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    高效嚴(yán)謹(jǐn)型大腸桿菌Targetron基因打靶系統(tǒng)的構(gòu)建

    2019-07-26 09:10:46陳相好劉芳王彩霞陳崢宏洪偉蔡夢(mèng)迪張崢嶸3綦廷娜廖永慧谷俊瑩崔古貞
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年6期
    關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)型內(nèi)含子梭菌

    陳相好 劉芳 王彩霞 陳崢宏,3 洪偉 蔡夢(mèng)迪 張崢嶸,3綦廷娜,3 廖永慧 谷俊瑩 崔古貞,3

    (1. 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴陽(yáng) 550004;2. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025;3. 貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025;4. 貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550004;5. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,貴陽(yáng) 550004)

    II型內(nèi)含子(Group II Intron)是在細(xì)菌、古細(xì)菌及高等植物細(xì)胞器(線粒體、葉綠體)中發(fā)現(xiàn)的一類核酶,由內(nèi)含子RNA和內(nèi)含子編碼蛋白(Intron Encoded Protein,IEP)組成[1-4]。其中,內(nèi)含子RNA具有核酶活性,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別雙鏈DNA;IEP具有反轉(zhuǎn)錄酶和DNA核酸內(nèi)切酶活性,與內(nèi)含子RNA組裝為核糖核蛋白復(fù)合體,維持內(nèi)含子RNA的空間結(jié)構(gòu),輔助內(nèi)含子RNA識(shí)別靶位點(diǎn),并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性切割靶位點(diǎn),而且IEP能以內(nèi)含子RNA為模板合成cDNA,從而將內(nèi)含子RNA以DNA形式插入到染色體靶位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)內(nèi)含子 RNA 的“歸巢”[5-9](圖 1)。

    圖1 II型內(nèi)含子的“歸巢”示意圖

    來(lái)源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Ll.LtrB內(nèi)含子因其較高的“歸巢”效率,已被開發(fā)為高效Targetron基因打靶系統(tǒng),并在革蘭陽(yáng)性細(xì)菌(如丙酮丁醇梭菌、解纖維梭菌、艱難梭菌、金黃色葡萄球菌)[10-16]和革蘭陰性細(xì)菌(如大腸桿菌、綠膿桿菌和根癌農(nóng)桿菌)[17]等多個(gè)細(xì)菌中獲得廣泛應(yīng)用,尤其適用于難改造的革蘭氏陽(yáng)性厚壁細(xì)菌,如肉毒梭菌、艱難梭菌和解纖維梭菌等。該技術(shù)在梭菌中也稱為Clos tron技術(shù)[6]。在前期研究中發(fā)現(xiàn),II型內(nèi)含子的表達(dá)方式對(duì)Targetron系統(tǒng)的打靶效率及打靶精度具有很大的影響[18]。如來(lái)源于pSY6的Targetron系統(tǒng),因其II型內(nèi)含子的表達(dá)是受ptb組成型啟動(dòng)子調(diào)控,II型內(nèi)含子在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期大量存在,使其在解纖維梭菌中存在一定的脫靶現(xiàn)象。當(dāng)把組成型啟動(dòng)子更換為阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子后,因其表達(dá)量和表達(dá)模式可以根據(jù)需要隨時(shí)受到調(diào)控,其脫靶現(xiàn)象大幅度降低[18]。因此,構(gòu)建不同的誘導(dǎo)型Targetron系統(tǒng)可以提高其打靶效果。

    本研究將來(lái)源于Ll.LtrB的II型內(nèi)含子置于T7-lac操縱子控制之下,構(gòu)建了IPTG誘導(dǎo)型Targetron質(zhì)粒,并通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間,在大腸桿菌中建立了誘導(dǎo)型Targetron體系,旨為II型內(nèi)含子的機(jī)理研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)均用37℃在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),LB液體培養(yǎng)基的配制:1% TRYPTONE、0.5% YEAST EXTRACT、1% NaCl,在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%的Agar Powder成為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基。質(zhì)粒構(gòu)建及II型內(nèi)含子誘導(dǎo)表達(dá)所用氨芐青霉素的篩選濃度為100 μg/mL,藍(lán)白斑篩選時(shí),在LB固體培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(100 μg/mL)、X-gal(40 μg/mL)和 IPTG(0.1 mmol/L)。

