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    調(diào)控基因hptRSA突變與甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌對(duì)磷霉素耐藥相關(guān)性研究

    2019-07-25 08:21:32玨,溯,湜,洋,
    中國(guó)感染與化療雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:磷霉素株菌葡菌

    王 玨, 徐 溯, 吳 湜, 楊 洋, 劉 楊

    甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(金葡菌)(MRSA)是重要的醫(yī)院感染病原體之一,且近年逐漸向社區(qū)蔓延[1]。萬古霉素是治療MRSA侵襲性感染的一線用藥,但萬古霉素中介金葡菌(VISA)和異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌(hVISA)漸見增多[2]。磷霉素單獨(dú)或聯(lián)合用藥成為治療MRSA感染的一種選擇[3]。然而,隨著磷霉素的廣泛應(yīng)用,磷霉素耐藥MRSA菌株也在臨床出現(xiàn),郭燕等[4]報(bào)道2010年我國(guó)MRSA磷霉素耐藥率達(dá)到29.5% 。

    磷霉素分子結(jié)構(gòu)與6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和3-磷酸甘油(G-3-P)類似,可分別通過兩者的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)UhpT和GlpT轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞質(zhì),繼而與磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶(MurA)不可逆結(jié)合,抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的初始階段,殺滅細(xì)菌[5]。細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥的常見機(jī)制包括:產(chǎn)生磷霉素修飾酶Fos;轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT和GlpT變異;靶蛋白MurA變異等。本院前期研究表明磷霉素耐藥MRSA菌株中fos基因和murA基因突變率很低,多數(shù)murA突變與磷霉素耐藥無明顯相關(guān)性,而glpT和uhpT突變率較高[6]。敲除uhpT和glpT基因可導(dǎo)致金葡菌對(duì)磷霉素耐藥性升高,而菌株uhpT的轉(zhuǎn)錄水平似與其磷霉素敏感性相關(guān)[7]。

    文獻(xiàn)報(bào)道,uhpT的表達(dá)受hptRSA三組分調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[8],hptR、hptS、hptA3個(gè)基因構(gòu)成了此調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),其中HptA可感知胞外G-6-P,激活下游hptRS系統(tǒng),進(jìn)而上調(diào)uhpT基因的表達(dá);敲除hptRS基因后可引起細(xì)菌的磷霉素最低抑菌濃度(MIC)顯著上升[9]。而hptA基因是否影響細(xì)菌磷霉素耐藥性尚不明確;臨床分離的MRSA中,hptRSA基因是否影響細(xì)菌磷霉素藥敏亦不明確。本研究擬通過對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院臨床無菌體液分離的MRSA進(jìn)行磷霉素MIC測(cè)定,檢測(cè)耐藥相關(guān)基因的突變,分析了解hptRSA基因變異在MRSA磷霉素耐藥性形成中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株來源 2004-2014年我院住院患者血液和腦脊液分離得到的MRSA(剔除同一患者分離得到的重復(fù)菌株)共50株。其中血液40株,腦脊液10株。經(jīng)純分、16S rRNA測(cè)序及頭孢西丁紙片法藥敏鑒定確認(rèn)為MRSA菌株后,甘油肉湯-80 ℃凍存。藥敏測(cè)定質(zhì)控菌株為金葡菌ATCC 29213。

    1.1.2 主要試劑及儀器 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHIA)和MH瓊脂培養(yǎng)基為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品;磷霉素等抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海東方藥品科技實(shí)業(yè)有限公司;G-6-P購(gòu)自Sigma公司;溶葡酶、瓊脂糖購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;金葡菌專用裂解液為上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院金姝醫(yī)師專利產(chǎn)品(專利號(hào):ZL201310124795.2)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;DNA抽提試劑盒、PCR試劑購(gòu)自TaKaRa公司。PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;A400多點(diǎn)接種儀、接種針和接種板為英國(guó)Denley公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 藥敏測(cè)定 以瓊脂稀釋法測(cè)定苯唑西林對(duì)50株MRSA的藥敏,按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2017年標(biāo)準(zhǔn)判讀[10]。磷霉素對(duì)50株MRSA的MIC測(cè)定和判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019年歐洲共同體藥敏試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)(MIC≤32 mg/L為敏感折點(diǎn))[11]。磷霉素MIC測(cè)定時(shí),瓊脂培養(yǎng)基中含25 mg/L的G-6-P。

