‘京白梨’優(yōu)良單株組織培養(yǎng)高效快繁體系構(gòu)建

劉 春，高同雨，蘇本營(yíng)，李錦錦，李 晶，武雅娟，王 巍，沈應(yīng)柏

（1.北京市門頭溝區(qū)國(guó)家生態(tài)修復(fù)科技綜合示范基地，北京 102300；2.淮北師范大學(xué)，安徽淮北 235000；3.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

‘京白梨’屬于秋子梨（Pyrus ussuriensis）的一個(gè)優(yōu)良品種，是北京市地理標(biāo)識(shí)性水果之一，栽植歷史悠久，迄今已有400多年。在北京的栽培區(qū)域主要包括門頭溝區(qū)妙峰山鎮(zhèn)、軍莊鎮(zhèn)和房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)等，在我國(guó)的河北、遼寧、山西等地也有栽培。‘京白梨’果實(shí)口味細(xì)膩獨(dú)特，是具有重要價(jià)值的水果品種，深受廣大消費(fèi)者喜愛。隨著‘京白梨’在市場(chǎng)上供不應(yīng)求，其市場(chǎng)價(jià)格也在逐年提高，給北京‘京白梨’產(chǎn)區(qū)帶來(lái)了良好的經(jīng)濟(jì)效益。但是由于病害、栽培管理粗放、不注重保存優(yōu)良種質(zhì)資源等原因，目前‘京白梨’品種退化日益嚴(yán)重，出現(xiàn)風(fēng)味變淡、果形較小、畸形果增多等現(xiàn)象[1]，嚴(yán)重制約了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，急需通過(guò)科學(xué)技術(shù)手段加快‘京白梨’優(yōu)良植株繁育。

20世紀(jì)30年代，Tukey進(jìn)行了梨胚胎培養(yǎng)并獲得成功[3]。梨及其砧木的繁殖多采用嫁接方法，70年代后關(guān)于梨與砧木的組織培養(yǎng)和離體快繁的報(bào)道增多，美國(guó)和意大利最早使用離體快繁技術(shù)對(duì)梨及砧木進(jìn)行商業(yè)性生產(chǎn)。1975年，前蘇聯(lián)學(xué)者進(jìn)行洋梨幼胚培養(yǎng)獲得植株[3]。David與趙惠祥從莖尖培養(yǎng)中，分別得到試管苗和完整的植株。此外還進(jìn)行了下胚軸，子葉橫切段的培養(yǎng)，都成功獲得了不定芽[3]?，F(xiàn)階段梨的組織培養(yǎng)工作主要集中在葉片培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)兩個(gè)方面。研究結(jié)果表明，品種和器官的外植體不同，所采用的培養(yǎng)基種類、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的比例和濃度、培養(yǎng)條件也不同。不同的培養(yǎng)基條件對(duì)梨的組織培養(yǎng)有很大影響，韓繼成等[4]通過(guò)試驗(yàn)表明，梨的兩個(gè)品種冀蜜和豐水分別以N6，NN60，MS為培養(yǎng)基，附加相同的條件（TZD1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+CH 250 mg/L+S.30 mg/L+A.5 mg/L），結(jié)果在NN60培養(yǎng)基上獲得了最佳效果，不定芽的誘導(dǎo)率為100%。

目前對(duì)‘京白梨’優(yōu)良單株組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究報(bào)道較少，研究‘京白梨’的組織快繁體系，包括消毒方式、外植體篩選以及增殖和生根培養(yǎng)基配比，具有一定的生產(chǎn)實(shí)踐意義。通過(guò)組培快繁技術(shù)獲得脫毒苗，可以減少梨樹自身潛隱病毒帶來(lái)的危害，為‘京白梨’優(yōu)良植株種質(zhì)資源保存和繁育提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，同時(shí)，也可為解決北京地區(qū)‘京白梨’品種退化提供有效途徑，從而推動(dòng)‘京白梨’產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料和方法

試驗(yàn)于2018年4月至2019年6月在北京市門頭溝區(qū)科技開發(fā)試驗(yàn)基地組培實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：選用‘京白梨’優(yōu)良單株‘孟3’為試驗(yàn)材料，外植體選用枝條水培萌發(fā)出的幼嫩芽尖和春季樹體萌發(fā)的幼嫩新梢。

