槐果堿的鎮(zhèn)痛、抗炎作用及其對COX-2/PGE2信號通路的影響Δ

付聰敏，王敏，徐松濤，金少舉#（1.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院涉外護(hù)理系，河北承德067000；.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南漯河 46000；.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系/河南省腫瘤發(fā)生與防治創(chuàng)新型科技團(tuán)隊(duì)，河南漯河 4600）

槐果堿是從中藥苦豆草中提取的一種苦參型生物堿，具有保護(hù)心臟、保肝、抗心律失常、抗病毒、抗腫瘤、抗酒精性肝損傷和緩解神經(jīng)病理性疼痛的藥理作用[1-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，槐果堿可顯著緩解坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷（CCI）及坐骨神經(jīng)分支保留性損傷（SNI）所致的神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激、抑制Toll樣受體4（TLR4）/p38分裂原激活蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路及上調(diào)γ-氨基丁酸（GABA）信號通路等有關(guān)[4-6]。Gao Y等[7]研究報(bào)道，槐果堿還具有中樞性和外周性抗炎鎮(zhèn)痛作用，但關(guān)于其作用機(jī)制尚未完全闡明。在炎癥反應(yīng)過程中，花生四烯酸在環(huán)氧化酶2（COX-2）的作用下生成前列腺素（Prostaglandin，PG），PG是一類強(qiáng)的致炎致痛介質(zhì)，特別是PGE2其致炎致痛作用更為強(qiáng)烈[8-9]，槐果堿抗炎、鎮(zhèn)痛作用是否與COX-2、PGE2等有關(guān)，有待研究。本研究通過小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)、熱板實(shí)驗(yàn)及角叉菜膠致小鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)觀察槐果堿對小鼠的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，同時(shí)研究其對COX-2/PGE2信號通路的影響，為槐果堿鎮(zhèn)痛、抗炎作用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

YLS-6B智能熱板儀、FA1104電子分析天平、722可見分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）；ZH-ZZY足趾容積測量儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Sub-Cell?Model 192 Cell水平電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

槐果堿對照品（南京澤朗生物科技有限公司，批號：20150915，純度：≥98%）；冰醋酸（東莞市喬科化學(xué)有限公司，批號：20160723）；阿司匹林對照品（批號：106K0101，純度：99.0%）、角叉菜膠（批號：182K14436）均購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD，批號：20180625）、丙二醛（MDA，批號：20180619）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號：20180529）及總抗氧化能力（T-AOC，批號：20180621）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；小鼠PGE2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上?？祈樕锟萍加邢薰?，批號：20180628）；RNA提取試劑盒（批號：12183555）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：K1691）均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；兔抗COX-2（批號：SC-11745）、COX-1（批號：SC-19998）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號：SC-81178）均購自美國Santa Cruz公司；增強(qiáng)型RIPA裂解液（批號：180320）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：180415）均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動(dòng)物

健康SPF級小鼠240只（♂85只、♀155只），體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。小鼠自由飲食，10只/籠，設(shè)置室內(nèi)溫度為22～25℃、濕度為55%～65%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 小鼠扭體實(shí)驗(yàn)

將50只小鼠（♀♂各半）隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、陽性對照組（阿司匹林，100 mg/kg，給藥劑量參考文獻(xiàn)[10]而得，下同）和槐果堿高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg，給藥劑量參考文獻(xiàn)[4]而得，下同），每組10只，各組小鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)給藥5 d。末次給藥后2 h，各組小鼠均腹腔注射0.2 mL 0.6%冰醋酸溶液，記錄15 min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)（扭體反應(yīng)表現(xiàn)為小鼠出現(xiàn)腹部凹陷、后肢伸直、抬高臀部等行為），并計(jì)算小鼠扭體反應(yīng)抑制率：扭體反應(yīng)抑制率（%）＝（空白對照組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)－給藥組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)）/空白對照組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)×100%。

2.2 小鼠熱板實(shí)驗(yàn)