    1.2.2 DNA模板制備 挑取1~2個(gè)菌落,加入3 mL TSB過夜培養(yǎng)后,離心獲得菌體沉淀,加入100 μL金葡菌專用裂解液及7 μL溶葡酶56℃金屬浴50 min。根據(jù)TaKaRa DNA抽提試劑盒步驟提取細(xì)菌基因組DNA,獲得的DNA抽提物稀釋100倍用作fosB、glpT、uhpT、hptR、hptS及hptA基因的普通PCR模板。

    1.2.3 磷霉素耐藥相關(guān)基因序列分析fosB、glpT、uhpT引物及PCR條件參照傅祝英杰等[12]的前期研究。hptR、hptS及hptA引物為自行設(shè)計(jì),使用NCBI primer-blast工具,根據(jù)GenBank金葡菌Newman菌株序列中hptR、hptS、hptA基因及周邊序列設(shè)計(jì)引物,見表1。PCR擴(kuò)增hptR、hptS、hptA基因,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序。PCR條件:所有基因94℃預(yù)變性5 min,退火30 s,延伸溫度72 ℃,循環(huán)數(shù)35個(gè)。退火溫度和延伸時(shí)間見表 1。測(cè)序后與 GenBank數(shù)據(jù)金葡菌Newman序列(Accession number:NC_009641)比對(duì),確認(rèn)變異位點(diǎn),并將相應(yīng)變異位點(diǎn)命名。變異位點(diǎn)命名邏輯參考Fu等[13]對(duì)uhpT和glpT基因變異的命名方式:變異位點(diǎn)若僅在磷霉素耐藥株中出現(xiàn),則依次使用英文字母命名為TypeA、TypeB、TypeC;變異位點(diǎn)若在磷霉素敏感株和耐藥株中均存在,則使用羅馬字母依次命名為TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ;采用角標(biāo)標(biāo)注變異基因名稱。

    2 結(jié)果

    2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

    5 0株M R S A的苯唑西林M I C值范圍為3 2~2 5 6 m g/L。磷霉素的M I C值范圍為1~>1 024 mg/L;其中磷霉素耐藥株34株,敏感株16株。耐藥株多呈高水平耐藥,21株MIC>1 024 mg/L,3株MIC=512 mg/L,1株MIC=256 mg/L,3株MIC=128 mg/L。

    表1 hptRSA PCR 引物及反應(yīng)條件Table 1 PCR primers and reaction conditions used to amplify hptRSA genes in this study

    表2 hptR、hptS、hptA 突變類型與相應(yīng)菌株磷霉素MIC范圍Table 2 Types of hptR,hptS and hptA mutation and fosfomycin minimum inhibitory concentration range