化學(xué)藥劑及材料：75%酒精、2%次氯酸鈉、瓊脂糖、MS培養(yǎng)基、NAA、IBA、IAA、GA3、蔗糖、氫氧化鈉、鹽酸、蒸餾水、抗壞血酸、活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、蛭石、營(yíng)養(yǎng)土。

1.2 試驗(yàn)處理與方法

1.2.1 外植體消毒方式篩選

采集‘京白梨’優(yōu)株‘孟3’枝條，經(jīng)水培抽芽后，每個(gè)瓶?jī)?nèi)接種3個(gè)‘京白梨’花芽和葉芽，5瓶為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，14 d后觀察外植體污染結(jié)果。采用2%的次氯酸鈉和0.1%的升汞溶液進(jìn)行消毒處理。

1.2.2 組培外植體篩選

外植體采用帶芽的越冬枝條以及水培抽出的花芽，接種到相同的培養(yǎng)基中，觀察生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.3 花芽愈傷組織培養(yǎng)基篩選

采用以下MS和1/2 MS兩種培養(yǎng)基配制方法，30 d后觀察花芽愈傷組織誘導(dǎo)情況。

表1 不同培養(yǎng)基花芽愈傷組織誘導(dǎo)處理Tab.1 Treatment of callus induction of flower buds in different mediums

1.2.4 ‘京白梨’組培快繁培養(yǎng)基優(yōu)化

外植體選用‘京白梨’水培萌動(dòng)的嫩芽，設(shè)計(jì)不同條件的培養(yǎng)基，包括MS類型，不同激素及濃度處理，通過(guò)觀察組培苗增殖生根情況，篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基方案（表2、3）。

表2 組培苗增殖不同激素處理Tab.2 Different hormone treatments for proliferation of tissue culture seedlings

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

通過(guò)Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理計(jì)算；采用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用單因素方差分析各處理差異的顯著性水平，采用最小顯著差數(shù)法（P＜0.05,LSD）進(jìn)行不同處理間均值的顯著性差異比較。

污染率（%）=（污染外植體/接種外植體總數(shù)）×100；分化率（%） =（已分化的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100；增殖率（%）=（處理后的有效芽數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒方式對(duì)污染率的影響

外植體接種14 d后觀察結(jié)果，采用2%濃度次氯酸鈉的消毒方式污染率為33%，采用0.1%升汞的消毒方式污染率為18%。

表3 不同激素處理下‘京白梨’組培苗生根的培養(yǎng)基Tab.3 Mediums for rooting of tissue culture seedlings of‘Jingbaili’treated with different hormones

2.2 不同外植體的接種對(duì)比分析

外植體直接采用帶葉芽及花芽的老枝條，經(jīng)消毒接種到培養(yǎng)基后污染率達(dá)到93.3%；而選用新發(fā)的花芽及嫩芽試驗(yàn)，污染率為0。‘京白梨’組培試驗(yàn)中外植體的選擇應(yīng)避免使用老枝條，盡量選用剛萌動(dòng)的嫩梢和花芽。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)花芽愈傷組織形成的影響

在1/2 MS培養(yǎng)基中的‘京白梨’花芽外植體形成的愈傷組織比MS數(shù)量多，MS愈傷組織分化率為33.3%，在1/2 MS培養(yǎng)基中愈傷組織的分化率為60%。但是在1/2 MS中的愈傷組織出芽率較低。

2.4 赤霉素濃度對(duì)花芽愈傷組織誘導(dǎo)的影響

30 d后觀察外植體生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明花芽在3 mg/L（圖1b）和1.5 mg/L（圖1c）赤霉素濃度中均能誘導(dǎo)出愈傷組織，其中在1.5 mg/L濃度中生長(zhǎng)良好，愈傷組織誘導(dǎo)個(gè)數(shù)較多，45 d后花芽愈傷組織分化出完整植株（圖1a）。

圖1 不同濃度赤霉素的‘京白梨’培養(yǎng)情況Fig.1 Culture of‘Jingbaili’with different concentrations of GA3

2.5 組培快繁技術(shù)培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.5.1 激素處理濃度對(duì)嫩梢外植體愈傷組織增殖的影響