設(shè)置智能熱板儀溫度為（52±0.5）℃，另取70只小鼠（♀）置于熱板上開始計(jì)時(shí)，記錄小鼠出現(xiàn)舔足反應(yīng)或跳躍反應(yīng)的潛伏期即為痛閾值，剔除潛伏期小于5 s和大于30 s的小鼠。給藥前將每只小鼠測痛閾2次，每次間隔10 min，取其平均值作為初始痛閾值（Ti），將篩選合格并測完Ti的50只小鼠隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水，0.01 mL/g）、陽性對照組（阿司匹林，100 mg/kg）和槐果堿高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg），各組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，于給藥后15、30、60、120 min觀察記錄小鼠的反應(yīng)痛閾值（Tr）（為防止?fàn)C傷小鼠，觀察痛閾值時(shí)不應(yīng)超過60 s），并計(jì)算給藥后60 min小鼠痛閾提高率[痛閾提高率（%）＝（Tr－Ti）/Ti×100%]。

2.3 小鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)

另取60只小鼠（♀♂各半）隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、模型對照組（生理鹽水）、陽性對照組（阿司匹林，100 mg/kg）及槐果堿高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg），每組10只，各組小鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)給藥5 d。末次給藥后60 min，用足趾容積測量儀測定小鼠足趾容積作為基礎(chǔ)容積，然后空白對照組小鼠足底皮下注射20 μL生理鹽水，其余各組均足底皮下注射20 μL 1%角叉菜膠生理鹽水溶液致炎，于足底皮下注射后1、3、5 h測定小鼠足趾容積作為測定容積，計(jì)算小鼠足趾腫脹度：足趾腫脹度＝小鼠足趾測定容積－小鼠足趾基礎(chǔ)容積，并計(jì)算給予角叉菜膠后5 h小鼠足趾腫脹率[足趾腫脹率（%）＝足趾腫脹度/給藥前足趾容積×100%]。

2.4 小鼠足趾腫脹組織中SOD、MDA、GSH-Px、T-AOC及PGE2水平的測定

另取60只小鼠（♀♂各半）隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、模型對照組（生理鹽水）及槐果堿組（40 mg/kg），每組10只，各組小鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)給藥5 d。末次給藥后60 min，空白對照組小鼠足底皮下注射20 μL生理鹽水，其余各組均足底皮下注射20 μL 1%角叉菜膠生理鹽水溶液致炎，5 h后將各組小鼠頸椎脫臼處死，各組分別取10只小鼠的足趾腫脹組織制成勻漿（其余小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)），按試劑盒說明書操作要求檢測SOD、MDA、GSH-Px、T-AOC及PGE2水平。

2.5 小鼠腫脹足趾組織中COX-1、COX-2 mRNA表達(dá)水平的檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄-PCR法。取“2.4”項(xiàng)下剩余30只小鼠的足趾腫脹組織約50 mg，置于研缽中，加入適量液氮充分研磨至粉末狀，按相關(guān)試劑盒說明書操作提取總RNA、合成cDNA并進(jìn)行PCR反應(yīng)。待測基因引物序列如下：COX-1上游引物為5′-GGCATTGCACATCCATCCAC-3′，下游引物為5′-GCGCATGAGTACTTCTCGGA-3′，基因長度為378 bp；COX-2上游引物為5′-TTTTGTGCTGGCCTGGTACT-3′，下游引物為5′-CACATGACATGGGGCCTTCT-3′，基因長度為209 bp；β-actin上游引物為5′-GTTGGAGCAAACATCCCCCA-3′，下游引物為5′-CGCGACCATCCTCCTCTTAG-3′，基因長度為186 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系25 μL；95℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸15 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠（2.0%）電泳，于凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照，記錄條帶光密度值，以β-actin條帶為內(nèi)參分析COX-1、COX-2 mRNA相對表達(dá)水平。

2.6 小鼠腫脹足趾組織中COX-1、COX-2蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法取“2.5”項(xiàng)下各組小鼠足趾腫脹組織約100 mg，用組織剪剪碎，置于勻漿器中，加1.5 mL RIPA裂解液，于冰上充分裂解勻漿，然后于4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清即為蛋白提取液，立即用BCA試劑盒測定蛋白濃度并調(diào)整各樣本濃度一致，按照Western blot操作步驟依次進(jìn)行蛋白變性、上樣、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、一抗（COX-1抗體，1∶1 500；COX-2抗體，1∶1 500；β-actin抗體，1∶3 000）、二抗（1∶5 000）孵育、洗膜及顯色，最后置于凝膠成像分析系統(tǒng)下顯色拍照，以β-actin條帶灰度值為內(nèi)參分析COX-1、COX-2蛋白相對表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對照組比較，各給藥組小鼠扭體次數(shù)均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）；扭體反應(yīng)抑制率分別為69.94%、58.96%、34.68%、20.81%。各組小鼠扭體次數(shù)及扭體反應(yīng)抑制率測定結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠扭體次數(shù)及扭體反應(yīng)抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determination result of rithing times and inhibitory rate of writhing in mice（±s，n＝10）

