微波輔助提取銀耳多糖工藝優(yōu)化及其流變、凝膠特性

楊嘉丹，劉婷婷，張閃閃，曹宸瑀，王大為*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

銀耳（Tremella fuciformis）又名白木耳，雪耳[1]，是一種經(jīng)濟價值高，營養(yǎng)豐富的藥食兩用菌，具有滋補生津、潤肺養(yǎng)胃之功效[2]。銀耳多糖來源于銀耳子實體、孢子、發(fā)酵液中分離純化得到的帶有分支的雜多糖，具有抗腫瘤、抗氧化[3]、降低血脂[4]、促進傷口愈合[5]、增強免疫力[6]等功效。由于多糖普遍具有相對較大的分子質(zhì)量，通常以主鏈伴以側(cè)鏈的形式存在，同時它具有多個羥基和空間折疊結(jié)構(gòu)，故其具有其他物質(zhì)所不具有的加工特性和流變性質(zhì)[7]。許多天然存在的多糖由于其在不同條件下的獨特流變性質(zhì)而被用作增稠劑[8]、膠凝劑[9]和乳化劑[10]。雖然銀耳多糖的分子構(gòu)型、構(gòu)象和生物活性[1]已經(jīng)得到了廣泛研究，但是在水溶液中的動態(tài)流變學(xué)特性方面的研究依然非常有限，其凝膠特性目前鮮見相關(guān)報道。張姍姍等[11]將銀耳多糖浸提液作為部分乳化劑和增稠劑的替代，添加到花生蛋白飲料中提高了飲料穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)特性。祁營利[12]探究了銀耳全粉的流變學(xué)特性和其作為一種增稠劑的效果。Zhang Yakun等[13]利用熱水浸提法提取了銀耳多糖，并研究了銀耳多糖的流變學(xué)特性及其與肌原纖維蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)銀耳多糖在低脂肪肉制品加工中具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的銀耳多糖提取方法多為熱水浸提法，該法耗時長、成本高、提取率低[14]。

近年來，微波技術(shù)用于天然植物有效成分的提取已有大量報道，它具有快速、高效、安全、提取率高、節(jié)能等特點[15]。本研究中采用微波輔助法提取的銀耳多糖，其黏度增加，表現(xiàn)出更好的流變特性和凝膠特性，有利于將銀耳多糖乃至銀耳全粉最大化地應(yīng)用于食品工業(yè)中替代部分膠體的使用，例如果凍、軟糖制品等。這為銀耳在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳采購于沃爾瑪超市，冷水清洗除雜后60 ℃烘干，粉碎后過篩得到不同粒度的銀耳粉備用。無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UWave-1000微波紫外超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；UV2100紫外-可見分光光度計 美國UNICO公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；Alpha1-4LDplus真空冷凍干燥機德國Marin Christ公司；IR Prestige傅里葉變換紅外光譜儀日本島津公司；DHR-3流變儀 美國TA公司；TA/XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；DF-II型集熱式磁力攪拌器 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助提取銀耳多糖

準(zhǔn)確稱取所需粒度的銀耳粉10 g，按相應(yīng)的液料比加入蒸餾水，在一定時間和功率下進行微波輔助提取。將提取液離心（4 000 r/min，20 min）收集上清液，上清液脫蛋白（1/5 Sevag試劑，正丁醇-氯仿（1∶4，V/V），振蕩20 min），濃縮，醇沉（4 倍體積分數(shù)95%乙醇溶液，12 h，4 ℃），離心（4 000 r/min，20 min）得到的沉淀經(jīng)冷凍干燥后即為銀耳多糖。

1.3.2 單因素試驗

選取液料比、粒度、微波功率、微波時間為考察因素。提取溫度95 ℃，液料比設(shè)定為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g），粒度設(shè)定為60、80、100、120、140 目，微波功率設(shè)定為250、300、350、400、450 W，微波時間設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，以銀耳多糖提取率為考察指標(biāo)進行實驗。每組單因素試驗做3 組平行。單因素試驗中不變的因素設(shè)定為液料比60∶1（mL/g）、粒度100 目、微波功率300 W、微波時間1.0 h。

