熱休克蛋白27通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制硼替佐米誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡

尚 晉， 王志紅， 陳志忠， 魏天南 ， 吳文冰， 陳為民

HSP27是小分子熱休克蛋白(small heat shock protein，sHsp)家族的一員，是一個(gè)重要的分子伴侶，生理狀態(tài)下機(jī)體表達(dá)構(gòu)成型HSP27，具有廣泛的生物學(xué)作用；在高溫、感染、創(chuàng)傷等“應(yīng)激”條件下表達(dá)誘導(dǎo)型HSP27，可協(xié)助細(xì)胞內(nèi)多種蛋白正確折疊和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)錯(cuò)配蛋白的降解，維持細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝平衡[1]。HSP27在胃、肝、胰腺、結(jié)直腸等多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)[2]，與腫瘤轉(zhuǎn)移、化療耐藥、不良預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白家族成員HSP90在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者的骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制HSP90可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡[5]。HSP90表達(dá)與骨髓瘤的臨床分期、腫瘤負(fù)荷和療效相關(guān)，可作為判斷預(yù)后的重要指標(biāo)[6]。MM是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的漿細(xì)胞來源的惡性腫瘤，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%，好發(fā)于中老年人，目前仍然是一種不可治愈的疾病[7]。硼替佐米(bortezomib，BTZ)是26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，以BTZ為代表的新藥治療MM患者總體有效率高達(dá)80%～90%，而且提高了緩解的深度，改善了生存質(zhì)量和生存時(shí)間[8]。但多個(gè)臨床資料顯示，部分MM患者對(duì)BTZ原發(fā)或繼發(fā)耐藥[9-10]，嚴(yán)重影響B(tài)TZ的臨床療效。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤惡性增殖的過程中，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量異常免疫球蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)[11]，BTZ過度激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡，是不同于內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑的全新凋亡途徑[12]。另一方面，HSP27等多種熱休克蛋白在藥物刺激等應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[13]，提示HSP27與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互作用，介導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)BTZ耐藥，具體機(jī)制不明。

本研究以人骨髓瘤細(xì)胞株U266，NCI-H929，MM1S及MM患者CD38+/CD138+漿細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察BTZ對(duì)HSP27表達(dá)的影響，采用RNA干擾技術(shù)抑制HSP27表達(dá)及慢病毒介導(dǎo)HSP27過表達(dá)，分析HSP27影響B(tài)TZ誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2017年1月—2018年5月筆者醫(yī)院收治的22例MM患者，男性13例，女性9例，年齡中位數(shù)62歲(50～75歲)。將12例初治MM患者和10例復(fù)發(fā)MM患者分為初治組和復(fù)發(fā)組。MM診斷和臨床分期參照2017年中國(guó)專家共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)[7]，入組患者染色體核型分析為正常核型，排除難治性骨髓瘤患者及合并其他腫瘤患者。所有臨床檢驗(yàn)樣本的采集均經(jīng)受檢者知情同意并獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2材料 人MM細(xì)胞株U266，NCI-H929和MM1S細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液及Opti-MEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，Lipofectamine 2000及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。兔抗人HSP27，p-HSP27，GRP78，p-PERK，cl-Caspase 3，cl-Caspase 9及內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(美國(guó)Affinity Biosciences公司)。慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(美國(guó)SBI公司)，慢病毒輔助質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2(廣州吉賽生物科技股份有限公司)。BTZ(批號(hào)：160923533，西安楊森生物制藥有限公司)；多柔比星(doxorubicin，DOX)(批號(hào)：17013012，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；依托泊苷(etoposide，Vp-16，批號(hào)：1609233，齊魯制藥有限公司)；4-苯基丁酸(批號(hào)：E8520，美國(guó)Sigma公司)。AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Gene Copoeia公司)。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TRIzol試劑(美國(guó)Life Technologies公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑及qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(廣州Geneseed公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500，美國(guó)ABI公司)；流式細(xì)胞儀(FACSCantoⅡ，美國(guó)BD公司)。

