文冠果果實轉(zhuǎn)錄組測序及分析

趙陽陽 郭雨瀟 張凌云

（北京林業(yè)大學(xué) 森林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，北京 100083）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliaBunge）又名文冠花、文光花、僧燈毛道，隸屬無患子科（Sapindaceae）文冠果屬（XanthocerasBunge），單屬單種。一般為亞喬木或大灌木，遍布華北、華東及西北地區(qū)［1-2]。文冠果具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆能力，種子營養(yǎng)豐富、種仁含油率高，是一種珍貴的木本油料植物，有北方油茶之稱，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?]。目前對于文冠果的研究多集中在生長發(fā)育［4-6]、栽培管理［7-8]、油脂組成及提?。?，5，9-11]、生物柴油制備［12-13]和常規(guī)育種［14]等方面，也有一些基因克隆和功能分析［15-19]，關(guān)于果實生長發(fā)育過程中的分子機(jī)理研究很少。

轉(zhuǎn)錄組測序研究能夠從整體水平研究基因功能與基因結(jié)構(gòu)并揭示特定生物學(xué)過程的分子機(jī)理，廣泛應(yīng)用于分析生物和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域［20]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)發(fā)展，測序時間和成本顯著降低，很多模式和非模式植物完成了轉(zhuǎn)錄組測序，文冠果的轉(zhuǎn)錄組測序也取得了很大進(jìn)展。Liu 等［21]對文冠果芽、花、葉和種子的混合樣進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了文冠果參考轉(zhuǎn)錄組。敖妍等［22]應(yīng)用Illumina Hi-seqTM2000高通量測序技術(shù)對文冠果花芽進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析來解析文冠果花芽形態(tài)分化的分子調(diào)控模式與機(jī)制。劉玉林等［23]在對7個省份16份文冠果葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上分析和篩選了轉(zhuǎn)錄組序列中的SSR標(biāo)記，并設(shè)計開發(fā)ESTSSR標(biāo)記，為文冠果的遺傳多樣性分析提供標(biāo)記資源。申展等［24]運用SSR標(biāo)記的方法，研究了全國14個地區(qū)具有代表性的138份文冠果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并逐步構(gòu)建出25份文冠果核心種質(zhì)。文冠果果實為主要收獲部位，果實發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)積累決定了產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，是文冠果研究的重點，而文冠果果實發(fā)育過程分子機(jī)理尚不清楚。

本研究利用Illumina Hi-seqTM2000高通量測序平臺對兩個發(fā)育時期的文冠果果實進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，可以全面了解文冠果果實基因表達(dá)情況，獲得大量基因序列，同時可以開發(fā)SSR分子標(biāo)記，為后期文冠果品種鑒定和分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

文冠果果實采集于北京市圓明園內(nèi)長勢良好，無病蟲害的20年生實生樹。通過物候觀察，樣品采集時間分別為2017年盛花后20 d（1號樣）和60 d（2號樣），分別在樹體東南西北不同方位各采集3個果實，混勻，然后立即放入液氮中帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與文庫構(gòu)建 兩個時期樣品均混合12個果實提取RNA來建庫測序，以消除個體誤差。總RNA提取采用植物總RNA提取試劑盒（Omega，美國），NanoDropTM2000 分光光度計（Thermo Fisher，美國）和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度、濃度和完整性。檢驗合格的文冠果果實總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，加入Fragmentation Buffer 使其成為短片段，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成cDNA第1鏈，然后加入緩沖液、dNTAs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈；再經(jīng)過QiuQuick PCR試劑盒（QIAGEN，德國）純化并加 EB 緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly（A）并加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建測序文庫。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序與組裝 利用Illumina HiseqTM2000對文冠果果實測序文庫進(jìn)行高通量測序。測序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng) base calling 轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)raw reads，經(jīng)過平臺過濾除雜和冗余去除后得到高質(zhì)量的clean reads，然后使用短reads 組裝軟件Trinity做轉(zhuǎn)錄組de novo組裝獲得Unigene。

