冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者腸道菌群豐度與血脂和血尿酸水平的相關(guān)性

王 超，袁 宇

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)是造成人類死亡的主要原因之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)與CAHD、高血壓、心力衰竭、慢性腎臟疾病、2型糖尿病、腦梗死、肥胖等疾病有關(guān)[1-3]，腸道菌群豐度與血脂水平相關(guān)[4]。胡海兵等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CAHD受試者較非CAHD受試者腸道致病菌數(shù)目增多，有益菌數(shù)目減少。任科雨等[6]對青島市高尿酸血癥受試者腸道菌群的研究顯示，糞便菌群的尿酸(uric acid，UA)處理能力與乳酸桿菌及雙歧桿菌含量有關(guān)。但目前血脂、血UA水平與CAHD患者腸道菌群豐度的關(guān)系尚不明確。本研究通過高通量測序方法探討CAHD患者腸道菌群豐度與血脂、血UA水平的關(guān)系，旨在為CAHD的診治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年9月至2017年11月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的疑似CAHD且行冠狀動脈造影檢查者106例為研究對象，受試者均為豫北居民，且滿足以下條件：(1)無消化道手術(shù)史及器質(zhì)性病變；(2)無肝腎疾??；(3)無心血管疾病史；(4)無感染；(5)無酗酒史；(6)1個月以內(nèi)未使用任何影響腸道菌群及血脂的藥物；(7)無糖尿病及致腸道菌群失調(diào)的其他問題。所有受試者根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果進(jìn)行分組，其中冠狀動脈造影顯示左主干、前降支、回旋支、右冠狀動脈至少有1支或其大分支內(nèi)徑狹窄≥50%者列為CAHD組，其余列為對照組。CAHD組68例，男54例，女14例，年齡37～75(60.23±11.26)歲；體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)18.5～23.9(26.84±3.15)kg·m-2；高血壓50例，有吸煙史47例。對照組38例，男30例，女8例，年齡33～71(61.55±10.99)歲；BMI 18.5～23.0(26.26±3.64)kg·m-2；高血壓28例，有吸煙史26例。2組受試者年齡、性別、BMI、高血壓、吸煙史比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，受試對象均知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器血脂、血UA測定試劑(北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司)，細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，MetaVxTM文庫構(gòu)建試劑盒(美國GENEWIZ公司)；全自動生物化學(xué)分析儀(日本日立公司)，Qubit 2.0 Fluorometer(美國Invitrogen公司)，Agilent 2100 生物分析儀(美國Agilent Technologies公司)，Illumina MiSeq高通量測序平臺(美國Illumina公司)。

1.3 2組受試者血脂和血UA水平檢測2組受試者均于入院次日清晨空腹抽取肘靜脈血10 mL，使用全自動生物化學(xué)分析儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)及UA水平。

1.4 糞便采集及腸道菌群DNA提取2組受試者均于治療前收集新鮮糞便樣本，每人5 g，置于清潔干燥糞便收集管，封口后于冰盒保存，5 h內(nèi)提取樣本總DNA，并置于-80 ℃冰箱保留，使用北京天根生化科技有限公司的細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。

1.5 腸道菌群的高通量測序由GENEWIZ(蘇州)公司采用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序和高通量測序文庫的構(gòu)建。雙端測序得到的正反向reads首先進(jìn)行兩兩組裝連接，過濾拼接結(jié)果中含有N的序列，保留序列長度>200 bp的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于可操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)分析，使用VSEARCH(1.9.6)進(jìn)行序列聚類(序列相似性設(shè)為97%)，比對的16S rRNA參考數(shù)據(jù)庫為 Silva 123。對代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。使用ANOVA法計算CAHD組與對照組在不同分類層次上菌群的豐度差異。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者血脂及血UA水平比較結(jié)果見表1。與對照組受試者比較，CAHD組受試者血清UA、TC、LDL水平顯著升高，HDL水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組受試者血清TG水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組受試者血清血脂及血尿酸水平比較

組別nUA/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)對照組38311.56±63.181.68±0.213.64±0.531.75±0.242.26±0.51CAHD組68374.64±56.16a1.06±0.10a4.72±0.85a1.81±0.312.84±0.43a

注：與對照組比較aP<0.05。

2.2 2組受試者腸道菌群豐度比較

2.2.1 2組受試者腸道菌群門水平豐度比較結(jié)果見表2。2組受試者腸道菌群在門水平上共檢測到擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、放線菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門8個菌門。與對照組相比，CAHD組受試者擬桿菌門細(xì)菌豐度減小，厚壁菌門細(xì)菌豐度增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組受試者變形菌門、梭桿菌門、放線菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門細(xì)菌豐度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組受試者擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門的檢出率均為100%；對照組梭桿菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門檢出率分別為57.9%(22/38)、13.2%(5/38)、13.2 %(5/38)、5.3%(2/38)，CAHD組受試者梭桿菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門檢出率分別為58.8%(40/68)、14.7%(10/68)、11.8 %(8/68)、5.9%(4/68)，2組受試者梭桿菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門檢出率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.009、0.000、0.000、0.000，P>0.05)。