表1 各組小鼠扭體次數(shù)及扭體反應(yīng)抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determination result of rithing times and inhibitory rate of writhing in mice（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

扭體反應(yīng)抑制率，%劑量，mg/kg 69.94 58.96 34.68 20.81組別空白對照組陽性對照組槐果堿高劑量組槐果堿中劑量組槐果堿低劑量組100 40 20 10扭體次數(shù)34.60±4.51 10.40±2.97＊＊14.20±3.70＊＊22.60±4.04＊＊27.40±3.51＊

3.2 小鼠熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

給藥前，各組小鼠痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，與空白對照組比較，陽性對照組和槐果堿高、中、低劑量組小鼠在給藥30、60及120 min后痛閾值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；給藥后120 min痛閾提高率分別為150.07%、148.00%、79.59%、50.03%。各組小鼠痛閾值及痛閾提高率測定結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠痛閾值及痛閾提高率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination result of pain threshold and its improvement rate of mice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠痛閾值及痛閾提高率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination result of pain threshold and its improvement rate of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

給藥后120 min痛閾提高率，%22.11 150.07 148.00 79.59 50.03給藥后痛閾值，s組別 劑量，mg/kg給藥前痛閾值，s空白對照組陽性對照組槐果堿高劑量組槐果堿中劑量組槐果堿低劑量組100 40 20 10 20.22±3.78 21.26±5.20 20.58±4.05 24.17±5.13 22.64±5.31 15 min 21.91±5.16 31.28±5.82＊28.21±5.72 24.64±3.85 23.25±3.36 30 min 25.38±4.31 44.05±5.25＊＊37.04±3.87＊＊33.83±6.13＊31.99±4.35＊60 min 24.06±3.27 49.44±3.47＊＊43.78±4.49＊＊38.65±4.76＊＊35.20±4.55＊＊120 min 24.70±3.09 53.17±4.84＊＊51.05±4.72＊＊43.41±3.83＊＊33.97±3.56＊

3.3 小鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

造模前，各組小鼠基礎(chǔ)足容積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后，與空白對照組比較，模型對照組小鼠致炎1、3、5 h的足趾腫脹度明顯升高（P＜0.01），致炎5 h的足趾腫脹率為56.97%；與模型對照組比較，陽性對照組和槐果堿高、中劑量組小鼠致炎3、5 h的足趾腫脹度明顯降低（P＜0.01），致炎5 h的足趾腫脹率分別為21.31%、31.08%、45.49%。各組小鼠足趾腫脹度及足趾腫脹率測定結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠足趾腫脹度及足趾腫脹率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Determination result of degree and rate of pawswelling of mice in each group（±s，n＝10）

表3 各組小鼠足趾腫脹度及足趾腫脹率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Determination result of degree and rate of pawswelling of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

給予角叉菜膠后5 h足趾腫脹率，%1.50 56.97 21.31 31.08 45.49 53.68組別空白對照組模型對照組陽性對照組槐果堿高劑量組槐果堿中劑量組槐果堿低劑量組劑量，mg/kg 100 40 20 10基礎(chǔ)足趾容積，μL 171.19±5.94 170.50±5.32 169.73±6.50 168.45±7.32 172.86±5.19 168.93±7.43足趾腫脹度，μL 1 h 3.66±1.66 28.72±4.70＊＊21.60±3.19＊＊#24.83±4.40＊＊26.33±3.10＊＊26.89±4.30＊＊3 h 4.53±2.42 95.79±6.33＊＊32.93±5.55＊＊##45.29±7.25＊＊##64.70±4.91＊＊##86.78±10.54＊＊5 h 2.57±0.56 97.14±7.65＊＊36.18±4.33＊＊##52.35±5.87＊＊##78.64±4.71＊＊##90.68±8.66＊＊