1.3.3 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對1.3.2節(jié)中的4 個單因素各取3水平，進行正交試驗，確定銀耳多糖的最佳提取工藝參數(shù)，因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.4 銀耳多糖提取率計算

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程為y=0.010 5x+0.088 5，R2=0.996 5。

銀耳多糖提取率的測定：將銀耳多糖提取液稀釋到一定質(zhì)量濃度，吸取1 mL于具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟操作，于波長490 nm處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出粗多糖的質(zhì)量濃度，按下式計算多糖提取率：

式中：Y為多糖提取率/%；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出的銀耳多糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣品體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為銀耳粉質(zhì)量/g。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

參照李晉等[17]方法，稱取銀耳多糖2 mg，加入200 mg烘干至恒質(zhì)量的KBr，置研缽中研磨均勻，用電動壓片機壓片，在4 000～400 cm-1范圍進行紅外掃描。

1.3.6 流變特性測試

稱取銀耳多糖20、100、200、300、400 mg，分別溶于20 mL蒸餾水中，60 ℃水浴鍋內(nèi)攪拌至完全溶解，得到質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15 mg/mL和20 mg/mL的銀耳多糖溶液。

使用具有40 mm平行板的流變儀研究銀耳多糖質(zhì)量濃度和溫度對其溶液黏度的影響，及不同溫度（5～40 ℃）和角頻率（0.1～100 r/s）下，不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液的動態(tài)黏彈性行為。測量儲能模量（G’）和損耗模量（G’’）并將其繪制為角頻率的函數(shù)。

1.3.7 凝膠特性測試

稱取銀耳多糖1 000、1 250、1 500、1 750、2 000 mg，分別溶于50 mL蒸餾水中，60 ℃水浴鍋內(nèi)攪拌至完全溶解，然后立即轉(zhuǎn)移至冷水（4～10 ℃）中，得到質(zhì)量濃度為20、25、30、35 mg/mL和40 mg/mL的銀耳多糖凝膠。質(zhì)構(gòu)分析之前于4 ℃冰箱內(nèi)貯存過夜。

使用質(zhì)構(gòu)儀在室溫下進行凝膠的質(zhì)構(gòu)分析。分析參數(shù)如下：P/36R不銹鋼圓柱形探頭，測前試速率和測中速率為1.0 mm/s，測后速率為10.0 mm/s，壓縮程度25%，觸發(fā)力5.0 g。每組實驗平行3 次進行。

1.3.8 溶解性測試

稱取一定量的銀耳多糖放入燒杯中，加定量蒸餾水，在60 ℃用磁力攪拌器攪拌，記錄多糖完全溶解所需時間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel進行繪圖，SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 液料比（a）、粒度（b）、微波功率（c）及微波時間（d）對銀耳多糖提取率的影響Fig. 1 Effects of liquid/material ratio (a), raw material particle size (b),microwave power (c) and radiation time (d) on the extraction efficiency of polysaccharide from T. fuciformis

由圖1a可知，液料比在30∶1～60∶1（mL/g）時，銀耳多糖的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)液料比大于60∶1（mL/g）時，銀耳多糖提取率呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢。適量的增加溶劑有利于提升銀耳多糖的提取率[18]，當(dāng)銀耳多糖充分溶出后，繼續(xù)增加溶劑使得后續(xù)濃縮和沉淀工藝難度加大，且提取率變化不顯著。因此，考慮到節(jié)約能源，選取液料比60∶1（mL/g）比較合適。

由圖1b可知，粒度對銀耳多糖提取率有一定影響，隨著粒度的變細，物料與溶劑接觸的表面積增大，有助于多糖加速溶出，使得銀耳多糖提取率增加。但當(dāng)物料粒度超過120 目時，粒度過細使得物料容易黏聚成團，減小了與溶劑接觸的表面積，進而銀耳多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢?？紤]成本和實際操作，選取粒度為120 目左右較為合適。