不同處理間組培苗生長(zhǎng)情況（表4），愈傷組織個(gè)數(shù)以T3、T9處理最高，約10個(gè)，其次為T6、T4處理，約為9個(gè)，與CK相比具有顯著性差異；不定芽個(gè)數(shù)以T6處理最高，約為14個(gè)，其次為T3，約為13個(gè)，與CK相比具有顯著性差異；增殖率以T6、T3處理最高，分別為94%、92%，顯著高于CK；芽長(zhǎng)度以T2、T4、T5處理最大，均為0.58cm，與CK相比具有顯著性差異。

綜合以上指標(biāo)以及組培苗后期生長(zhǎng)情況（表5），采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培養(yǎng)基最有利于組培苗增殖。

表4 不同激素處理對(duì)‘京白梨’外植體組培苗生長(zhǎng)影響Tab.4 Effects of different hormone treatments on explants growth of‘Jingbaili’

表5 不同激素處理的‘京白梨’外植體組培苗30 d生長(zhǎng)特征Tab.5 Growth characteristics of‘Jingbaili’explants treated with different hormone treatments for 30 days

2.5.2 激素處理濃度對(duì)組培苗生根的影響

組培苗生根試驗(yàn)主要是通過(guò)NAA、IAA、IBA不同生長(zhǎng)激素的濃度處理，以及使用不同類型的MS（MS、1/2 MS、1/4 MS）接種。

S3、S5、S7、S9生根培養(yǎng)基中，在15 d觀察期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)組培苗基部有根原基形成，但在此期間未誘導(dǎo)形成根。其中1/4 MS培養(yǎng)的‘京白梨’組培苗葉片在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)發(fā)黃的現(xiàn)象。

45 d觀察后（圖2），S10、S11培養(yǎng)基中的‘京白梨’組培苗成功誘導(dǎo)生根，NAA激素濃度控制在0.5～1范圍內(nèi)都可以促進(jìn)根系生成，但形成的根系較脆，移栽時(shí)容易斷裂。

圖2 ‘京白梨’組培苗誘導(dǎo)生根生長(zhǎng)情況 （45 d后）Fig.2 Rooting growth of'Jingbaili'tissue culture seedlings（45 days later）

3 討論

植物不同部位器官發(fā)育程度、遺傳因素等生理狀況存在一定差異性，因此，不同器官組織的外植體增殖系數(shù)存在一定差異性，多則可分化5～6個(gè)芽，少則分化1～2個(gè)芽，甚至無(wú)增殖現(xiàn)象。適宜外植體的選擇對(duì)離體組織培養(yǎng)成功至關(guān)重要，王萍等[5]以馬鈴薯的幼葉、莖段、微型和種薯的塊莖為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織和植株再生試驗(yàn)，結(jié)果表明馬鈴薯的分化率在不同外植體間差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)，選用‘京白梨’優(yōu)良植株老枝條為外植體進(jìn)行接種污染率顯著高于嫩梢，因此在外植體的選擇上應(yīng)盡量采用‘京白梨’植株幼嫩組織，如花芽或剛萌發(fā)的嫩梢。植物不同外植體分化成芽體的時(shí)間也存在較大差異，陳桂敏等[6]利用蝴蝶蘭的莖尖、根尖、葉片、花、花梗等外植體進(jìn)行組培繁殖，發(fā)現(xiàn)不同外植體的增殖速度和增殖系數(shù)各有差異，其中花梗誘導(dǎo)花梗腋芽效果最佳，其它部位不能誘導(dǎo)原球莖。本研究發(fā)現(xiàn)，‘京白梨’優(yōu)良植株花芽愈傷組織分化成芽體的時(shí)間與嫩梢相比較晚，且不同器官的外植體增殖部位有差異性，有的從側(cè)芽增殖，有的從基部愈傷組織增殖。