    1.1.2 主要試劑 高保真DNA聚合酶、DNA marker、T4 DNA連接酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,Taq DNA 聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司,限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific,Gibson組裝試劑盒購(gòu)自NEB,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司,IPTG、X-gal、氨芐青霉素購(gòu)自北京索萊寶公司,引物合成及測(cè)序由上海生工完成。

    1.1.3 引物 本研究所用到的引物詳見表1。

    1.1.4 菌株及質(zhì)粒 本研究中用的菌株及質(zhì)粒詳見表2。

    表1 本研究所用到的引物

    表2 本研究所用到的菌株及質(zhì)粒

    1.2 方法

    1.2.1 打靶引物設(shè)計(jì) 以大腸桿菌lacZ基因?yàn)榘谢?,利用在線網(wǎng)址(www.clostron.com),結(jié)合評(píng)分高低,選擇lacZ基因正義鏈第635位點(diǎn)(lacZ-635s)和反義鏈第1063位點(diǎn)(lacZ-1063a)作為打靶位點(diǎn),每個(gè)打靶位點(diǎn)軟件會(huì)給出4種引物(IBS、EBS1d、EBS2、EBS Universal),設(shè)計(jì)獲得的引物序列詳見表1。

    1.2.2 IPTG誘導(dǎo)的Targetron打靶質(zhì)粒構(gòu)建 以pET28a載體為模板,lacI-T7-F和lacI-T7-R為引物,PCR擴(kuò)增lacI-T7片段。利用Gibson組裝試劑盒將lacI-T7擴(kuò)增產(chǎn)物與XmaI/XhoI雙酶切的pSY6載體組裝,獲得IPTG誘導(dǎo)型Targetron載體pSY7(圖2)。

    通過(guò)重疊延伸PCR方法構(gòu)建內(nèi)含子RNA打靶識(shí)別片段,用XhoI和BsrGI雙酶切PCR產(chǎn)物和pSY7質(zhì)粒,T4 DNA連接酶連接得到兩個(gè)位點(diǎn)的特異性打靶質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a,詳細(xì)構(gòu)建流程如圖2所示。

    1.2.3 大腸桿菌BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化 利用熱激法將質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,置于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。

    1.2.4 IPTG濃度對(duì)Targetron打靶效率的影響 取40 μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入到4 mL的LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg/mL氨芐青霉素),37℃、200 r/min培養(yǎng)1 h,加入不同終濃度的IPTG置于37℃、200 r/min培養(yǎng)45 min,離心收集細(xì)胞沉淀,稀釋后涂布LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L),37℃過(guò)夜培養(yǎng),通過(guò)藍(lán)白斑計(jì)數(shù)計(jì)算其打靶效率。

    1.2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)Targetron打靶效率的影響 加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo),通過(guò)藍(lán)白斑計(jì)數(shù)計(jì)算其打靶效率,其余操作同1.2.4。

    2 結(jié)果

    2.1 IPTG誘導(dǎo)的Targetron質(zhì)粒構(gòu)建

    IPTG誘導(dǎo)的pSY7質(zhì)粒詳細(xì)構(gòu)建流程如圖1所示。pSY7質(zhì)粒經(jīng)XmaI/XhoI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),可見清晰的約1.7 kb大小的電泳條帶(圖3),與預(yù)期結(jié)果一致,表明誘導(dǎo)型Targetron質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖3 質(zhì)粒pSY7酶切驗(yàn)證及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

    2.2 lacZ-635s和lacZ-1063a位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒構(gòu)建