1.3方法

1.3.1原代骨髓瘤細(xì)胞收集和染色體分析 骨髓穿刺術(shù)抽取MM患者骨髓后通過流式細(xì)胞術(shù)分選骨髓瘤細(xì)胞(CD38+/CD138+漿細(xì)胞)，采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)法檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞中常見染色體異常，由武漢海思特康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè)，采用5種特異性探針(1q21，D13S319，RB-1，IgH和p53)，同時(shí)留存患者的臨床資料。

1.3.2siRNA沉默HSP27表達(dá) 將U266細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染HSP27-siRNA和NC-siRNA。應(yīng)用在線設(shè)計(jì)軟件(http://www.oligoengine.com)設(shè)計(jì)針對(duì)HSP27基因的siRNA序列：

正義鏈：5′-AAGACCAAGGAUGGCGUGGUGdTdT-3′

反義鏈：5′-CACCACGCCAUCCUUGGUCUUdTdT-3′

同時(shí)設(shè)計(jì)一條與HSP27基因無同源性的陰性對(duì)照siRNA：

正義鏈：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTdTdT-3′

反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′

U266細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱。每2～3天換液1次，每4～5天傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后接種至6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為含1%胎牛血清的培養(yǎng)液。分別將5 μL siRNA(20 μmol/L)溶解于200 μL Opti-MEM培養(yǎng)液中，同時(shí)取8 μL LipofectAMINE 2000溶解于200 μL Opti-MEM培養(yǎng)液中靜置5 min，將兩種Opti-MEM培養(yǎng)液混合，靜置20 min。最后將siRNA和LipofectAMINE 2000的混合液加入含1.6 mL Opti-MEM培養(yǎng)液的各組細(xì)胞中，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，后更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，分別采用qRT-PCR和Western-blot驗(yàn)證干擾HSP27基因后細(xì)胞中HSP27 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。

1.3.3慢病毒介導(dǎo)HSP27過表達(dá) 采用Pubmed檢索獲得HSP27基因全長(zhǎng)序列(GenBank：AB020027.1)，設(shè)計(jì)針對(duì)HSP27基因全長(zhǎng)序列的引物，并在引物兩端引入核酸內(nèi)切酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamHⅠ。HSP27基因引物序列為：

上游：5′-GCTCTAGAATGACCGAGCGCCG-3′

下游：5′-CGCGGATCCTTACTTGGCGG-3′

以人U266細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增獲得HSP27基因全長(zhǎng)序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后用XbaⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切(37 ℃，2 h)，慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro同時(shí)行雙酶切(37 ℃，2 h)，將純化的PCR產(chǎn)物在T4DNA Ligase連接酶的作用下(25 ℃，30 min)與線性化的慢病毒載體連接，構(gòu)建獲得重組pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro/HSP27慢病毒表達(dá)載體。以空載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro作為陰性對(duì)照，利用慢病毒輔助質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2包裝慢病毒載體，分別獲得重組慢病毒pCDH/HSP27和空載體慢病毒pCDH。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U266細(xì)胞，分別用慢病毒pCDH/HSP27和pCDH[感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為300]進(jìn)行感染；采用2 mg/L的嘌呤霉素(puromycin)進(jìn)行抗性篩選病毒感染后的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。分別采用qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)感染空載體pCDH(陰性對(duì)照組)和重組慢病毒pCDH/HSP27(pCDH/HSP27組)的U266細(xì)胞中HSP27 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。

1.3.4qRT-PCR法檢測(cè)HSP27 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 采用TRIzol一步法提取細(xì)胞中總RNA，測(cè)定其濃度，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板行PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)流程按照試劑盒說明書進(jìn)行；反應(yīng)體系為qPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL、上下游引物各10 μmol/L、50×ROX Reference Dye 20.4 μL、cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系至20 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性10 s→60 ℃退火和延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s和95 ℃ 15 s獲取熔解曲線。HSP27基因引物序列為：