1.2.3 Unigene功能注釋 使用BLAST 軟件將Unigene序列與NR（非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫）、Swiss-Prot（蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫）、GO（基因本體論數(shù)據(jù)庫）、COG/KOG（蛋白質(zhì)原核/真核同源數(shù)據(jù)庫）、eggNOG（直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫）、KEGG（京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫對比，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果，預(yù)測完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER軟件與Pfam（蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)庫對比，獲得Unigene的注釋信息。

1.2.4 SSRs（Simple Sequence Repeats） 檢 索 與 分析 利用MISA軟件檢測文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene，搜索其中的SSRs并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果及從頭組裝

堿基質(zhì)量值（Quality score）是堿基識別（Base calling）出錯的概率的整體映射。堿基質(zhì)量值越高表面堿基識別越可靠。文冠果果實發(fā)育早期樣本測得的Q30堿為89.51%，測得序列的GC含量占44.62%；發(fā)育后期樣本測得的Q30堿基百分比為89.60%，測得序列的GC含量占44.61%。經(jīng)過測序質(zhì)量控制，共得到42 545 764個序列讀取片段（Reads）：其中包含了12.74 Gb核苷酸序列信息，各樣品Q30堿基百分比均不小于89.51%，說明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)組裝。

測序數(shù)據(jù)組裝共獲得157 244個轉(zhuǎn)錄本，序列信息達(dá)261 799 238 bp，N50為2 693 bp，平均長度為1 664.92 bp。所得轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)一步組裝得到68 298個單基因簇（Unigene），序列信息總長度為59 281 489 bp，N50為 1 589 bp， 平 均 長 度 為867.98 bp。其中長度在300-500 bp的Unigene占比最高，為21.15%，長度在1 kb以上的Unigene占比24.49%（表1）。組裝完整性較高，可用于后續(xù)的注釋分析。

表1 文冠果果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果

2.2 功能基因注釋

利用BLAST軟件將獲得的Unigene數(shù)據(jù)信息分別在 Nr、Swiss-Prot、Pfam、GO、KOG和 KEGG數(shù)據(jù)庫比對，對所有注釋上的Unigene數(shù)目進(jìn)行分析統(tǒng)計。結(jié)果（表2）表明文冠果果實兩個樣本共包含68 298個Unigene，其中24 691個Unigene得到注釋，43 607個Unigene未得到注釋，獲得注釋的Unigene占總Unigene的36.15%。在注釋的Unigene中，Nr數(shù)據(jù)庫注釋的Unigene最多，達(dá)到24 059個；COG數(shù)據(jù)庫注釋的Unigene最少，僅有7 483個。注釋到長度300≤ 長度＜ 1 000 Unigene數(shù)為7 724個，其中注釋到Nr數(shù)據(jù)庫300≤長度＜ 1 000的最多，達(dá)到7 425個；注釋到COG數(shù)據(jù)庫300≤長度＜ 1 000 Unigene數(shù)最少，有1 544個。注釋到長度≥ 1 000個堿基的Unigene數(shù)為13 924個，其中注釋到Nr數(shù)據(jù)庫長度≥ 1 000 Unigene數(shù)最多，達(dá)到13 892個。

表2 文冠果果實基因的BLAST比對結(jié)果

根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫注釋顯示，Unigene注釋同源基因的物種分布圖如圖1所示，甜橙Citrus sinensis的同源序列最多，達(dá)7 131條，占注釋序列總數(shù)的29.65%，其次是克萊門柚Citrus clementina，匹配同源序列4 950條，占總注釋序列的20.58%，兩個物種所匹配的同源序列占總注釋序列的一半。其次匹配較高的分別是可可Theobroma cacao（1 916條，7.97%）、 葡 萄Vitis vinifera（1 539條，6.40%）、稻Oryza sativa（700條，2.91%）、毛果楊Populus trichocarpa（686，2.85%）、麻風(fēng)樹Jatropha curcas（662，2.75%）、蓖麻Ricinus communis（595，2.47%）、胡楊Populus euphratica（457，1.90%）、桃Prunus persica（377，1.57%）和其他物種（5 039，20.95%）。