    利用重疊延伸PCR方法,以設(shè)計(jì)的lacZ-635s和lacZ-1063a兩個(gè)位點(diǎn)的特異引物為引物,以Targetron載體指導(dǎo)RNA序列為模板,擴(kuò)增lacZ-635s和lacZ-1063a兩個(gè)位點(diǎn)的特異性打靶片段。圖4-A表示第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果,瓊脂糖凝膠電泳顯示,分別獲得打靶序列上游約0.25 kb和下游約0.1 kb的片段;圖4-B表示第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果,瓊脂糖凝膠電泳顯示獲得0.35 kb特異性條帶。然后,分別用XhoI/BsrGI雙酶切第二輪PCR產(chǎn)物和pSY7載體,T4 DNA連接酶連接后獲得特異性打靶載體pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a。雙酶切驗(yàn)證與預(yù)期結(jié)果一致(圖4-C);最后,通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)兩個(gè)位點(diǎn)的打靶載體均構(gòu)建成功。

    圖4 Targetron載體構(gòu)建及酶切驗(yàn)證

    2.3 IPTG誘導(dǎo)型Targetron打靶系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)性分析及功能驗(yàn)證

    將打靶質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),復(fù)蘇后直接涂布LB平板,過(guò)夜培養(yǎng)后分別挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明,未經(jīng)誘導(dǎo)的Targetron質(zhì)粒涂平板后獲得的菌落均是野生型,表明本研究構(gòu)建的Targetron系統(tǒng)具有較好的嚴(yán)謹(jǐn)性。

    同時(shí),進(jìn)行平行試驗(yàn),將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌首先經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)1 h,稀釋后涂布LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素 100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L),過(guò)夜培養(yǎng)后,分別挑取平板上的白色菌落和藍(lán)色菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖5所示:當(dāng)用打靶位點(diǎn)上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證時(shí),突變株得到約1.9 kb的PCR擴(kuò)增條帶,而野生型對(duì)照菌株得到約1.0 kb的PCR擴(kuò)增條帶(圖5-B)。當(dāng)利用插入序列的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物進(jìn)一步進(jìn)行PCR驗(yàn)證時(shí),兩種突變株均得到0.65 kb和1.6 kb的PCR擴(kuò)增條帶(圖5-C)??傊鲜鼋Y(jié)果表明,本研究成功構(gòu)建IPTG誘導(dǎo)型Targetron打靶系統(tǒng)。

    圖5 Targetron基因打靶系統(tǒng)的功能驗(yàn)證

    2.4 IPTG濃度對(duì)打靶效率的影響

    質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),使用不同濃度的IPTG分別誘導(dǎo)45 min。結(jié)果(圖6)顯示,在沒有IPTG誘導(dǎo)時(shí),兩種質(zhì)粒的打靶效率均為0,隨著IPTG濃度的提高,其歸巢效率也逐步提高,當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí),兩種質(zhì)粒的打靶效率達(dá)到最高值,達(dá)到90%以上。

    圖6 IPTG濃度對(duì)歸巢效率的影響

    2.5 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)打靶效率的影響

    質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)15 min、30 min、45 min、60 min。如圖7所示,兩種質(zhì)粒的打靶效率隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加,當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到45 min時(shí),兩種質(zhì)粒的打靶效率達(dá)到最大值。

    圖7 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)歸巢效率的影響

    3 討論

    來(lái)源于乳酸乳球菌的LtrB內(nèi)含子,在內(nèi)含子編碼蛋白的輔助下,成為高效可移動(dòng)的元件。由于II型內(nèi)含子通過(guò)IEP及內(nèi)含子RNA共同識(shí)別目標(biāo)DNA序列,利用Targetron在線設(shè)計(jì)網(wǎng)址找到潛在內(nèi)含子識(shí)別位點(diǎn),結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)內(nèi)含子RNA修飾改造,從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)含子RNA的特異性“歸巢”,基于此建立的基因打靶技術(shù)被廣泛應(yīng)用于原核生物的遺傳改造,展現(xiàn)了可觀的應(yīng)用前景。有研究人員借助Targetron技術(shù)得以在包含毒性因子[19-21]、潛在藥物靶點(diǎn)[22-23]等方面深入研究。選擇Targetron設(shè)計(jì)網(wǎng)址得到的較高得分的潛在插入位點(diǎn),可防止II型內(nèi)含子的脫靶,并且不需要遺傳篩選標(biāo)記,通過(guò)克隆PCR能輕易地篩選到突變菌株。