上游：5′-CAAGGATGGCGTGGTGGA-3′

下游：5′-TCGAAGGTGACTGGGATGGT-3′

以β-actin為內(nèi)參照，引物序列為：

上游：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′

下游：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′

以2-△△Ct值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5Western-blot法檢測(cè)HSP27蛋白表達(dá) 提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞)，快速放進(jìn)預(yù)冷過的勻漿器中，按1∶10的體積比例加入含PMSF的蛋白裂解液，低溫下勻漿后將樣品轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP離心管中，12 000×g、4 ℃離心10 min，取上清液即為所提取的總蛋白。采用BCA法將蛋白定量后，行SDS-PAGE(分離膠濃度為10%)分離蛋白。隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉90 min；加入兔抗人HSP27，p-HSP27，GRP78，p-PERK，cl-Caspase 3，cl-Caspase 9和β-actin(內(nèi)參照)單克隆抗體(體積稀釋比例均為1∶5 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次；再加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(體積稀釋比例1∶5 000)]，室溫孵育120 min，TBST洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光法顯影、沖洗膠片。采用Image-Pro Plus 6.0灰度掃描軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1。取400 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻，室溫避光孵育10 min，離心去上清，重懸細(xì)胞后加入PI，終濃度為1 μg/mL，避光作用后用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1BTZ對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株HSP27 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組U266細(xì)胞加DMEM培養(yǎng)液，觀察組DMEM培養(yǎng)液中加入終濃度為2，5，10和20 nmol/L BTZ，8 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.94±0.96)%，觀察組5 nmol/L BTZ處理8 h細(xì)胞凋亡率為(3.23±0.91)%，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，以5 nmol/L BTZ為后續(xù)研究基線濃度。對(duì)照組U266，NCI-H929和MM1S細(xì)胞加DMEM培養(yǎng)液，觀察組U266，NCI-H929和MM1S細(xì)胞DMEM培養(yǎng)液中加入終濃度5 nmol/L BTZ處理8 h。qRT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，觀察組HSP27 mRNA表達(dá)顯著增加，HSP27和p-HSP27蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01，表1)。

表1 硼替佐米對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株HSP27 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

n=5. BTZ：硼替佐米；MM：多發(fā)性骨髓瘤. 與對(duì)照組細(xì)胞比較，☆：P<0.01.

2.2MM患者瘤細(xì)胞染色體分析及HSP27 mRNA和蛋白的表達(dá) 初治組與復(fù)發(fā)組患者的Durie-Salmon(DS)分期和International Staging System(ISS)分期比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組患者骨髓瘤細(xì)胞染色體類型和染色體異常數(shù)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)，復(fù)發(fā)組患者復(fù)發(fā)時(shí)與初治時(shí)比較未檢出新的染色體異常，兩組患者資料具有可比性。qRT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，與初治組比較，復(fù)發(fā)組患者骨髓瘤細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)顯著增加，HSP27和p-HSP27蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖1)。

2.3沉默HSP27表達(dá)對(duì)BTZ誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組與觀察組U266細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA和HSP27-siRNA，48 h后觀察組HSP27基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的28.61%和34.33%(P<0.01)。對(duì)照組和觀察組細(xì)胞凋亡率分別為(3.42±1.16)%和(3.98±1.06)%，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。將對(duì)照組和觀察組U266細(xì)胞分別暴露于終濃度5 nmol/L BTZ 24 h，兩組細(xì)胞的凋亡率分別為(7.68±1.19)%和(14.56±2.58)%；進(jìn)一步增加BTZ濃度，BTZ終濃度為10 nmol/L時(shí)，兩組的凋亡率分別為(16.11±5.15)%和(23.32±5.13)%；BTZ終濃度為20 nmol/L時(shí)，兩組的凋亡率分別為(25.44±5.81)%和(38.09±7.87)%；觀察組的凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P<0.01，圖2)。

2.4BTZ對(duì)U266細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組U266細(xì)胞加DMEM培養(yǎng)液，觀察組DMEM培養(yǎng)液中加入終濃度為5，10和20 nmol/L BTZ作用8 h。Western-blot結(jié)果顯示，隨著BTZ濃度增加，GRP78和p-PERK表達(dá)遞增，cl-Caspase 3和cl-Caspase 9表達(dá)顯著升高(P<0.05，圖3)。

表2初治與復(fù)發(fā)骨髓瘤患者臨床分期及染色體FISH分析比較

Tab 2Comparison of clinical stages and chromosomal abnormalities between newly treated and relapsed myeloma patients