圖1 文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫匹配物種分布

為了進(jìn)一步揭示文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene的功能分類，根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫注釋得到的信息，通過GO數(shù)據(jù)庫，對文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene進(jìn)行基因生物學(xué)特征功能分類。結(jié)果（圖2）顯示，GO數(shù)據(jù)庫注釋的14 766個文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene可分為細(xì)胞組分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）和生物過程（Biological process）等3個GO類別的54個小組。細(xì)胞組分涉及28 681個GO條目，分為17個功能組，其中細(xì)胞（6 588個）、細(xì)胞部分（6 588個）和細(xì)胞器（5 044個）涉及的Unigene較多；分子功能涉及18 283個GO條目，分為17個功能組，其中催化活性（7 790個）和結(jié)合活性（7 637個）含Unigene較多；41 373個GO條目歸屬于生物過程，分為20個功能組，其中代謝過程（10 120個）、細(xì)胞進(jìn)程（8 512個）和單一生物體過程（7 194個）涉及的Unigene較多。

圖2 文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene的GO功能分類圖

為了進(jìn)一步分析文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene的功能，進(jìn)行了KOG功能分類分析，結(jié)果如圖3所示，共獲得25個不同的功能分類，比較全面，包含了大多數(shù)的生命活動。其中，一般功能預(yù)測（General function prediction only）的基因數(shù)量最多3 998條（25.32%），是最大的功能類群，其次是翻譯后修飾、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)和分子伴侶（Posttranslational modification，protein turnover，chaperones）1 387條（8.62%），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類機(jī)制（Signal transduction mechanisms） 次 之， 由 1 254條（8.17%）， 碳 水化合物轉(zhuǎn)運與代謝（Carbohydrate transport and metabolism）也有870條（5.41%），另外劃分到脂類轉(zhuǎn)運與代謝（Lipid transport and metabolism）這一功能類別的有560條（3.61%），其他功能分類的基因數(shù)量不盡相同。

以KEGG數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，將8 284個文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene分為127個代謝通路（表3）。核糖體（445個）、碳代謝（320個）、氨基酸的生物合成（288個）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)處理（240個）和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（221個）等代謝通路涉及的Unigene較多。此外，淀粉和糖代謝通路涉及200個Unigene，脂肪酸代謝通路有81個，脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成和脂肪酸延長分別涉及40、40和30個Unigene。

圖3 文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene的KOG注釋分析

2.3 轉(zhuǎn)錄組SSRs特征分布

利用MISA軟件對篩選得到的1 kb以上的Unigene做SSR分析，結(jié)果如表4所示：共發(fā)現(xiàn)SSR位點11 732個。其中，單核苷酸SSR最豐富，有7 139個，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他種類SSR，占全部SSR的60.85%，平均長度最短，為12.46 bp；二核苷酸SSR（2 655個）和三核苷酸SSR（1 854個）分別占總SSR的22.63%和15.8%，平均長度分別為15.47 bp和16.53 bp；四核苷酸SSR（63）、五核苷酸SSR（11）和六核苷酸SSR（10）很少，三者之和不到總SSR的1%，其平均長度較長，六核苷酸SSR的平均長度達(dá)到43.2 bp。

3 討論

文冠果適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，含油率高，是我國重點發(fā)展的木本油料樹種，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?5-27]。目前關(guān)于文冠果的研究主要集中在生長發(fā)育［4-6]、栽培管理［7-8]、油脂組成及提?。?，5，9-11]、生物柴油制備［12-13]和常規(guī)育種［14]等方面，分子生物學(xué)方面的研究較少，果實發(fā)育過程中的基因表達(dá)情況尚不清楚。第二代高通量測序技術(shù)因測序時間短、成本低和數(shù)據(jù)量大的優(yōu)點近年來被廣泛應(yīng)用于組學(xué)研究中。本研究利用高通量測序技術(shù)得到了文冠果果實的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得12.74Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到6.31Gb，Q30堿基百分比在89.51%及以上，測序質(zhì)量較高。組裝后獲得了68 298個Unigene序列，其中長度在1 kb以上的Unigene有16 724條，組裝完整性良好。