3.4 各組小鼠足趾腫脹組織中SOD、MDA、GSH-Px、TAOC及PGE2水平測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型對照組小鼠足趾腫脹組織中 SOD、GSH-Px、T-AOC 水平明顯降低（P＜0.01），MDA、PGE2水平明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，槐果堿組小鼠足趾腫脹組織中SOD、GSH-Px和TAOC水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA、PGE2水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠足趾腫脹組織中SOD、MDA、GSH-Px、T-AOC、PGE2水平測定結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠足趾腫脹組織SOD、MDA、GSH-Px、TAOC、PGE2表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Determination result of SOD，MDA，GSH-Px，T-AOC and PGE2in paw swelling tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表4 各組小鼠足趾腫脹組織SOD、MDA、GSH-Px、TAOC、PGE2表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Determination result of SOD，MDA，GSH-Px，T-AOC and PGE2in paw swelling tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

PGE2，pg/mg 70.69±7.93 129.96±9.94＊＊89.64±11.64＊##組別空白對照組模型對照組槐果堿組劑量，mg/kg 40 SOD，U/mg 40.80±4.42 25.84±5.03＊＊35.49±5.57#MDA，nmol/mg 1.55±0.28 3.61±0.27＊＊2.47±0.46＊＊##GSH-Px，U/mg 167.55±9.57 131.01±7.69＊＊155.80±8.24##T-AOC，U/mg 2.46±0.43 1.07±0.24＊＊2.14±0.21##

3.5 各組小鼠足趾腫脹組織中COX-1、COX-2 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型對照組小鼠足趾腫脹組織中COX-1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，槐果堿組小鼠足趾腫脹組織中COX-1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。各組小鼠足趾腫脹組織中COX-1、COX-2 mRNA表達(dá)電泳圖見圖1，測定結(jié)果見表5。

圖1 各組小鼠足趾腫脹組織COX-1、COX-2 mRNA表達(dá)電泳圖Fig 1 Electrophoregrams of mRNA expression of COX-1 and COX-2 in paw swelling tissue of mice in each group

表5 各組小鼠足趾腫脹組織中COX-1、COX-2 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 5 Determination result of mRNA expressions of COX-1 and COX-2 in paw swelling tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表5 各組小鼠足趾腫脹組織中COX-1、COX-2 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 5 Determination result of mRNA expressions of COX-1 and COX-2 in paw swelling tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05

COX-2/β-actin 0.142±0.029 0.316±0.037＊＊0.246±0.034＊＊#組別空白對照組模型對照組槐果堿組劑量，mg/kg 光密度值40 COX-1/β-actin 0.251±0.037 0.245±0.043 0.229±0.041

3.6 各組小鼠足趾腫脹組織中COX-1、COX-2蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型對照組小鼠足趾腫脹組織中COX-1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），COX-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，槐果堿組小鼠組織腫脹組織中COX-1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），COX-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。各組小鼠足趾腫脹組織中COX-1、COX-2蛋白表達(dá)電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表6。

圖2 各組小鼠足趾腫脹組織COX-1、COX-2蛋白表達(dá)電泳圖Fig 2 Electrophoregrams of protein expression of COX-1 and COX-2 in paw swelling tissue of mice in each group

4 討論

炎癥和疼痛是臨床上常見的病癥，各種原因都可能引發(fā)炎癥或疼痛，兩種癥狀往往相互伴隨同時(shí)出現(xiàn)。臨床常用的抗炎鎮(zhèn)痛藥具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用，主要用于緩解關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性疾病、發(fā)熱及疼痛等慢性炎性痛病癥，但在應(yīng)用的過程中易產(chǎn)生消化道出血、肝腎損傷等不良反應(yīng)，影響了其在臨床上的應(yīng)用[11-12]。因此尋找抗炎鎮(zhèn)痛效果好、不良反應(yīng)少的抗炎鎮(zhèn)痛藥物一直是醫(yī)學(xué)研究的重要任務(wù)之一。槐果堿是從中藥苦豆子中提取的一種重要生物堿，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其對神經(jīng)病理性疼痛具有很好的緩解作用[4-6]，為進(jìn)一步證實(shí)其是否具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，筆者進(jìn)行了本研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槐果堿40、20 mg/kg槐果堿可明顯減少冰醋酸致小鼠扭體次數(shù)、提高熱板致小鼠疼痛的痛閾值及抑制角叉菜膠致小鼠足腫脹的腫脹度，并且可抑制炎癥部位氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示槐果堿具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化應(yīng)激作用[1]。