    2.2 hptR 、hptS、hptA突變情況與磷霉素MIC

    50株菌中,除所有同義突變外,hptR基因突變類型主要有3類,皆導(dǎo)致HptR肽鏈中單個(gè)氨基酸替代突變。hptS突變類型有6類,同樣均引起HptS肽鏈中單個(gè)氨基酸替代突變。hptA突變類型有5類,其中TypeBhptA突變?yōu)閔ptA基因中932號(hào)堿基T刪除,造成HptA肽鏈在第31位提前出現(xiàn)終止密碼子;TypeChptA突變?yōu)閔ptA基因中405號(hào)堿基G突變?yōu)锳,造成原先的189號(hào)密碼子突變?yōu)榻K止密碼子;余hptA基因突變均造成HptA肽鏈中單個(gè)氨基酸替代突變。每種突變類型的名稱、具體的變異位點(diǎn)、突變率及磷霉素MIC見表2。hptR的TypeAhptR型突變,hptS的TypeAhptS、TypeBhptS、TypeChptS突變及hptA的TypeAhptA、TypeBhptA、TypeChptA突變僅在磷霉素耐藥株中出現(xiàn);而hptR的TypeⅠhptR、TypeⅡhptR突變,hptS的TypeⅠhptS、TypeⅡhptS、TypeⅢhptS型突變及hptA的TypeⅠhptA、TypeⅡhptA型突變?cè)诿舾兄曛幸嘤谐霈F(xiàn)。50株菌中,hptR基因突變多表現(xiàn)為單位點(diǎn)突變,僅1株hptR基因出現(xiàn)TypeⅠhptR+TypeⅡhptR的突變組合。hptS基因多為多位點(diǎn)復(fù)合突變,有16株菌hptS基因出現(xiàn)TypeAhptS+TypeⅠhptS的突變,27株菌hptS基因出現(xiàn)TypeⅠhptS+TypeⅡhptS的組合。有7株菌hptA基因呈現(xiàn)多位點(diǎn)復(fù)合突變,其中5株菌hptA突變類型為TypeⅠhptA+TypeChptA,2株菌為TypeⅠhptA+TypeBhptA。hptRSA三個(gè)基因具體突變類型的組合所對(duì)應(yīng)的菌株數(shù)量及MIC分布范圍見表3。

    表2 (續(xù))Table 2(continued)

    2.3 fosB 、glpT 和uhpT基因突變及磷霉素MIC

    50株菌中,存在uhpT基因、glpT基因任一突變或fosB基因陽性的菌株共計(jì)31株,僅2株為磷霉素敏感株(MIC為2 mg/L),其余29株對(duì)磷霉素耐藥,MIC分布于128~>1 024 mg/L。31株菌中,uhpT突變有25株,皆為磷霉素耐藥株,磷霉素MIC分布于128~>1 024 mg/L;8株fosB基因陰性且glpT基因無突變,均為磷霉素耐藥株,磷霉素MIC分布于128~>1 024 mg/L。19株fosB基因陰性且glpT和uhpT無突變的菌株,磷霉素MIC分布于1~128 mg/ L,其中5株對(duì)磷霉素耐藥,MIC分布于64~128 mg/L。fosB基因陰性且glpT無突變的菌株共計(jì)27株,磷霉素MIC分布于1~>1 024 mg/ L。

    2.4 hptRSA-uhpT突變類型與磷霉素耐藥相關(guān)性

    選取上述fosB基因陰性且glpT無突變的27株菌株,分析uhpT、hptRSA突變情況與磷霉素MIC相關(guān)性。

    表3 hptRSA基因突變分布及對(duì)應(yīng)菌株磷霉素MIC范圍Table 3 Distribution of hptRSA gene mutation and fosfomycin minimum inhibitory concentration in MRSA isolates

    這些菌株中uhpT突變類型有4類,分別為T904 插入、T27刪除、第1073位堿基G被堿基T替代(G1073T)及第335位堿基G被堿基A替代(G335A)。8株攜帶有uhpT突變的菌株磷霉素MIC分布于128~>1 024 mg/L。這8株菌中,uhpTT27刪除的菌株有4株,其中有3株菌hptR、hptS及hptA基因均攜帶有各自TypeA型突變,MIC分布于256~512 mg/L,1株不攜帶TypeA突變菌株的MIC為128 mg/L。見表4。

    19株fosB基因陰性且glpT和uhpT均無突變的菌株,磷霉素MIC分布于1~128 mg/L。在hptR和hptS基因突變類型分布一致的前提下,hptA基因存在突變的18株菌株中有6株菌的hptA基因突變類型為TypeIhptA+TypeChptA或TypeIhptA+TypeBhptA,磷霉素MIC分布于32~128 mg/L(2株MIC=128 mg/ L,3株MIC=64 mg/L,1株MIC=32 mg/ L),其余12株菌MIC分布于1~32 mg/ L(1株MIC 32 mg/L,1株MIC 16 mg/ L,其余10株MIC分布于1~8 mg/L)。見表4。

