基于基因多態(tài)性建立腎功能不全患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量的預(yù)測模型

劉艷麗，林蓉，馮永剛，許曉麗（.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安7006；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，西安 7006）

腎功能不全是冠心病患者心血管事件發(fā)生率和死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，另外腎功能不全患者存在高凝狀態(tài)，常需要預(yù)防性抗凝治療，然而新型口服抗凝藥物大部分經(jīng)腎臟排泄，腎功能不全患者易在體內(nèi)蓄積，增加藥物不良反應(yīng)，所以華法林仍然是長期抗凝患者的常用藥物[2-3]。2012年改善全球腎病預(yù)后組織（KDIGO）臨床實(shí)踐指南建議：表現(xiàn)為腎病綜合征的膜性腎病患者，如血漿白蛋白明顯降低并伴有其他血栓危險(xiǎn)因素時(shí)可口服華法林進(jìn)行預(yù)防性抗凝治療（證據(jù)等級2C）[4]，但指南中對腎功能不全患者服用華法林的劑量和抗凝強(qiáng)度等未給出明確的建議。為了解華法林在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院（簡稱我院）腎內(nèi)科患者中的應(yīng)用情況，探討腎功能不全患者服用華法林的穩(wěn)態(tài)劑量，為臨床在腎功能不全患者華法林抗凝治療方案上提供依據(jù)，筆者通過回顧性分析，對我院腎內(nèi)科服用華法林的腎功能不全患者進(jìn)行調(diào)研。

由于華法林劑量個(gè)體差異大且受多種因素影響，其治療窗窄，劑量過大導(dǎo)致出血風(fēng)險(xiǎn)，劑量不足達(dá)不到預(yù)防血栓形成的治療目的。除年齡、體質(zhì)量等影響因素以外，遺傳因素如細(xì)胞色素P4502C9（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1（VKORC1）基因多態(tài)性在華法林穩(wěn)態(tài)劑量的變異中也起到重要的作用[5-6]。另外，就腎功能不全對華法林的穩(wěn)態(tài)劑量是否有影響，國內(nèi)未見報(bào)道。本研究采用多元回歸的方法綜合分析，初步建立了腎功能不全患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量的預(yù)測模型，以期為臨床腎功能不全患者使用華法林提供用藥參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取我院2016年6月－2018年6月腎內(nèi)科服用華法林的腎功能不全患者，涉及疾病包括原發(fā)性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、高血壓腎小動(dòng)脈硬化、糖尿病腎病、繼發(fā)性腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)病變、遺傳性腎臟疾病。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）漢族，18周歲以上，（2）國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）控制在1.5～3.0且穩(wěn)態(tài)達(dá)標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）使用華法林禁忌；（2）有出血傾向的患者、腫瘤患者、妊娠期患者、甲狀腺功能亢進(jìn)患者。

1.2 方法

1.2.1 華法林穩(wěn)態(tài)劑量釋義 患者服用華法林2～3 d后開始每日或隔日監(jiān)測INR值，并根據(jù)INR值調(diào)整給藥劑量，連續(xù)3次的INR值在1.5～3.0之間的華法林劑量，即為華法林的穩(wěn)態(tài)劑量。達(dá)穩(wěn)態(tài)劑量后，可每4周監(jiān)測1次INR值。若需調(diào)整華法林劑量，則應(yīng)重復(fù)上述步驟直至INR值再次穩(wěn)定于控制范圍內(nèi)。

1.2.2 腎功能不全及分期 腎功能不全是指由多種原因引起的腎小球嚴(yán)重破壞，使身體在排泄代謝廢物和調(diào)節(jié)水電解質(zhì)、酸堿平衡等方面出現(xiàn)紊亂的臨床綜合征。主要病因有原發(fā)性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、高血壓腎小動(dòng)脈硬化、糖尿病腎病、繼發(fā)性腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)病變、遺傳性腎臟疾病以及長期服用解熱鎮(zhèn)痛劑及接觸重金屬等。近年來，根據(jù)國際公認(rèn)的K/DOQI指南[7]，臨床按照腎小球?yàn)V過率（eGFR）的水平將腎功能不全分為5期，1期：eGFR正?；蛏遊eGFR≥90 mL/（min·1.73 m2）]，2期：eGFR輕度下降[eGFR＝60～90 mL/（min·1.73 m2）]，3期：eGFR中度下降[eGFR＝30～59 mL/（min·1.73 m2）]，4期：eGFR重度下降[eGFR＝15～29 mL/（min·1.73 m2）]，5期：腎衰竭[eGFR＜15 mL/（min·1.73 m2）]。