由圖1c可知，微波功率在250～450 W之間，隨著微波功率的增加，銀耳多糖的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)微波功率為400 W時，銀耳多糖的提取率最高，微波有助于提升物料內(nèi)部溫度使多糖加速溶出[19]，從而使得銀耳多糖提取率明顯增加。但微波功率過大會阻礙介質(zhì)滲入[20]，導(dǎo)致銀耳多糖提取率下降。因此，微波功率應(yīng)控制在400 W左右。

由圖1d可知，微波時間對銀耳多糖提取率的影響較為明顯，隨著微波時間的延長，銀耳多糖提取率增加，其原因可能是提取時間延長可明顯提高微波的反射、吸收和穿透效果，提高提取率[21]。當(dāng)微波時間超過2.0 h時，一次提取產(chǎn)生的細胞內(nèi)外濃度差達到平衡，銀耳多糖提取率呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢?？紤]時間和成本因素，提取時間選擇2.0 h較好。

2.2 正交試驗結(jié)果

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for orthogonal array design

根據(jù)表2中的R值可以得出，在所選試驗范圍內(nèi)，各因素對銀耳多糖提取率的影響主次為D（微波時間）＞B（粒度）＞C（微波功率）＞A（液料比）。由表3可知，液料比、粒度、微波功率和微波時間對提取率的影響均達到極顯著水平（P＜0.01），這一結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。由正交試驗結(jié)果得出，最優(yōu)方案為A1B2C2D2，即液料比50∶1（mL/g）、粒度120 目、微波功率400 W、微波時間2.0 h。經(jīng)驗證實驗，此條件下銀耳多糖的提取率為（33.25±0.14）%。

2.3 銀耳多糖紅外光譜分析

圖2 銀耳多糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 FIIR spectrum of polysaccharides from T. fuciformis

如圖2所示，3 202 cm-1和2 926cm-1的吸收帶分別來自糖類分子的O—H和C—H伸縮振動[22]。1 643 cm-1和1 416 cm-1可分別對應(yīng)于糖醛酸中的羰基C＝O振動和羰基C—O伸縮振動，這表明銀耳多糖是酸性多糖[23]。在1 026 cm-1和1 250 cm-1處的峰分別是由于糖環(huán)中的C—O—C伸縮振動和C—H可變角振動[24]。806 cm－1處的吸收峰為α-型吡喃糖的C—H彎曲振動或硫酸鹽組中的C—O—S[23,25]。這些結(jié)果表明銀耳多糖是含有硫酸化基團和糖醛酸的酸性雜多糖。

主要由糖醛酸組成的藻酸鹽和主要由硫酸化基團組成的角叉菜膠以其流變性和膠凝行為而被廣泛用于食品和生物醫(yī)藥行業(yè)[26-27]。類似的還有從滸苔中提取的多糖[28]。因此，具有硫酸化基團和糖醛酸的獨特多糖鏈的銀耳多糖，可能具有相似的流變性質(zhì)和膠凝行為。

2.4 銀耳多糖流變特性

2.4.1 剪切速率對黏度和應(yīng)力的影響

圖3 銀耳多糖溶液的穩(wěn)定剪切黏度η（a）和應(yīng)力σ（b）對剪切速率的依賴性Fig. 3 Shear rate dependence of steady shear viscosity (a) and stress (b) of TPS solutions at 25 ℃

表4 冪律模型擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters for the power law model

在25 ℃測試剪切黏度（η）對剪切速率在0.1～1 000 s－1之間的依賴性（圖3a）。所有質(zhì)量濃度下，銀耳多糖溶液的剪切黏度隨著剪切速率的增加而降低，表明銀耳多糖溶液表現(xiàn)出剪切變稀的假塑性[29]。但不同質(zhì)量濃度的黏度變化率不同。對于高質(zhì)量濃度的溶液，黏度隨著質(zhì)量濃度的增加而下降得更快；在相同的剪切速率下，溶液黏度隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。

