原核生物轉(zhuǎn)錄組研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展

劉夢圓 冷艷 翟立翔 何麗芳 李師翁

（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，蘭州 730070）

近年來，隨著DNA高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和測序成本的大幅度降低，基于DNA測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用生物學(xué)研究之中。利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)挖掘功能基因是目前最主要的研究方向，是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)首先被應(yīng)用于真核生物的基因表達(dá)研究，由于原核生物RNA并不生成mRNA，因而其轉(zhuǎn)錄組研究起步較晚，但隨著RNA測序技術(shù)的突破，近年來，原核生物轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)展很快，特別是在致病細(xì)菌的致病機(jī)理的研究，細(xì)菌基因表達(dá)對環(huán)境脅迫的響應(yīng)機(jī)制，細(xì)菌降解環(huán)境污染物的分子機(jī)制等方面的研究，受到更為廣泛地關(guān)注，取得了許多重要的研究成果。

1 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)概述

轉(zhuǎn)錄組的概念是由Charlles Auffary于1996年提出［1]，并于1997年首次在文章中被使用。轉(zhuǎn)錄組是某一個生物個體、組織或細(xì)胞在某一特定的時間或特定環(huán)境條件下表達(dá)的完整的或近乎完整的轉(zhuǎn)錄本的總和。研究轉(zhuǎn)錄組對于了解基因組功能及其代謝機(jī)理至關(guān)重要［2]。目前，常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序分析流程可分為實(shí)驗(yàn)設(shè)計與上機(jī)測序。實(shí)驗(yàn)設(shè)計包括樣品的采集和保存、總RNA的提取、RNA質(zhì)檢、目的RNA的富集、cDNA的合成及文庫構(gòu)建。測序后的數(shù)據(jù)分析包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、序列分析與轉(zhuǎn)錄本識別、轉(zhuǎn)錄本定量與功能分析、差異基因篩選、差異基因功能和代謝通路富集分析、差異基因表達(dá)分析以及差異基因功能注釋等。

2 原核生物轉(zhuǎn)錄組研究現(xiàn)狀

原核生物暴露于各種環(huán)境之中，營養(yǎng)限制、溫度、pH、氧氣、壓力、有機(jī)溶劑、重金屬、抗生素及其他微生物的存在與關(guān)系等，直接地作用于或影響原核生物。原核生物通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因表達(dá)以應(yīng)對環(huán)境的變化與環(huán)境壓力。因此，轉(zhuǎn)錄組分析能夠準(zhǔn)確有效地揭示原核生物響應(yīng)環(huán)境的機(jī)制。

表1 細(xì)菌響應(yīng)重金屬的轉(zhuǎn)錄組研究

2.1 細(xì)菌降解污染物的轉(zhuǎn)錄組研究

2.1.1 細(xì)菌響應(yīng)重金屬的轉(zhuǎn)錄組研究 重金屬污染是一個重大的環(huán)境問題，利用微生物去除或減少土壤或水體中重金屬污染，由于其低成本和生態(tài)友好的性質(zhì)，目前成為研究的熱點(diǎn)。微生物可以通過氧化還原作用改變特定金屬價態(tài)，降低重金屬的生物可利用性或潛在的毒性［3]。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)揭示了細(xì)菌作用于重金屬的機(jī)制（表 1）。在 Ag（I）、Pd（II）和Se（IV）脅迫下，Pantoeasp. IMH顯示了對所有金屬相同的抗性機(jī)制，即多重抗應(yīng)激蛋白BhsA和谷胱甘肽的解毒代謝。陽離子金屬（Ag+和Pd2+）的抗性機(jī)制主要是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硫酸鹽代謝，而草酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和砷的抗性機(jī)制則具體參與了對陰離子（SeO32-）的抗性和還原。此外，推測Ag（I）可通過葡萄糖作用轉(zhuǎn)化為AgNPs，細(xì)胞色素CpxP參與Pd（II）的還原。研究結(jié)果為 Ag（I）、Pd（II）和 Se（IV）的耐藥和降低機(jī)制提供了新的線索［4]。