Nr數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，由于缺少文冠果基因組和轉(zhuǎn)錄組，大量Unigene未獲得注釋，其中僅有24 691個Unigene得到注釋，占36.15%。這與松蘿鳳梨［28]、白鮮根［29]等已報道物種轉(zhuǎn)錄組測序注釋結(jié)果相似，說明文冠果果實轉(zhuǎn)錄組有大量序列需要深入挖掘。與甜橙Citrus sinensis的同源序列最多，達(dá)7 131條，占注釋序列總數(shù)的29.65%，其次是克萊門柚Citrus clementina，匹配同源序列4950條，占總注釋序列的20.58%，兩個物種所匹配的同源序列占總注釋序列的一半。

表3 文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene的KEGG注釋

通過GO數(shù)據(jù)庫對文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene進(jìn)行基因生物學(xué)特征功能分類，代謝過程（10 120個）、細(xì)胞進(jìn)程（8 512個）、催化活性（7 790個）和結(jié)合活性（7 637個）等含Unigene較多，總體來說，文冠果果實在細(xì)胞活動、代謝活動的基因表達(dá)豐度較高，表明文冠果果實自身具有較強(qiáng)的代謝能力。

續(xù)表

表4 文冠果果實轉(zhuǎn)錄組SSR分布特征

通過KOG數(shù)據(jù)庫注釋共獲得25個不同的功能分類，比較全面，包含了大多數(shù)的生命活動，文冠果果實轉(zhuǎn)錄組中Unigene主要涉及基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成和物質(zhì)代謝等功能分類，符合文冠果果實作為強(qiáng)“庫”器官積累營養(yǎng)物質(zhì)這一基本功能。

以KEGG數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，將8 284個文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene分為127個代謝通路，與Liu等［21]和敖妍等［22]研究結(jié)果不同，推測可能是由于取材不同造成的。本研究樣品為文冠果果實，而Liu等測序樣品為文冠果芽、花、葉和種子的混合樣，敖妍等以文冠果花芽為材料。本研究分離了大量涉及淀粉和糖代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成和脂肪酸延長等通路相關(guān)基因，為后期研究文冠果果實生長發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)積累奠定基礎(chǔ)。

目前限制文冠果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大因素就是種質(zhì)資源混亂，缺少優(yōu)良品種，僅利用外部形態(tài)學(xué)特征很難做到精細(xì)區(qū)分。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)除了用于基因挖掘及表達(dá)調(diào)控研究外，可以開發(fā)大量EST-SSR分子標(biāo)記。SSR標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建、目標(biāo)基因的標(biāo)定、指紋圖譜的繪制等研究中［20]。利用MISA軟件對篩選得到的1kb以上的Unigene做SSR分析，共發(fā)現(xiàn)SSR位點11 732個，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于劉玉林等［23]和申展等［24]研究結(jié)果中的SSR位點，分析是取材不同造成的結(jié)果差異。后期會將實驗結(jié)果與之進(jìn)行比對，篩選驗證開發(fā)出更可靠的SSR位點，用于文冠果種質(zhì)資源分類和優(yōu)良品種培育。

4 結(jié)論

本研究利用Illumina Hi-seqTM2000高通量測序平臺對兩個發(fā)育時期的文冠果果實進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得68 298個Unigene序列，共有24 691個Unigene得到注釋，占36.15%；GO數(shù)據(jù)庫注釋顯示14 766條Unigene分為細(xì)胞組分、分子功能及生物學(xué)過程3大類54個功能組；KOG數(shù)據(jù)庫中注釋到的13 994條Unigene功能系統(tǒng)分為25類；以KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，可將8 284個文冠果果實轉(zhuǎn)錄組Unigene分為127個代謝通路，可以全面了解文冠果果實的代謝途徑信息；在文冠果果實轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)11 732個SSR位點，最多的為單核苷酸SSR，占60.85%。