隨著剪切速率的增加，應(yīng)力變化曲線（圖3b）顯示出與黏度曲線相反的趨勢。在所有質(zhì)量濃度下，銀耳多糖溶液的應(yīng)力隨著剪切速率的增加而增加，同樣也表明了溶液的剪切稀化行為。

將曲線擬合為冪律方程：η=kγn-1，其中，η為剪切黏度，k為一致性指數(shù)，γ為剪切速率，n為流動行為指數(shù)。n也稱為假塑性指數(shù)，即n為0～1的流體被歸類為假塑性流體；如果n=1，則流體為牛頓流體。如表4所示，通過冪律方程可以解釋銀耳多糖溶液的剪切稀化行為?？梢钥吹剑到y(tǒng)的n值在0.424 5～0.859 9之間，并且較高質(zhì)量濃度溶液顯示出更大的剪切稀化能力，表明了銀耳多糖溶液是假塑性流體。隨著銀耳多糖質(zhì)量濃度的增加，各個分子開始重疊，形成分子間連接或“連接區(qū)”，這種行為限制了含水體系中聚合物鏈的運動和拉伸。因此，黏度隨著質(zhì)量濃度的增加而顯著增加[30]。

圖4 不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液Fig. 4 Photos of TPS solutions at different concentrations

如圖4所示，將6 種不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液置于試管中，在4 ℃以45°傾斜24 h后觀察樣品狀態(tài)。隨著質(zhì)量濃度的增加，溶液透明度降低并且銀耳多糖溶液的黏度增加（圖3、4）。圖4顯示，與其他樣品相比，20 mg/mL溶液的流動性顯著減弱并且傾斜表面不再是水平的，初步形成了弱凝膠結(jié)構(gòu)。在下面的凝膠特性研究中，將著重于20 mg/mL及其以上質(zhì)量濃度的銀耳多糖凝膠。

2.4.2 溫度對表觀黏度的影響

如圖5所示，在1 000 s-1的剪切速率下，所有質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液的黏度隨著溫度的升高而降低。這可能是因為提高溫度促進了分子運動，使得銀耳多糖分子的卷曲結(jié)構(gòu)得到伸展，分子間的相互作用增強，且液體體積以及每個分子的平均占有體積增大，因此，整個體系的表觀黏度降低[31]。

圖5 剪切速率為1 000 s－ 1時銀耳多糖溶液表觀黏度對溫度的依賴性Fig. 5 Temperature dependence of apparent viscosity (η) of TPS solutions at shear rate of 1 000 s-1

2.4.3 動態(tài)黏彈性

圖6 不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液在25 ℃的動態(tài)流變學(xué)（A）以及10 mg/mL銀耳多糖溶液在不同溫度下的動態(tài)流變學(xué)（B）Fig. 6 Dynamic rheology of TPS solutions of different concentrations at 25 ℃ (A) and dynamic rheology of 10 mg/mL TPS solution at various temperatures (B)

圖7 25 ℃不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖溶液的tanδ和角頻率的關(guān)系（A）和不同溫度下10 mg/mL的銀耳多糖溶液的tanδ和角頻率的關(guān)系（B）Fig. 7 Relationship between tanδ of TPS solutions of different concentrations and angular frequency at 25 ℃ (A) and between tanδ of 10 mg/mL TPS solution and angular frequency at various temperatures (B)

如圖6和圖7所示，在25 ℃，G’和G″值隨角頻率的增加而增加（圖6A）。在低頻區(qū)域，所有質(zhì)量濃度下的G″都高于G’，表明銀耳多糖溶液在低角頻率下不能形成凝膠。G’和G’’的曲線在高頻區(qū)域相交后，G’高于G’’，表明銀耳多糖溶液此時可以形成弱凝膠結(jié)構(gòu)。tanδ（G’’/G’）值也可用于解釋溶液的流變行為。tanδ＜0.1，表示傳統(tǒng)的彈性凝膠，而tanδ＞0.1，傳統(tǒng)的弱凝膠[32]。由圖7A可以看到，銀耳多糖溶液不形成強彈性凝膠結(jié)構(gòu)。在所有溫度下，G’和G’’都隨著角頻率的增加而增加（圖6B）。在降低溫度時，G’顯著增加，G’和G’’的頻率依賴性降低。可以得出，銀耳多糖溶液僅在低溫和高角頻率下才能形成弱凝膠結(jié)構(gòu)。圖7B顯示10 mg/mL銀耳多糖溶液的tanδ隨著角頻率的增加而顯著降低，并且該降低的速率隨著溫度的升高而增加。因此，銀耳多糖溶液在低角頻率和高溫下不能形成凝膠結(jié)構(gòu)。銀耳多糖具有線性化學(xué)結(jié)構(gòu)，其在水溶液中變?yōu)槔p繞結(jié)構(gòu)，并且纏繞程度隨著剪切速率的增加而增加[24]。其他真菌多糖也有類似的現(xiàn)象，如黃山花菇多糖[33]。