表2 2組受試者腸道菌群門水平豐度比較

組別n豐度擬桿菌門厚壁菌門變形菌門梭桿菌門放線菌門軟壁菌門互養(yǎng)菌門廣古菌門對照組3822264.8±1203.211583.4±926.1 3064.2±101.51562.4±66.9468.4±72.529.8±5.316.2±5.93.7±0.4CAHD組6814472.8±1041.3a17590.9±1154.8a2526.3±85.71354.5±73.5396.3±64.132.2±6.713.4±1.12.6±0.2

注:與對照組比較aP<0.05。

2.2.2 2組受試者腸道菌群綱水平豐度比較結(jié)果見表3。2組受試者腸道菌群均檢測到15個菌綱。CAHD組受試者的β-變形菌綱細(xì)菌豐度小于對照組，梭菌綱細(xì)菌豐度大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2組受試者β-變形菌綱、梭菌綱細(xì)菌檢出率均為100%。

表3 2組受試者腸道菌群綱水平豐度比較

組別n豐度梭菌綱β-變形菌綱對照組387270.2±312.4855.3±82.7CAHD組6813868.6±1085.7a245.5±34.5a

注:與對照組比較aP<0.05。

2.2.3 2組受試者腸道菌群目水平豐度比較結(jié)果見表4。2組受試者腸道菌群均檢測到19個菌目。其中CAHD組受試者擬桿菌目、Burkholderiales目、雙歧桿菌目、乳酸桿菌目細(xì)菌豐度小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2組受試者擬桿菌目、Burkholderiales目、雙歧桿菌目、乳酸桿菌目細(xì)菌檢出率均為100%。

表4 2組受試者腸道菌群目水平豐度比較

組別n豐度擬桿菌目Burkholderiales目雙歧桿菌目乳酸桿菌目對照組3821358.1±917.6834.6±58.1752.8±84.7256.4±52.4CAHD組6813911.6±843.5a243.3±46.9a333.6±73.1a162.6±62.4a

注:與對照組比較aP<0.05。

2.2.4 2組受試者腸道菌群科水平豐度比較結(jié)果見表5。2組受試者腸道菌群均檢測到35個菌科。其中CAHD組受試者消化鏈球菌科、Erysipelotrichaceae科細(xì)菌豐度大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2組受試者消化鏈球菌科、Erysipelotrichaceae科細(xì)菌檢出率均為100%。

表5 2組受試者腸道菌群科水平豐度比較

Tab.5 Comparison of bacterial family-abundance between the two groups

組別n豐度消化鏈球菌科Erysipelotrichaceae科對照組3856.2±6.310.2±1.1CAHD組6884.2±8.9a133.8±22.4a

注:與對照組比較aP<0.05。

2.2.5 2組受試者腸道菌群屬、種水平豐度比較結(jié)果見表6。2組受試者腸道菌群均檢測到99個菌屬。其中CAHD組受試者擬桿菌屬、Roseburia屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬細(xì)菌豐度小于對照組(P<0.05)，Blautia屬、Odoribacter屬、Ruminococcus-2屬、Faecalibacterium屬、Alistipes屬、Subdoligranulum屬、埃希氏菌屬、Stercoris種細(xì)菌豐度大于對照組(P<0.05)。2組受試者中Blautia屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、Faecalibacterium屬、Subdoligranulum屬、埃希氏菌屬檢出率均為100.0%；對照組Odoribacter屬、玫瑰單胞菌屬、Ruminococcus-2屬、Alistipes屬、乳酸桿菌屬檢出率分別為81.6%(31/38)、94.7%(36/38)、100.0%(38/38)、92.1%(35/38)、55.3%(21/38)；CAHD組Odoribacter屬、玫瑰單胞菌屬、Ruminococcus-2屬、Alistipes屬、乳酸桿菌屬檢出率分別為63.2%(43/68)、94.1%(64/68)、98.5%(67/68)、66.2%(45/68)、60.3%(41/68)；2組受試者中玫瑰單胞菌屬、Ruminococcus-2屬、乳酸桿菌屬檢出率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.000、0.000、0.009，P>0.05)；CAHD組受試者Odoribacter屬、Alistipes屬細(xì)菌檢出率小于對照組(χ2= 3.892、8.853，P<0.05)。