項(xiàng) 目n初治組(%)n復(fù)發(fā)組(%)χ2PDS分期0.040.84 Ⅲ期A10(83.3)8(80.0) Ⅲ期B2(16.7)2(20.0)ISS分期0.040.84 Ⅰ期2(16.7)2(20.0) Ⅱ期4(33.3)3(30.0) Ⅲ期6(50.0)5(50.0)染色體類型 正常4(33.3)3(30.0)0.570.45 lq21擴(kuò)增5(41.7)5(50.0)0.150.70 IgH重排5(41.7)4(40.0)0.630.43 Rb1缺失6(50.0)5(50.0)0.730.39 D13S319 缺失7(58.3)4(40.0)2.930.09 p53 缺失2(16.7)3(30.0)0.080.78染色體異常數(shù)量0.020.87 0種4(33.3)3(30.0) 1種1(8.3)1(10.0) 2種1(8.3)1(10.0) 3種 3(25.0)3(30.0) 4種 2(16.7)1(10.0) 5種1(8.3)1(10.0)

DS：Durie-Salmon；ISS：International Staging System；FISH：熒光原位雜交.

A：qRT-PCR檢測(cè)MM患者骨髓瘤細(xì)胞；B，C，D：Western-blot檢測(cè)MM患者骨髓瘤細(xì)胞. A組：初治MM患者； B組：復(fù)發(fā)MM患者. BTZ：硼替佐米；MM：多發(fā)性骨髓瘤. 與A組比較，☆：P<0.01.圖1 MM患者骨髓瘤細(xì)胞HSP27 mRNA，HSP-27和p-HSP27蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig 1 The relative expression of HSP27 mRNA，HSP-27 and p-HSP27 protein in the myeloma cells of MM patients

BTZ：硼替佐米. 與NC-siRNA組比較，☆：P<0.01.圖2 沉默HSP27表達(dá)對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effect of silencing HSP27 expression on the apoptosis of U266 cells induced by BTZ

2.54-苯基丁酸對(duì)BTZ誘導(dǎo)U266細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活化的影響 對(duì)照組U266細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液預(yù)處理，觀察組以1 mmol/L 4-PBA預(yù)處理2 h。兩組細(xì)胞以20 nmol/L BTZ作用8 h。Western-blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，觀察組U266細(xì)胞cl-Caspase 3和cl-Caspase 9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01，圖4)。

2.6HSP27過表達(dá)對(duì)BTZ誘導(dǎo)U266細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)和Caspase-3活化影響 根據(jù)以上結(jié)果，推測(cè)HSP27通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響B(tài)TZ誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡。對(duì)照組U266細(xì)胞感染空載體慢病毒pCDH，觀察組U266細(xì)胞感染重組慢病毒pCDH/HSP27，48 h后觀察組HSP27 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的8.27和2.58倍(P<0.01)。兩組細(xì)胞以20 nmol/L BTZ作用8 h。Western-blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，觀察組U266細(xì)胞GRP78表達(dá)顯著下調(diào)，伴cl-Caspase 3表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01，圖5)。

BTZ：硼替佐米. 與NC組比較，☆：P<0.05.圖3 硼替佐米對(duì)U266細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effects of bortezomib exposure on expression of endoplasmic reticulum stress and apoptosis related proteins in U266 cells

4-PBA：4-苯基丁酸. 與NC組比較，☆：P<0.01.圖4 4-苯基丁酸對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)U266細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活化的影響Fig 4 Effect of 4-PBA on activation of Caspase-3 and Caspase-9 induced by bortezomib in U266 cells

與NC組比較，☆：P<0.01.圖5 HSP27過表達(dá)對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)U266細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)和Caspase-3活化的影響Fig 5 Effect of HSP27 overexpression on expression of GRP78 and activation of Caspase-3 induced by bortezomib in U266 cells

3 討 論

BTZ是26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，靶向作用于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitinproteasome system，UPS)，抑制核因子NF-κB活性，發(fā)揮抗骨髓瘤作用[14]。骨髓瘤對(duì)BTZ耐藥的機(jī)制較復(fù)雜，目前認(rèn)為與NF-κB信號(hào)通路異常、Bcl-2家族蛋白高表達(dá)、藥物誘導(dǎo)凋亡途徑異常、漿細(xì)胞去分化等有關(guān)，幾種不同機(jī)制可能同時(shí)參與耐藥[15]。本研究結(jié)果顯示，BTZ暴露引起骨髓瘤細(xì)胞熱休克反應(yīng)，顯著上調(diào)HSP27的表達(dá)和磷酸化；更為重要的是，siRNA沉默HSP27表達(dá)，顯著增加BTZ誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，HSP27通過負(fù)反饋機(jī)制介導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)BTZ耐藥，有望成為骨髓瘤治療的新靶點(diǎn)。