1.2.3 資料收集 記錄患者的年齡、性別、體質(zhì)量、身高、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、INR、華法林穩(wěn)態(tài)劑量、CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1-1639G＞A基因型、eGFR等。

1.2.4 基因檢測 采用熒光染色原位雜交及染色體核型分析方法，取患者2 mL外周血置于EDTA抗凝管中避免凝血或溶血，檢測CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1-1639G＞A基因型。操作主要流程：樣本DNA抽提-加樣聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，然后將帶生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在醛基基片上的CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1-1639G＞A基因型檢測探針進(jìn)行特異雜交反應(yīng)，使特異性雜交信號呈現(xiàn)出顏色，通過對芯片進(jìn)行掃描，得到樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與每個(gè)基因位點(diǎn)的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像；經(jīng)軟件分析該圖像，判斷待檢樣品的基因型。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。對正態(tài)分布樣本，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示；組間計(jì)量資料的比較采用配對資料t檢驗(yàn)，對非正態(tài)分布樣本采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。遺傳平衡的符合程度采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，采用多元線性回歸方法確立華法林劑量預(yù)測模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 另按“1.1”項(xiàng)下方法選取25例患者，比較其預(yù)測模型劑量與實(shí)際穩(wěn)態(tài)劑量的差異。

2 結(jié)果

2.1 入選患者的一般情況

共入選患者103例，大部分為腎功能不全的2、3期患者，其一般情況見表1。

表1 患者一般情況Tab 1 General situation of patients

2.2 患者基因型頻率及等位基因分布

入選的103例患者中，CYP2C9＊3（1075A＞C）AA基因型95例（占總數(shù)的92.23%），CYP2C9＊3（1075A＞C）AC基因型8例（占總數(shù)的7.77%），CYP2C9＊3（1075A＞C）CC基因型0例，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)χ2＝0.995，P＞0.05；VKORC1-1639G＞AAA基因型81例（占總數(shù)的78.64%），VKORC1-1639G＞A GA基因型21例（占總數(shù)的20.39%），VKORC1-1639G＞A GG基因型1例（占總數(shù)的0.97%），Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)χ2＝0.853，P＞0.05。以上各基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示所選取的研究對象具有群體代表性，具有恒定性?；颊呋蛐皖l率及等位基因分布見表2。

表2 患者基因型頻率及等位基因分布Tab 2 Patient genotype frequency and allele distribution

2.3 華法林穩(wěn)態(tài)劑量與基因型的相關(guān)性

CYP2C9＊3（1075A＞C）AA基因型患者的華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（3.20±0.88）mg/d高于CYP2C9＊3（1075A＞C）AC基因型患者的華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（2.17±0.13） mg/d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VKORC1-1639G＞A AA基因型患者的華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（2.89±0.08）mg/d低于VKORC1-1639G＞A GA基因型患者的華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（4.01±0.17）mg/d（P＜0.05）；由于VKORC1-1639G＞A GG基因型患者只有1例，因此未列入統(tǒng)計(jì)。

2.4 華法林穩(wěn)態(tài)劑量與性別的相關(guān)性

男性患者的華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（3.16±0.11）mg/d，高于女性患者的華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（3.07±0.13）mg/d，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.608＞0.05）。

2.5 華法林穩(wěn)態(tài)劑量與年齡、BMI、eGFR的相關(guān)性

通過Pearson相關(guān)性分析后顯示，年齡與華法林穩(wěn)態(tài)劑量呈負(fù)相關(guān)，R2＝－0.482，P＝0.000＜0.05；eGFR與華法林穩(wěn)態(tài)劑量呈正相關(guān)，R2＝0.498，P＝0.000＜0.05；BMI與華法林穩(wěn)態(tài)劑量無明顯相關(guān)性，P＝0.339＞0.05，因此BMI未入選預(yù)測模型的因素變量。

2.6 華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型的建立

本研究對103例腎功能不全患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量與性別、年齡、CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1-1639G＞A、eGFR等入選因素通過多元線性逐步回歸法，得到最佳回歸方程，多元線性回歸結(jié)果見表3，回歸方程匯總模型見表4。

表3 多元線性回歸結(jié)果Tab 3 Multiple linear regression results

表4 回歸方程匯總模型及其決定系數(shù)Tab 4 Related coefficient summary of the model

表3結(jié)果顯示，華法林穩(wěn)態(tài)劑量與年齡、eGFR、VKORC1-1639G＞A、CYP2C9＊3（1075A＞C）有關(guān)，性別未進(jìn)入預(yù)測模型。表4結(jié)果顯示，華法林穩(wěn)態(tài)劑量的最佳預(yù)測模型：華法林穩(wěn)態(tài)劑量＝3.057－0.73*VKORC1-1639G＞A+0.08*腎小球?yàn)V過率－0.013*年齡+0.565*CYP2C9＊3（1075A＞C）（VKORC1-1639G＞A：AA＝1，GA＝0，GG＝0；CYP2C9＊3（1075A＞C）：AA＝1，AC＝0；年齡為歲；eGFR單位為mL/（min·1.73 m2）（R2＝0.502）。