    然而,無(wú)論在何種微生物中應(yīng)用,II型內(nèi)含子的長(zhǎng)期表達(dá)和大量積累均會(huì)降低其打靶精度,不利于其后續(xù)的遺傳篩選。本研究建立的IPTG誘導(dǎo)型基因打靶系統(tǒng),利用T7-lac操縱子與內(nèi)含子組裝,實(shí)現(xiàn)了Targetron系統(tǒng)在大腸桿菌中的可控誘導(dǎo)表達(dá),而且可以根據(jù)需要,調(diào)控Targetron系統(tǒng)的表達(dá)模式,如在何時(shí)需要II型內(nèi)含子表達(dá)、II型內(nèi)含子的表達(dá)的強(qiáng)度是多少等,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的精確調(diào)控。

    目前常用的基因打靶技術(shù)如基于同源重組原理的RecA系統(tǒng)和Red系統(tǒng),其重組效率較低,需要進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化和篩選方可獲得突變株,實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)[24]?;贒NA斷裂損傷、激發(fā)機(jī)體修復(fù)機(jī)制的基因編輯方法如鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸 酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技術(shù),該技術(shù)具有靶向精確、細(xì)胞毒性低等優(yōu)勢(shì),已在多個(gè)物種中獲得廣泛應(yīng)用。然而,該技術(shù)均以蛋白作為向?qū)В枰獦?gòu)建復(fù)雜的載體系統(tǒng),技術(shù)難度較大,成本較高[25]。此外,CRISPRCas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9 system)技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù),該技術(shù)以RNA為向?qū)В瑑H需改變約20 bp的RNA序列即可實(shí)現(xiàn)不同基因的打靶,具有效率高、成本低、操作方便等優(yōu)勢(shì),但仍存在一定的脫靶風(fēng)險(xiǎn)[25]。本研究中采用的Targetron基因打靶技術(shù)是基于細(xì)菌II型內(nèi)含子的“歸巢”原理而設(shè)計(jì),該技術(shù)以內(nèi)含子RNA為向?qū)?,通過(guò)改變內(nèi)含子RNA的序列實(shí)現(xiàn)不同基因的打靶,具有效率高,操作方便等優(yōu)勢(shì),尤其適用于微生物的遺傳改造。本研究將T7-lac操縱子與Targetron基因打靶系統(tǒng)聯(lián)合,成功構(gòu)建誘導(dǎo)型Targetron系統(tǒng),極大地縮短了實(shí)驗(yàn)周期,提高了工作效率。

    本研究中建立的方法由于采用的是T7-lac操縱子啟動(dòng)內(nèi)含子RNA及內(nèi)含子編碼蛋白的表達(dá),而T7啟動(dòng)子需要和T7 RNA聚合酶相互識(shí)別才能發(fā)揮功能,并且在不同的微生物中,需要不同的復(fù)制元件,故本研究建立的方法限于編碼T7 RNA聚合酶的大腸桿菌系統(tǒng)。但是通過(guò)在質(zhì)粒上構(gòu)建T7 RNA聚合酶的序列及更換合適的復(fù)制元件,便可用于其他微生物的遺傳改造。總之,本研究建立的誘導(dǎo)型Targetron技術(shù),為II型內(nèi)含子的功能應(yīng)用與機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

    4 結(jié)論

    本研究將T7-lac操縱子與II型內(nèi)含子組裝得到了大腸桿菌IPTG誘導(dǎo)型Targetron基因打靶系統(tǒng),利用克隆PCR,驗(yàn)證了其具有嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn),并通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件,提高了基因打靶的效率。

    致謝:

    感謝中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所姜衛(wèi)紅課題組提供pSY6質(zhì)粒。

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