表6 2組受試者腸道菌群屬、種豐度比較

細(xì)菌類別豐度對照組(n=38)CAHD組(n=68)Blautia屬24.6±6.2290.0±20.5aOdoribacter屬169.6±31.8205.4±54.7a擬桿菌屬18237.4±1361.29374.7±617.3a玫瑰單胞菌屬1481.4±106.4914.3±87.6a雙歧桿菌屬752.8±64.1333.6±36.7aRuminococcus-2屬93.5±11.7889.2±76.4aFaecalibacterium屬1274.2±178.92865.6±213.5aAlistipes屬741.2±41.41536.1±183.8aSubdoligranulum屬416.5±63.01024.2±100.1a埃希氏菌屬54.6±4.9378.7±69.9a乳酸桿菌屬5.9±0.83.1±0.3aStercoris種33.0±4.168.0±6.7a

注:與對照組比較aP<0.05。

2.3 血UA、TG、HDL及LDL水平與腸道細(xì)菌豐度的相關(guān)性結(jié)果見表7。2組受試者血UA水平與雙歧桿菌目、乳酸桿菌屬細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.562、-0.112、-0.429、-0.045，P<0.05)，與埃希氏菌屬細(xì)菌豐度成正相關(guān)(r=0.781、0.193，P<0.05)，此相關(guān)性在CAHD組更顯著；CAHD組受試者血UA水平與Burkholderiales目細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.716，P<0.05)，與乳酸桿菌目細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.687，P<0.05)；但對照組UA水平與Burkholderiales目、乳酸桿菌目無相關(guān)性(r=0.658、0.562，P>0.05)。2組受試者血TG水平與擬桿菌目、Odoribacter屬細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.761、-0.354、-0.323、-0.256，P<0.05)，與梭菌綱細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.867、0.447，P<0.05)；CAHD組受試者血TG水平與Stercoris種細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.258，P<0.05)。2組受試者血HDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r= 0.650、0.146、0.597、0.012，P<0.05)，CAHD組受試者血HDL水平與軟壁菌門細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.656，P<0.05)。2組受試者血LDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度均呈負(fù)相關(guān)(r= -0.497、-0.036、-0.839、-0.181，P<0.05)，此相關(guān)性在CAHD組更顯著。

表7 血UA、TG、HDL及LDL水平與腸道菌群豐度的相關(guān)性

Tab.7 Correlation between blood UA，TG，HDL，LDL levels and gut flora abundance

血液學(xué)指標(biāo)腸道菌群對照組(n=38)rPCAHD組(n=68)rPUABurkholderiales目0.6580.4210.7160.041雙歧桿菌目-0.1120.006-0.5620.028乳酸桿菌目0.5620.145-0.6870.014乳酸桿菌屬-0.0450.016-0.4290.013埃希氏菌屬0.1930.0410.7810.016TG梭菌綱0.4470.0120.8670.036擬桿菌目-0.3540.037-0.7610.023Odoribacter屬-0.2560.031-0.3230.043Stercoris種-0.5440.2540.2580.028HDL軟壁菌門-0.5220.2650.6560.045梭菌綱0.0120.0140.5970.034消化鏈球菌科0.1460.0320.6500.023LDL梭菌綱-0.1810.043-0.8390.013消化鏈球菌科-0.0360.028-0.4970.035

3 討論

CAHD為最常見的心血管疾病，發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，發(fā)病年齡趨于低齡化[7]。目前，CAHD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。血脂代謝異常、血UA異常與CAHD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。1984年，有研究首次證明了降低TC和LDL膽固醇可以降低CAHD發(fā)病率和病死率[8]，血脂異常是CAHD的首要危險因素。研究顯示，HDL水平越低，CAHD風(fēng)險越大[9]。袁寧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CAHD患者血UA水平與CAHD病變程度呈正相關(guān)，是反映冠狀動脈病變嚴(yán)重程度的獨立指標(biāo)。研究顯示，血脂異常是青年急性心肌梗死的獨立危險因素[11]。本研究結(jié)果顯示，CAHD組患者TC、LDL、UA水平較對照組顯著增加，而HDL卻顯著下降。