    表4 fosB基因陰性、glpT基因無突變菌株中hptA基因突變與磷霉素敏感性關(guān)系Table 4 Correlation between hptRSA mutation and fosfomycin susceptibility in fosB(-),wild-type glpT strains

    3 討論

    金葡菌磷霉素耐藥機(jī)制主要包括Fos修飾蛋白的產(chǎn)生,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT和GlpT突變,靶蛋白MurA突變等[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn):磷霉素耐藥金葡菌臨床菌株中,磷霉素修飾基因和靶蛋白變異相對(duì)少見,卻存在廣泛的glpT和uhpT基因變異[12]。金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株Newman敲除glpT或uhpT基因后,細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥性明顯增強(qiáng)(MIC分別上升8倍和64倍)[7]。有文獻(xiàn)顯示HptRSA蛋白可調(diào)控uhpT基因表達(dá),繼而影響菌株的磷霉素MIC[9]。近期研究顯示當(dāng)細(xì)胞外存在G-6-P時(shí),HptA蛋白感知胞外G-6-P,激活HptRS系統(tǒng),HptR與uhpT上游啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,上調(diào)uhpT基因的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素敏感性升高[14]。本研究聚焦于hptRSA基因突變與磷霉素耐藥之間的相關(guān)性,在臨床無菌體液分離到的MRSA菌株中進(jìn)行篩查,并分析這些突變對(duì)菌株磷霉素耐藥性的影響。

    本研究發(fā)現(xiàn),我院2004-2014年無菌體液臨床分離得到MRSA菌株中,68.0% (34/50)對(duì)磷霉素耐藥。這些菌株中廣泛存在hptRSA基因的突變,hptR的TypeAhptR型突變,hptS的TypeAhptS、TypeBhptS、TypeChptS突變及hptA的TypeAhptA、TypeBhptA、TypeChptA突變僅在磷霉素耐藥株中出現(xiàn),這幾種突變類型可能與耐藥有關(guān)。有超過半數(shù)(55.9%)的磷霉素耐藥MRSA菌株同時(shí)攜帶TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型突變,且這些菌株對(duì)磷霉素多呈高水平耐藥(MIC在256~>1 024 mg/L,其中13株磷霉素MIC>1 024 mg/ L)。同時(shí),無論是否攜帶fosB基因、是否存在glpT基因突變,所有攜帶uhpT基因突變的菌株均為磷霉素耐藥株,提示uhpT突變?cè)诹酌顾啬退幹衅鸬搅酥匾淖饔?。而在fosB基因陰性、glpT基因無變異、下游uhpT突變類型相同的菌株中,TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型突變類型菌株磷霉素MIC是攜帶其他突變類型的菌株的2~4倍。由此推測(cè)TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型聯(lián)合突變可能在下游基因uhpT存在突變的基礎(chǔ)上進(jìn)一步導(dǎo)致磷霉素MIC升高。

    本次研究還發(fā)現(xiàn),uhpT/glpT存在突變或fosB陽性的菌株中有90.3%(28/31)對(duì)磷霉素耐藥,顯著高于uhpT和glpT無突變且fosB陰性菌株(26.3%,5/19)。而在fosB基因陰性、glpT和uhpT基因均不存在突變的磷霉素耐藥MRSA的菌株中,存在TypeBhptA或TypeChptA型突變株的6株菌MIC分布于32~128 mg/L,顯著高于無上述2種突變的菌株。因此推測(cè)TypeBhptA型和TypeChptA型突變可單獨(dú)介導(dǎo)磷霉素MIC耐藥或臨界耐藥。

    綜上所述,HptRSA復(fù)合體的基因突變?cè)谂R床分離磷霉素耐藥MRSA菌株中并不少見;hptR、hptS和hptA三基因常同時(shí)發(fā)生某一特定類型聯(lián)合突變可導(dǎo)致磷霉素高水平耐藥;hptA單基因突變亦可能在MRSA磷霉素耐藥形成中有重要作用??衫^續(xù)行敲除及回補(bǔ)試驗(yàn),以進(jìn)一步確認(rèn)hptA基因在介導(dǎo)MRSA磷霉素耐藥中的作用。

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