篩選合適的培養(yǎng)基對(duì)植物組織培養(yǎng)具有重要意義。不同的培養(yǎng)基對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況是有所差別的，如MS培養(yǎng)基容易誘導(dǎo)出愈傷組織，而B5培養(yǎng)基只能夠形成芽點(diǎn)和根。高疆生等[7]對(duì)1/2 MS、MS等幾種培養(yǎng)基的梨外植體芽增殖率作了比較，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基增殖率為15%～25%，1/2 MS培養(yǎng)基為70%。本試驗(yàn)結(jié)果表明采用1/2 MS培養(yǎng)基有利于‘京白梨’花芽愈傷組織的形成，但MS培養(yǎng)基有利于組培苗后期生長(zhǎng)，原因可能是前期的愈傷組織對(duì)MS大量元素要求不高，但后期組培苗的生長(zhǎng)需求MS量加大，以支撐苗株后期生長(zhǎng)。

外源激素作為植物主要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)組培苗的誘導(dǎo)分化、增殖和生根起到關(guān)鍵性的作用。在梨的組培試驗(yàn)中，愈傷組織的形成、芽的分化、增殖系數(shù)與外源激素的種類、濃度及各激素間的配比有很大關(guān)系[8]。本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)1.5 mg/L濃度GA3可能對(duì)組培苗的生長(zhǎng)有一定影響，低濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA能促進(jìn)莖干的分支。本試驗(yàn)中6-BA、NAA、GA3不同配比對(duì)梨的增殖效果明顯，結(jié)果表明在6-BA濃度不變的條件下，降低NAA濃度、提高GA3濃度或提高NAA濃度、降低GA3濃度均能促進(jìn)梨組培苗的增殖。外源激素梯度處理可在今后試驗(yàn)中繼續(xù)優(yōu)化，增加其它幾種激素的處理，如TDZ等，進(jìn)一步觀察這些激素在不同水平下對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響。

梨屬于難生根植物，只有極少數(shù)品種生根容易，絕大部分梨品種生根較難[9]?！┌桌妗T導(dǎo)生根試驗(yàn)中，S10、S11培養(yǎng)基中的‘京白梨’組培苗成功誘導(dǎo)出根系，證明在0.5～1 mg/L濃度范圍內(nèi)的NAA適合‘京白梨’組培苗根系生長(zhǎng)。‘京白梨’組培苗生根培養(yǎng)基S1～S9目前只能形成根原基，尚未成功誘導(dǎo)成根，梨組培苗生根條件比較復(fù)雜，與溫度、光照、激素水平、碳源等外界條件有關(guān)。

本研究構(gòu)建‘京白梨’優(yōu)良單株組織培養(yǎng)高效快繁體系，通過(guò)研究不同外植體、消毒方式，以及不同激素處理對(duì)組培增殖生根的影響，為‘京白梨’的離體培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。近階段，隨著基因工程和生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，梨的離體培養(yǎng)在基因工程育種中應(yīng)用逐漸增多[10-14]。梨組培過(guò)程中不易生根，很難在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用，且不同品種間的梨樹基因型的差異性[15-17]增大了梨樹離體培養(yǎng)體系構(gòu)建的難度。因此，在今后的探索研究中，不斷改進(jìn)組培技術(shù)，減少試驗(yàn)成本，解決組培實(shí)際存在的問(wèn)題將是今后努力發(fā)展的方向。

4 結(jié)論

選取水培枝條8～15 d后萌發(fā)的新嫩梢和莖尖作為外植體進(jìn)行接種試驗(yàn)，可有效減少污染率，提高‘京白梨’組培苗脫毒繁育成功率；‘京白梨’花芽愈傷組織在1.5 mg/L濃度赤霉素中生長(zhǎng)良好，分化個(gè)數(shù)較多；采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培養(yǎng)基對(duì)‘京白梨’組培苗愈傷組織形成、不定芽生長(zhǎng)個(gè)數(shù)、增殖率、芽長(zhǎng)度、葉片生長(zhǎng)情況均有良好的促進(jìn)作用，其中T10培養(yǎng)基更有利于新生枝干的萌發(fā)；在生根培養(yǎng)過(guò)程中，S10、S11培養(yǎng)基中的‘京白梨’組培苗在45 d后成功誘導(dǎo)生根。因此，‘京白梨’優(yōu)良單株組織培養(yǎng)快速繁育可以通過(guò)以植株幼嫩組織作為外植體、以2%的次氯酸鈉作為消毒劑、采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3作為增殖培養(yǎng)基、S10和S11作為生根培養(yǎng)基等來(lái)實(shí)現(xiàn)。