Cr（VI）具有高可溶性和毒性，長期接觸會導(dǎo)致突變和致癌。Cr的另一種最穩(wěn)定、最常見的形式Cr（III）被認(rèn)為毒性小于 Cr（VI），然而 Cr（III）會引起DNA損傷，抑制細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶DNA弛豫激 活。Staphylococcus aureusLZ-01具 有 將 Cr（VI）有氧還原為Cr（III）的能力。轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，編碼硫氧還蛋白還原酶的基因和細(xì)胞色素c氧化酶復(fù)合物的主要亞基在Cr（VI）處理后均上調(diào)。29個abc型金屬/多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體和外排泵被上調(diào)，表明它們通過將Cr+泵出細(xì)胞來參與Cr（VI）抗性。26個DNA修復(fù)基因的上調(diào)說明Cr（VI）對DNA具有毒性，這些DNA保護(hù)蛋白需要對Cr（VI）應(yīng)激作出反應(yīng)［5]。Cr（VI）處理Shewanella oneidensisMR-1 24 h后培養(yǎng)上清液中未檢測到殘留Cr（VI），說明細(xì)胞完全吸收和/或還原了這種金屬。轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析發(fā)現(xiàn)，基因和蛋白表達(dá)譜的差異包括編碼鐵結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的基因的下調(diào)或低水平誘導(dǎo)（2-4倍）［6]。

2.1.2 芳香族化合物降解菌的轉(zhuǎn)錄組研究 了解降解的分子機(jī)制對制定有效的生物修復(fù)策略至關(guān)重要。近年來，有機(jī)污染物降解細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究日益增多（表2）。多環(huán)芳烴在人類影響的環(huán)境中普遍存在［19]，這可能與代表性污染源（如高溫燃燒、交通排放、生物質(zhì)燃燒）的大量釋放［20]和各種分散過程有關(guān)。環(huán)境中的多環(huán)芳烴有很大一部分可以被微生物去除，多環(huán)芳烴的微生物降解已經(jīng)成為一種重要的修復(fù)技術(shù)［21-22]。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了Bacillus subtilis對芳香族化合物的代謝機(jī)制，發(fā)現(xiàn)yfiDE（catDE）操縱子編碼一種兒茶酚2，3-雙加氧酶，這種酶是由兒茶酚強(qiáng)烈誘導(dǎo)的。yodED（mhqED）、ydfNOP（mhqNOP）操縱子和ykcA（mhqA）編碼對苯二酚特異性的外二醇加雙氧酶［21]。Rhodococcus jostiiRHA1能降解多氯聯(lián)苯（PCB），轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)該菌株具有6個新ORFs參與促進(jìn)PCB代謝，其中Ro10225蛋白對RHA1中PCB/聯(lián)苯雙氧合酶復(fù)合物的形成至關(guān)重要［22]。Corynebacterium jeikeiumK411降解香草醇的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，4-羥基-3-甲氧芐醇可導(dǎo)致95個基因的差異表達(dá)，其中86個基因上調(diào)，耐藥決定因子cmx和預(yù)測的毒力因子sapA和sapD的表達(dá)水平顯著提高。Mycobacteriumsp. A1-PYR降解不同多環(huán)芳烴的轉(zhuǎn)錄組分析表明，3種多環(huán)芳烴降解酶在二元底物中的表達(dá)水平明顯高于僅在吡咯底物中的表達(dá)水平［23]。這些酶構(gòu)成了一個完整的酶系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了PYR的所有轉(zhuǎn)化步驟，其大部分編碼基因在A1-PYR菌株的基因組中形成了一個新的基因級聯(lián)，為微生物降解難降解的多環(huán)芳烴與易降解的多環(huán)芳烴共代謝提供了分子視角。氯脲-乙基是一種典型的長期殘留磺脲類除草劑，長期滯留對輪作作物危害很大。微生物降解被認(rèn)為是最可接受的去除方法，但其降解機(jī)理尚不清楚。R.erythropolisD310-1是氯霉素-乙基高效的降解菌，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，菌株D310-1在氯霉素-乙基降解過程中上調(diào)了500個基因。主要KEGG代謝途徑為甲苯降解和氨基苯甲酸酯降解［24]。

