四川地區(qū)脈絡(luò)膜黑色素瘤患者GNAQ，GNA11基因突變檢測(cè)

何繼才，楊榮琴，彭睿

(1. 涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院眼科，四川 涼山 615000；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院眼科，成都 610000)

脈絡(luò)膜黑色素瘤是成年人最常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤[1]。約50%的脈絡(luò)膜黑色素瘤患者發(fā)生會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而目前幾乎沒(méi)有任何有效的治療方法[2]。在發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移后，患者的生存時(shí)間一般少于6個(gè)月[3]。

GNAQ和GNA11基因編碼Gαq蛋白，其參與調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體和下游的效應(yīng)器[4]。研究[4]表明：原癌基因GNAQ和GNA11的突變率在白種人中約為80%。這2個(gè)基因的突變會(huì)導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激酶通路上調(diào)，很可能是脈絡(luò)膜黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素[5]。然而最近在中國(guó)人群中的研究[6]發(fā)現(xiàn)：只有約30%的患者有這2個(gè)基因的突變。提示基因突變及其在腫瘤發(fā)生中的作用可能隨人種不同而不同。本研究檢測(cè)分析了中國(guó)四川地區(qū)脈絡(luò)膜黑色素瘤患者的GNAQ和GNA11基因突變情況，旨在明確這兩個(gè)基因在該地區(qū)患者中的突變率。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2011年1月至2016年1月四川大學(xué)華西醫(yī)院以及四川省涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院的22例脈絡(luò)黑色素瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡性別不限，明確的組織病理學(xué)診斷，患者自愿參加本項(xiàng)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合入選標(biāo)準(zhǔn)者；已經(jīng)或正在接受脈絡(luò)膜黑色素瘤放射以及藥物治療的患者。診斷依據(jù)包括眼底檢查、B超檢查以及組織病理檢查。臨床檢查主要包括患者年齡、性別、腫瘤厚度、最大基底直徑、組織細(xì)胞類(lèi)型、是否侵犯睫狀體、是否侵犯視神經(jīng)、是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。隨訪時(shí)間不少于3年。本研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言，所有臨床與實(shí)驗(yàn)室檢查均取得患者的知情同意，并經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 DNA 提取及測(cè)序

眼球摘除后， 常規(guī)進(jìn)行甲醛固定， 石蠟包埋。 獲得石蠟切片后， 通過(guò)D N A 提取試劑盒(QIAamp DNA Mini KIT，德國(guó)Qiagen 公司)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行DNA提取。Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)GNAQ和GNA11的4號(hào)和5號(hào)外顯子的引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列：GNAQ exon5上游引物為5'-GACTTGGATGATCATCGTCATT-3'，下游引物為5'-AAGAAAGCAAAGAAGTAAGTTCAC-3'；GNAQ exon4上游引物為5'-TGTCCTTCCC-T T T C C G T A G A - 3'，下游引物為5'-TGGGAAATAGG-TTTCATGGACT-3'；G N A 1 1 e x o n 5上游引物為5-AGCGTCCTTGCCCGTTCTA-3'，下游引物為5'-AGGGCCCACCTCGTTGTC-3'；G N A 1 1 e x o n 4 上 游 引 物 為5'-GCTGGTTTGGGTGCTGTGT-3'，下游引物為5'-GGCAAATGAGCCTCTCAGTGT-3'。通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)ABI PRISM 3.0 Genetic analyzer(ABI，上海生工生物公司)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAstar軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果

本研究對(duì)22位脈絡(luò)膜黑色素瘤患者行眼球摘除術(shù)?；颊吣挲g為(42.1±14.8)歲，男女比例為12/10(表1)?；颊呔鶠閱窝郯l(fā)病。在隨訪期間，7名患者發(fā)現(xiàn)了腫瘤轉(zhuǎn)移，其中5名患者為肝轉(zhuǎn)移，2名患者為多器官轉(zhuǎn)移。這7名患者都因腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生死亡，術(shù)后存活時(shí)間為(424.1±69.33) d。其余未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者的隨訪時(shí)間均大于3年。

表1 脈絡(luò)膜黑色素瘤患者的臨床及病理情況Table 1 Clinicopathological data of uveal melanoma patients

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)GNAQ和GNA11基因的4號(hào)、5號(hào)外顯子進(jìn)行測(cè)序。總突變率分別為45.46%，27.28%；其中，GNAQ基因發(fā)生Q209P突變的突變率為31.82%，發(fā)生Q209L的突變率為13.63%(表2)。沒(méi)有患者同時(shí)發(fā)生GNAQ和GNA11基因突變(圖1)。

表2 基因突變分布Table 2 Proportion of each mutation type

圖1 基因突變位點(diǎn)Figure 1 Mutation sites

3 討論

在本研究中，脈絡(luò)膜黑色素瘤發(fā)生GNAQ和GNA11基因突變率分別為45.46%和27.28%，總突變率為72.74%。Van Raamsdonk等[4]報(bào)道：在高加索人群中，83%的脈絡(luò)膜黑色素瘤中檢測(cè)到GNAQ或GNA11突變。本研究結(jié)果與之相近。然而，Xu等[6]報(bào)道：在中國(guó)脈絡(luò)膜黑色素瘤患者中，GNAQ或GNA11突變率僅為38%(GNAQ：18%；GNA11：20%)。推測(cè)其原因如下：1)本研究樣本量太小，可能會(huì)造成統(tǒng)計(jì)誤差；2)腫瘤組織長(zhǎng)期保存中發(fā)生DNA降解，導(dǎo)致測(cè)序不準(zhǔn)確；3)中國(guó)北方人和南方人或者少數(shù)民族患者之間可能存在基因差異。由于本研究醫(yī)院所屬地區(qū)脈絡(luò)膜黑色素瘤患者較少，且不易隨訪，因此樣本確實(shí)有限。為減小測(cè)序誤差，所有PCR產(chǎn)物都測(cè)序2次，若結(jié)果不一致再加測(cè)。

脈絡(luò)膜黑色素瘤的突變負(fù)擔(dān)小于大部分腫瘤，與兒童腫瘤的突變負(fù)擔(dān)相似[7]。而GNAQ和GNA11突變一直被認(rèn)為是在腫瘤早期發(fā)生的突變，并被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生中起重要作用[8-11]。在Van Raamsdonk等[4,12]的報(bào)道中，大多數(shù)GNAQ和GNA11突變都發(fā)生在209密碼子，少數(shù)發(fā)生在183密碼子。在本研究中，GNAQ和GNA11突變都發(fā)生在209密碼子。另外筆者團(tuán)隊(duì)[6]也未發(fā)現(xiàn)4號(hào)外顯子突變，這與之前關(guān)于中國(guó)人群的報(bào)道相符。

綜上，GNAQ和GNA11基因在四川地區(qū)脈絡(luò)膜黑色素瘤患者中的突變率較高。