成年人的腸道至少包含500種細(xì)菌微生物群，約含有1013到1014個微生物，腸道菌群失調(diào)與CAHD、高血壓、心力衰竭、慢性腎臟疾病、2型糖尿病、肥胖等疾病相關(guān)[1]。有研究指出，腸道菌群通過參與調(diào)節(jié)宿主膽固醇代謝、UA代謝等基礎(chǔ)代謝過程，從而影響CAHD的發(fā)生、發(fā)展[12]；膽堿、三甲胺氧化物(trimetlylamine oxide，TMAO)和甜菜堿3種腸道菌群代謝產(chǎn)物與心血管疾病風(fēng)險相關(guān)。動物實驗表明，脂質(zhì)磷脂酰膽堿在腸道菌群作用下代謝產(chǎn)生三甲胺(trimethylamine，TMA)，TMA通過肝臟中的黃素單氧化酶轉(zhuǎn)化為TMAO釋放入血，改變膽固醇和膽汁酸的代謝，提高巨噬細(xì)胞的活性，從而加速動脈粥樣硬化進(jìn)程[13]。WANG等[13]、KUMMEN等[14]研究表明，TMAO可提高惡性心血管事件的發(fā)生率。2016年，王珊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TMAO與腸道菌群中的厭氧孢桿菌屬、梭菌屬、考拉桿菌屬、顫桿菌克屬及Alistipes屬有相關(guān)性。KELLY等[16]研究證實，腸道菌群的豐度與心血管疾病的風(fēng)險相關(guān)。本研究對比分析了CAHD組和對照組受試者的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)2組受試者在2個門、2個綱、4個目、2個科、11個屬的菌群豐度上存在顯著差異，2組受試者腸道菌群的差異在擬桿菌門與厚壁菌門豐度上表現(xiàn)尤其明顯；在非門水平上，與對照組相比，CAHD組受試者擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、雙歧桿菌目、擬桿菌目、乳酸桿菌目等有益菌豐度明顯降低；Ruminococcus-2屬、Blautia屬、Odoribacter屬、梭菌綱、消化鏈球菌科、Erysipelotrichaceae科、Stercoris種等致病菌的豐度明顯升高。此結(jié)果與胡海兵等[5]、CUI等[17]的結(jié)果不盡相同，這可能是由于研究對象的地域、飲食差異以及實驗方法等所造成，但有益菌減少、致病菌增多的趨勢未發(fā)生變化。

一項對893例受試者血脂與腸道菌群的相關(guān)性研究提示，巴斯德氏菌科、Coprococcus屬、Collinsella屬與TG水平呈顯著相關(guān)，消化鏈球菌科、梭菌科與LDL水平呈顯著正相關(guān)[4]。周雪[18]在瑞舒伐他汀降脂效果與人微生態(tài)菌群相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用瑞舒伐他汀后低脂組受試者的腸道菌群與高脂組相比在門、科、屬水平上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究顯示，2組受試者血清HDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度均呈正相關(guān)；血清TG水平與擬桿菌目、梭菌屬細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)，與梭菌綱細(xì)菌豐度呈正相關(guān)；2組受試者血清LDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)；以上相關(guān)性在CAHD組更顯著。另Stercoris種、軟壁菌門在對照組中與血清HDL、LDL、TG水平無顯著相關(guān)，但CAHD組受試者血TG水平與Stercoris種細(xì)菌豐度呈正相關(guān)，血HDL水平與軟壁菌門細(xì)菌豐度呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示腸道菌群在CAHD血脂調(diào)節(jié)中有重要作用。

王玲等[19]用熒光定量聚含酶鏈反應(yīng)測定進(jìn)行菌群分析，結(jié)果顯示，CAHD組雙歧桿菌及乳酸桿菌明顯減少，而大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌則明顯增加，腸道細(xì)菌總負(fù)荷明顯增加。關(guān)于CAHD受試者尿酸與腸道菌群相關(guān)性的研究顯示，隨著CAHD受試者血UA水平的升高，腸道大腸埃希菌、幽門螺旋桿菌等腸道機(jī)會致病菌也隨之增加，而雙歧桿菌、乳酸桿菌水平卻下降[20]。熊文等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌與雙歧桿菌在小鼠腸道各段的定植數(shù)與血液及消化液中尿素氮、肌酐和UA均呈明顯負(fù)相關(guān)。本研究檢測結(jié)果顯示，2組受試者血UA水平與腸道雙歧桿菌目、乳酸桿菌屬細(xì)菌豐度均呈負(fù)相關(guān)，與埃希氏菌屬細(xì)菌豐度呈正相關(guān)，與以上研究相一致，提示CAHD受試者腸道細(xì)菌與血UA水平有關(guān)。

綜上所述，CAHD受試者與對照組的腸道菌群豐度在門、綱、目、科、屬、種水平存在一定差異；腸道菌群與CAHD受試者血脂、血UA水平存在明顯的相關(guān)性。腸道菌群有可能成為預(yù)防及治療CAHD的新靶點，臨床或可通過調(diào)節(jié)腸道菌群來控制血脂、血UA水平，進(jìn)而控制CAHD的發(fā)生、發(fā)展。