2.5 質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果

如圖8所示，將5 種不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖凝膠置于試管中，在4 ℃以45°傾斜24 h后觀察樣品狀態(tài)。在低質(zhì)量濃度下，凝膠具有良好的透明度，傾斜表面和強流動性。隨著質(zhì)量濃度的增加，凝膠透明度和表面傾斜度降低，流動性減弱，并且表現(xiàn)出良好的凝膠化性能。

圖8 不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖凝膠Fig. 8 Photos of TPS gels at different concentrations

表5 不同質(zhì)量濃度銀耳多糖凝膠的質(zhì)構(gòu)特性Table 5 Textural characteristics of TPS gels at different concentrations

如表5所示，隨著銀耳多糖質(zhì)量濃度的增加，凝膠的硬度和咀嚼性增加，彈性降低。然而，當(dāng)銀耳多糖質(zhì)量濃度分別為35 mg/mL和40 mg/mL時，彈性增加至13.05%和17.23%。這些結(jié)果表明銀耳多糖與系統(tǒng)中的水之間存在一定的協(xié)同作用。增加的銀耳多糖在凝膠中產(chǎn)生填充效果，增強了這種協(xié)同作用。根據(jù)硬度和彈性值，銀耳多糖可以開發(fā)成一些產(chǎn)品，如果凍和軟糖。這意味著銀耳多糖可以用作食品中部分膠體的替代品。

2.6 溶解性結(jié)果

圖9 60 ℃銀耳多糖的溶解性Fig. 9 Solubility of TPS at 60 ℃

由圖9可知，在60 ℃，銀耳多糖的溶解性隨質(zhì)量濃度的增大而減小。在多糖溶液中，水與多糖的羥基形成大量的氫鍵，水化的多糖大分子形成環(huán)狀、螺旋狀或雙螺旋結(jié)構(gòu)，再通過分子的伸展及不同的點鍵合而構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并在一定質(zhì)量濃度下形成凝膠[34]。通過對銀耳多糖溶解性的研究，可為其在食品中產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

采用微波輔助法提取銀耳多糖，通過正交試驗優(yōu)化，得到實際最佳工藝條件為液料比50∶1（mL/g）、粒度120 目、微波功率400 W、微波時間2.0 h，此時多糖提取率達到（33.25±0.14）%。

通過傅里葉變換紅外光譜和流變學(xué)研究表明，銀耳多糖溶液是具有剪切稀化行為的假塑性流體。銀耳多糖溶液的動態(tài)黏彈性行為表明，G’和G″都表現(xiàn)出對質(zhì)量濃度，溫度和tanδ的強烈依賴性，在低溫和高頻下可以形成弱凝膠結(jié)構(gòu)。通過質(zhì)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)銀耳多糖質(zhì)量濃度顯著影響其凝膠的硬度、彈性和咀嚼性。此外，銀耳多糖質(zhì)量濃度對其溶解性的影響較大，其溶解性隨質(zhì)量濃度的增加而降低。結(jié)果表明，銀耳多糖具有良好的流變和凝膠特性，在食品加工中可提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值并減少食用膠的使用量，拓寬銀耳多糖的應(yīng)用范圍，提升其經(jīng)濟價值，以期為我國新型食品的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。