2.1.3 石油烴降解菌的轉(zhuǎn)錄組研究 烴類屬于致癌物質(zhì)和神經(jīng)毒性有機(jī)污染物［25]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過了200種的微生物可以降解石油烴［26]，79個種屬的細(xì)菌可以利用烷烴作為唯一的碳源和能源［27]。將Acinetobacter venetianusRAG-1分別培養(yǎng)在十二烷、十二烷醇和醋酸鈉中，比較分析發(fā)現(xiàn)了3個編碼烷烴氧化的基因alkMa、alkMb和almA，其中alkMb的差異表達(dá)最顯著，參與了十二烷的氧化。與醋酸鈉培養(yǎng)基上生長的菌株比較，篩選出1 074個差異表達(dá)基因，其中622個基因上調(diào)，這些基因與烷烴的分解代謝和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)［28]。紅黏土促進(jìn)A.oleivoransDR1降解十六烷，其參與氧化應(yīng)激防御相關(guān)及上下游代謝的基因上調(diào)，表明紅黏土提高DR1十六烷利用過程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的反應(yīng)［29]。A.sp. HZ01可以降解蒽、菲、芘、正構(gòu)烷烴等，利用多環(huán)芳烴作為唯一碳源。菌株HZ01在石油處理16 h，轉(zhuǎn)錄組分析篩選到742個差異基因，大部分下調(diào)基因與細(xì)胞運(yùn)動性、糖代謝和編碼核糖體蛋白有關(guān)。而脂肪酸代謝途徑和部分單加氧酶、脫氫酶被激活，但TCA循環(huán)不活躍。末端氧化是菌株HZ01降解正構(gòu)烷烴的主要好氧途徑［30]。

2.2 致病菌的轉(zhuǎn)錄組研究

表2 有機(jī)污染物降解細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄組研究

開展原核生物轉(zhuǎn)錄組研究最多的是致病菌（表3），轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)成為研究宿主-病原菌相互作用復(fù)雜性的有效方法。深入了解致病菌的代謝途徑從而更好地實(shí)時控制，致病菌耐藥機(jī)制的研究對新藥研發(fā)提供有力依據(jù)。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)鏈霉素依賴菌株Mycobacterium tuberculosis18b可以作為LTBI模型，并為結(jié)核桿菌的進(jìn)化和核糖體的功能提供了見解［52]。轉(zhuǎn)錄組分析了鼠傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium對氟喹諾酮的耐藥機(jī)制，耐藥性菌株TN4和TW4他們出現(xiàn)了大量差異表達(dá)基因，其中28個與耐藥相關(guān)，26個與兩個耐藥菌株的雙組分系統(tǒng)相關(guān)，TW4的輸出泵基因差異表達(dá)比TN4更強(qiáng)烈［53]。在體外培養(yǎng)條件下鰻弧菌Vibrio anguillarumM3生長中后期代謝途經(jīng)相關(guān)的基因有3 159個，其中129個為新基因［54]。對鰻弧菌轉(zhuǎn)錄組研究增強(qiáng)了我們對于其致病力的了解。耐寒產(chǎn)單核李斯特菌Listeria monocytogenes轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn)參與合成支鏈脂肪酸的9個基因及內(nèi)蛋白A、D基因等都表達(dá)上調(diào)［55]。轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)提供了關(guān)于L.monocytogenes單核細(xì)胞基因冷誘導(dǎo)膜成分變化、其冷應(yīng)激調(diào)控因子生長階段依賴性以及反義轉(zhuǎn)錄本在調(diào)節(jié)其冷應(yīng)激反應(yīng)中的積極作用的新信息。該研究增加了我們對李斯特菌的冷應(yīng)激反應(yīng)知識的了解，有助于在食品供應(yīng)鏈中對其進(jìn)行更有效的控制。

表3 致病菌的轉(zhuǎn)錄組研究

3 展望

轉(zhuǎn)錄組是研究表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄本功能的，對于解密基因組的功能復(fù)雜性及更好地理解生物體的活動，包括發(fā)育、免疫防御和應(yīng)激反應(yīng)是至關(guān)重要的。目前，對于細(xì)菌的生理機(jī)制研究已擴(kuò)展到分子層面，利用轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果，挖掘出降解功能基因及其代謝通路，構(gòu)建基因工程菌，進(jìn)一步提高生物修復(fù)的效率。隨著基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究日益積累，研究人員利用組學(xué)數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)了從更深層面對細(xì)菌作用機(jī)制的探索。另外，數(shù)據(jù)共享也加速推進(jìn)組學(xué)研究。近年來對于極端環(huán)境的探索也在不斷開拓，極端環(huán)境存在著豐富的微生物資源，有望在未來的研究中發(fā)現(xiàn)更多的微生物，并通過轉(zhuǎn)錄組層面研究，對其生長代謝機(jī)理進(jìn)行更深層面的挖掘。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第三代，相信在不遠(yuǎn)的將來，轉(zhuǎn)錄組研究會越來越普遍，為科學(xué)研究帶來幫助。