)果顯示，雖然15%甲醇的除雜效果較好，但會(huì)同時(shí)將部分待測(cè)組分洗脫，從而導(dǎo)致待測(cè)組分的濃度變低，峰面積變小，富集效果變?nèi)?；而pH 3.0磷酸鹽緩沖液在去除雜質(zhì)的同時(shí)最大程度地保留了待測(cè)組分。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇pH 3.0磷酸鹽緩沖液作為淋洗液。

圖5 不同洗脫液的電泳譜圖Fig.5 Electropherograms of different eluentsa.extracts of mulberry leaf;b.methanol;c.acetonitrile；1.rutin，2.chlorogenic acid,3.quercetin

2.3.2 洗脫液的選擇根據(jù)多酚類物質(zhì)與整體柱的極性差異，本實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇和乙腈的洗脫能力進(jìn)行了考察。與未經(jīng)整體柱固相萃取的提取原液相比(圖5a)，在采用甲醇作為洗脫液時(shí)，有較好的洗脫能力，能夠除去大部分雜質(zhì)并保留桑葉中3種多酚類物質(zhì)，且對(duì)多酚具有富集能力，但仍存在少許雜質(zhì)對(duì)3種待測(cè)多酚類物質(zhì)產(chǎn)生干擾(圖5b)。而采用乙腈作為洗脫液時(shí)，基本能夠除去所有干擾雜質(zhì)且只對(duì)桑葉多酚進(jìn)行保留吸附，峰形較好(圖5c)。綜合考慮，采用乙腈作為多酚類物質(zhì)的洗脫溶液。

2.3.3 淋洗液流速與體積的優(yōu)化淋洗液的流速及流量是影響桑葉多酚的吸附效率及除雜效果的重要參數(shù)之一。當(dāng)流速過(guò)快與流量過(guò)大時(shí)，會(huì)造成桑葉多酚吸附率的降低，且很容易沖斷整體柱；而流速過(guò)慢及流量過(guò)小時(shí)，達(dá)不到很好的除雜效果。為了獲得更好的除雜效率,最終決定淋洗液以流速0.1 mL/min，體積0.5 mL進(jìn)行預(yù)洗脫除雜。

綜上所述，poly(BMA-co-EDMA)整體柱的最優(yōu)萃取條件為：淋洗液為pH 3.0磷酸鹽緩沖液，淋洗流速為0.1 mL/min，體積為0.5 mL；洗脫液為乙腈。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系與檢出限取“1.2”配制好的濃度分別為10、20、40、80、160 μg/mL的蘆丁、綠原酸、槲皮素對(duì)照品溶液，按“1.6 ”毛細(xì)管電泳條件進(jìn)行分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，蘆丁、綠原酸、槲皮素在10～160 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.995 5、0.998 5、0.999 5，檢出限(LOD，S/N=3)分別為4.65、1.12、3.49 μg/mL。

2.4.2 精密度分別取50 μg/mL的蘆丁、綠原酸、槲皮素對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，蘆丁、綠原酸、槲皮素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.4%、0.98%、2.8%。表明儀器的精密度良好。

圖6 經(jīng)整體柱固相萃取前(a)后(b)樣品的電泳譜圖Fig.6 Electropherograms of before(a) and after(b) monolithic column extraction

2.4.3 實(shí)際樣品分析將桑葉提取物按照“1.5”方法，用poly(BMA-co-EDMA)整體柱萃取，在最優(yōu)毛細(xì)管電泳條件下進(jìn)行分離測(cè)定，將未萃取樣品(圖6a)與經(jīng)過(guò)整體柱固相萃取后的樣品(圖6b)進(jìn)行比較，蘆丁、綠原酸、槲皮素得到明顯富集、純化，雜質(zhì)峰明顯減少，說(shuō)明poly(BMA-co-EDMA)整體柱對(duì)桑葉中的多酚類物質(zhì)有較好的富集、純化作用。

將經(jīng)過(guò)固相萃取的樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，取峰面積平均值計(jì)算，進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)定。最終測(cè)得桑葉中蘆丁、綠原酸、槲皮素的含量分別為37.12、60.20、21.49 μg/mL(見(jiàn)表2)。

2.4.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品中的蘆丁、綠原酸、槲皮素進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，加標(biāo)濃度分別為10、40、60 μg/mL，測(cè)得結(jié)果如表2所示。蘆丁、綠原酸、槲皮素的回收率為94.7%～102%，RSD為1.2%～3.4%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，適合于桑葉中多酚類物質(zhì)的分離檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本文使用原位聚合法制備了固相萃取整體柱，并與毛細(xì)管電泳聯(lián)用，建立了整體柱固相萃取-毛細(xì)管電泳聯(lián)用分析桑葉中蘆丁、綠原酸、槲皮素的方法。與C18填充柱存在的制備復(fù)雜、成本過(guò)高的固有缺點(diǎn)相比，該整體柱制備簡(jiǎn)單，通透性好，預(yù)處理簡(jiǎn)便，柱效高，可重復(fù)多次使用，能有效萃取桑葉中的蘆丁、綠原酸、槲皮素。所建方法的線性范圍為10～160 μg/mL，檢出限為1.12～4.65 μg/mL，加標(biāo)回收率為94.7%～102%，RSD為1.2%～3.4%。該方法簡(jiǎn)單、高效、成本低，可用于桑葉中蘆丁、綠原酸、槲皮素的分離檢測(cè)。