表6 各組小鼠足趾腫脹組織COX-1、COX-2蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 6 Determination result of protein expressions of COX-1 and COX-2 in paw swelling tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表6 各組小鼠足趾腫脹組織COX-1、COX-2蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 6 Determination result of protein expressions of COX-1 and COX-2 in paw swelling tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型對照組比較，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model control group，##P＜0.01

灰度值COX-2/β-actin 0.115±0.029 0.366±0.063＊＊0.237±0.040＊＊##組別空白對照組模型對照組槐果堿組劑量，mg/kg 40 COX-1/β-actin 0.332±0.055 0.343±0.040 0.358±0.052

炎性痛是在各種致炎、致痛因子等刺激下產(chǎn)生的反應(yīng)，可促使大量活性氧簇（ROS）及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等生成，SOD及GSH-Px的水平及活性降低，機(jī)體的T-AOC顯著減弱，使線粒體功能出現(xiàn)障礙，溶酶體及脂質(zhì)膜遭到破壞，加重組織器官損傷，進(jìn)一步加重和放大炎癥和疼痛反應(yīng)，產(chǎn)生惡性循環(huán)。因此，控制氧化應(yīng)激反應(yīng)是緩解炎性痛的重要措施之一[10，13]。相關(guān)研究報(bào)道，在炎性痛發(fā)生發(fā)展過程中，COX-2/PGE2信號通路參與其中[14]。COX是花生四烯酸代謝合成PGs的關(guān)鍵酶，目前發(fā)現(xiàn)主要有COX-1和COX-2兩種同工酶亞型[15]，COX-1為結(jié)構(gòu)型酶，主要參與血管、腎、胃等組織的正常生理活動(dòng)，其水平在體內(nèi)相對穩(wěn)定，對保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，如果其活性被抑制，則可能誘發(fā)相應(yīng)組織器官功能紊亂；COX-2為誘導(dǎo)型酶，各種損傷因素如化學(xué)、物理、外傷和細(xì)胞因子等可誘發(fā)其生成和活性增加，可催化花生四烯酸生成PGs[16]。PGs為一類強(qiáng)的炎性介質(zhì)，其中PGE2致炎作用更為強(qiáng)烈，可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞趨化聚集，擴(kuò)張毛細(xì)血管使其通透性增加，促進(jìn)炎性滲出，導(dǎo)致發(fā)熱及增加其他炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及白三烯等的致炎致痛作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生爆發(fā)式炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)和放大炎癥反應(yīng)，加重疼痛等級[17-20]。在本研究中，為了保證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物模型選擇的合理性，在進(jìn)行小鼠行為學(xué)觀察時(shí)，筆者選擇阿司匹林作為陽性藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在研究槐果堿抗炎、鎮(zhèn)痛作用機(jī)制時(shí)，由于阿司匹林抑制COX活性、減少PG的合成的鎮(zhèn)痛機(jī)制已經(jīng)明確[21]，且筆者主要研究待測藥物的作用機(jī)制，因此在此部分實(shí)驗(yàn)中只選擇了槐果堿40 mg/kg這一有效劑量進(jìn)行研究，未再設(shè)置陽性對照。槐果堿的抗炎鎮(zhèn)痛作用除了本研究所涉及的抗氧化應(yīng)激和抑制COX-2/PGE2信號通路外，可能還涉及其他的分子機(jī)制，筆者將在今后的研究中作進(jìn)一步探討。

綜上所述，槐果堿可明顯升高角叉菜膠致小鼠足趾腫脹組織中SOD、GSH-Px和T-AOC的水平，降低MDA、PGE2和COX-2 mRNA及蛋白的水平，提示槐果堿抗炎、鎮(zhèn)痛作用與其抗氧化應(yīng)激和抑制COX-2/PGE2信號通路有關(guān)。