2.7 驗(yàn)證結(jié)果

25例驗(yàn)證患者的預(yù)測模型劑量（3.12±0.56）mg/d與實(shí)際穩(wěn)態(tài)劑量（3.06±0.93）mg/d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

腎功能的衡量指標(biāo)有很多，包括血尿素氮、血肌酐、eGFR等，其中血尿素氮受諸多因素影響，如蛋白質(zhì)攝入量、發(fā)熱及消化道出血等，所以血尿素氮不能單獨(dú)作為衡量腎功能受損輕重的指標(biāo)；血肌酐雖然比較穩(wěn)定，但老年人、肌肉萎縮者的血肌酐水平偏低，不能很好地反映腎功能受損的程度，也不能單獨(dú)作為衡量腎功能受損輕重的指標(biāo)；近年來根據(jù)國際公認(rèn)的K/DOQI指南[7]，臨床按照eGFR的水平作為腎功能不全分期的指標(biāo)，將腎功能不全分為5期。

腎功能不全患者伴血漿白蛋白明顯降低并伴有其他血栓危險(xiǎn)因素時(shí)需預(yù)防性抗凝治療[8]。然而新型口服抗凝藥物存在價(jià)格昂貴、不適用于腎功能不全等患者、無特異性拮抗藥等問題，故華法林仍然是目前長期抗凝患者的常用藥物[9-10]。華法林在體內(nèi)主要通過CYP2C9代謝，該酶主要由CYP2C9基因編碼，其中CYP2C9＊3是影響華法林代謝最主要突變型；VKORC1是催化氧化型維生素K向還原型維生素K轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)影響華法林的因素陸續(xù)建立各種華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型[11-12]。

本研究根據(jù)腎功能不全患者的臨床特點(diǎn)和影響華法林使用劑量的因素，建立了華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型。在各因素中，BMI與華法林穩(wěn)態(tài)劑量無明顯相關(guān)性（P＝0.339＞0.05），因此BMI未入選預(yù)測模型的因素變量；年齡與華法林穩(wěn)態(tài)劑量呈負(fù)相關(guān)（R2＝－0.482，P＝0.000＜0.05）；eGFR與華法林穩(wěn)態(tài)劑量呈正相關(guān)（R2＝0.498，P＝0.000＜0.05），與Ichihara N等[13]學(xué)者研究結(jié)果一致，基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)性結(jié)果顯示，CYP2C9＊3（1075A＞C）AA基因型患者華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（3.20±0.88）mg/d顯著高于CYP2C9＊3（1075A＞C）AC基因型患者華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（2.17±0.13） mg/d，VKORC1-1639AA基因型患者華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（2.89±0.08）mg/d顯著低于VKORC1-1639GA基因型患者華法林平均穩(wěn)態(tài)劑量（4.01±0.17）mg/d，與管文燕等學(xué)者[13]研究結(jié)果一致；性別對華法林穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)性結(jié)果顯示，男性患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量（3.16±0.11）mg/d高于女性患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量（3.07±0.13）mg/d，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，華法林穩(wěn)態(tài)劑量的預(yù)測模型納入了患者的年齡、eGFR、VKORC1-1639G＞A和CYP2C9＊3（1075A＞C）。通過驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該預(yù)測模型計(jì)算的預(yù)測劑量與實(shí)際穩(wěn)態(tài)劑量無明顯差異，對腎功能不全患者華法林抗凝治療有一定指導(dǎo)作用。但本研究入選的患者大部分為腎功能不全的2、3期患者，所以該預(yù)測模型對腎功能不全的4、5期患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量的預(yù)測有待進(jìn)一步商榷。本研究未分析不同年齡段以及不同腎病分期華法林穩(wěn)態(tài)劑量的差異，樣本量較少，后期還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行多中心研究。由于收集到驗(yàn)證數(shù)據(jù)較少，后期將增加患者進(jìn)一步驗(yàn)證該模型，并分析不同年齡段以及不同腎病分期華法林穩(wěn)態(tài)劑量的差異，使建立的模型更加精確，為臨床在腎功能不全患者華法林抗凝治療方案的選擇上提供科學(xué)依據(jù)。