本研究采用CD138+免疫磁珠分選MM患者漿細(xì)胞，獲得高度富集的骨髓瘤細(xì)胞，檢測(cè)其HSP27表達(dá)水平，結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)骨髓瘤患者HSP27表達(dá)水平顯著高于初治患者，提示HSP27可作為骨髓瘤耐藥的預(yù)測(cè)因子及評(píng)估預(yù)后的參考指標(biāo)。體外研究發(fā)現(xiàn)，BTZ耐藥骨髓瘤細(xì)胞株NCI-H929的HSP27表達(dá)顯著上調(diào)[16]，抑制HSP27磷酸化顯著增加BTZ誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡[17]，本研究結(jié)果與其相仿。Chauhan等對(duì)地塞米松耐藥的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行寡核苷酸微陣列芯片分析，發(fā)現(xiàn)HSP27在耐藥骨髓瘤細(xì)胞中高表達(dá)，影響肌動(dòng)蛋白聚合和細(xì)胞骨架重排，沉默HSP27表達(dá)顯著增強(qiáng)了甲氧雌二醇和BTZ誘導(dǎo)的凋亡[18]。以上研究結(jié)果均提示HSP27參與骨髓瘤細(xì)胞耐藥，具體機(jī)制不明。

近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡逐漸引起人們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，MM細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激顯著增強(qiáng)[19]。一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，維持細(xì)胞生存[20]；另一方面，過度或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，超過細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)能力，誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，BTZ暴露顯著上調(diào)U266細(xì)胞GRP78和p-PERK的表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3和Caspase-9的活化，表明BTZ暴露增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過Caspase途徑誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步反證，U266細(xì)胞用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑預(yù)處理后，顯著減弱了BTZ暴露對(duì)Caspase-3和Caspase-9的活化，證實(shí)了這一猜想。分析其原因，可能與BTZ抑制了蛋白酶體活性，降低了未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白的泛素化降解，進(jìn)一步增強(qiáng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[22]。

在應(yīng)激條件下，HSP27作為分子伴侶，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、誘導(dǎo)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)降解，提示其具有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞應(yīng)激耐受性的巨大潛能。本研究結(jié)果顯示，用慢病毒介導(dǎo)U266細(xì)胞過表達(dá)HSP27后，BTZ暴露誘導(dǎo)的GRP78表達(dá)顯著降低，Caspase-3活化減弱，表明HSP27表達(dá)上調(diào)抑制BTZ誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少Caspase依賴的骨髓瘤細(xì)胞凋亡。Lamoureux等研究發(fā)現(xiàn)，靶向HSP27的反義寡核苷酸(OGX-427)可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增強(qiáng)HSP90抑制劑17-AAG誘導(dǎo)的小鼠膀胱癌細(xì)胞凋亡[23]。Rocchi等研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞中HSP27表達(dá)上調(diào)可以抑制STAT3信號(hào)通路活化及其下游基因c-fos和sPLA-2的表達(dá)，阻斷STAT3信號(hào)通路顯著削弱HSP27的細(xì)胞保護(hù)作用[24]。值得注意的是，STAT3信號(hào)通路是調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要信號(hào)通路之一，與腫瘤耐藥密切相關(guān)[25]。本研究結(jié)論與這些研究結(jié)果一致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以調(diào)節(jié)HSP27的磷酸化與聚合，從而影響其生物學(xué)功能，兩者間依生物學(xué)背景而變化的聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)BTZ通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡，并上調(diào)HSP27表達(dá)，HSP27負(fù)反饋抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，介導(dǎo)骨髓瘤耐藥。本研究的不足之處是未分析HSP27表達(dá)對(duì)骨髓瘤患者接受BTZ治療的療效和預(yù)后的影響，這是后續(xù)研究的內(nèi)容之一。