李學營,索相敏,白瑞霞,彭建營,馬寶玲
(1.河北農(nóng)業(yè)大學園藝學院,河北 保定 071001;2.河北省農(nóng)林科學院石家莊果樹研究所,河北 石家莊 050061;3.河北省農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)技術(shù)指導(dǎo)總站,河北 石家莊 050000)
ITS序列是核糖體DNA中位于18S、5.8S和26S之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),由ITS1和ITS2組成。ITS高度重復(fù)、長度保守,變異速度較快,可提供豐富的變異位點和信息位點,在植物系統(tǒng)分類和進化研究中被廣泛應(yīng)用。被子植物中ITS(包括5.8S)片段的長度在700 bp左右,加上協(xié)同進化(concerted evolution),使得該片段在基因組不同重復(fù)單元間十分一致,非常適合進行各種分子操作[1]。目前,ITS可能是分子系統(tǒng)學研究中應(yīng)用十分廣泛的基因之一[2]。葉綠體基因為母性遺傳,基因組較小,但包含大量的DNA成分,在分子水平上差異明顯,能為比較進化研究提供基本的信息支持,所涉及的葉綠體基因主要有兩類,編碼基因及非編碼區(qū)序列20種以上[3~17],已越來越多地應(yīng)用在分子進化和分子系統(tǒng)學研究中。其中,psbA-trnH序列是植物葉綠體基因組中的非編碼區(qū)序列,比較適合屬下種間的劃分,但是單獨基于psbA-trnH序列進行植物系統(tǒng)學分析的報道甚少,將ITS序列與psbA-trnH序列一起進行研究,能夠提高研究的準確性和科學性。
棗屬 (Ziziphus Mill.) 是鼠李科 (Rhamnaceae)中最具經(jīng)濟價值的一個屬,主要分布在亞洲的熱帶和亞熱帶。棗是我國的第一大干果樹種,已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟增收的重要來源之一。我國棗資源較為豐富,其中原產(chǎn)于我國的種有14個。近年來,在棗屬屬下分類的研究中盡管涉及到形態(tài)學、生物學、同工酶及花粉學等多個方面[18,19],但大多是針對棗和酸棗進行的,而針對我國其他棗屬植物的ITS及psbA-trnH序列研究尚未見報道。通過不同的反應(yīng)條件,建立棗屬植物的ITS和psbA-trnH序列高效一致的PCR反應(yīng)體系,旨為后續(xù)的棗屬比較分子生物學研究提供更可靠的分子生物學依據(jù)。
表1 供試材料及其來源Table 1 Materials and their origins
試驗材料共13種,包括原產(chǎn)于我國的棗屬12種和1個近緣種斯氏銅錢樹(表1)。7~8月采其嫩葉,用硅膠干燥保存,帶回實驗室,備用。
1.2.1 總DNA的提取 采用改良CTAB法[20],通過Nano Drop 2000c超微量紫外分光光度計并結(jié)合1%瓊脂糖凝膠電泳測定基因組DNA的濃度和質(zhì)量。TE溶液稀釋至250 ng/μL,-20℃保存,備用。
1.2.2 ITS和psbA-trnH序列PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化設(shè)計 ITS和psbA-trnH序列均采用雙引物 (表2)擴增。
以毛果棗、蜀棗和褐果棗3個試材的總DNA為樣品。參考其他樹種和作物的擴增體系,確定總反應(yīng)體積為50 μL,內(nèi)含dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、雙引物各60 ng、TaqDNA聚合酶1.5 U和不同的葉片總DNA模板量(設(shè)50、100、200 ng共3個處理),之后用重蒸水補足。PCR擴增反應(yīng)程序為:①94℃預(yù)變性2 min;②94℃變性1 min,退火溫度分別設(shè)57、55、52和48℃(即4個退火溫度處理),退火1 min,72℃延伸1 min。循環(huán)35次;③保持72℃10 min。不同的退火溫度及不同的DNA模板量組合共設(shè)12個處理(表3)。
表2 ITS和psbA-trnH引物序列的信息Table 2 Sequence of ITS and psbA-trnH primers
表3 對ITS和psbA-trnH PCR擴增時不同退火溫度與DNA模板用量的組合處理Table 3 The annealing temperature and DNA amount in PCR reaction system for ITS and psbA-trnH amplification
以溴酚藍為指示劑,PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并用0.5 μg/mL EB染色顯影,在紫外透射儀下觀察并拍照。
1.2.3 ITS和psbA-trnH序列PCR反應(yīng)優(yōu)化體系的驗證采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系,對棗屬12個種和1個近緣種共13份材料進行PCR擴增、純化及測序進行驗證。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀檢測,切下目的片斷,然后采用DNA純化回收試劑盒(上海生工)回收目的片段,回收的PCR產(chǎn)物在-20℃保存,用于測序。
測序工作由上海生物工程有限公司負責完成,測序原理是Sanger的雙脫氧終止法,測序儀為ABI377。采用PCR產(chǎn)物直接測序,測序引物與PCR擴增引物一致,2條序列的測序程序均為95℃20 s—50℃20 s—60℃1 min,30個循環(huán)。
所得DNA溶液的A260/A280為1.7~1.9,DNA產(chǎn)量為690~720 ng/μL。說明DNA樣品中基本無蛋白質(zhì)污染,并無降解現(xiàn)象。
在50 μL反應(yīng)體系中,ITS及 psbA-trnH序列DNA模板量為50~200 ng時,相同退火溫度下,同一序列內(nèi)3個材料間不同DNA模板用量處理的PCR產(chǎn)物亮度一致,無明顯差異。說明在一定范圍內(nèi),DNA模板的用量對PCR擴增影響不大。因此,從節(jié)約成本的角度考慮,在50 μL反應(yīng)體系中,DNA模板的用量在50 ng時就能擴增出高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物(圖1和2)。
圖1 不同條件下ITS序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR products for ITS sequence under different conditions
圖2 不同條件下psbA-trnH序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR products for psbA-trnH sequence under different conditions
從2條序列的PCR擴增產(chǎn)物看,不同退火溫度間同一序列的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,條帶亮度和粗度都存在差異。
當退火溫度為48℃時,2個PCR產(chǎn)物條帶都較亮,但出現(xiàn)了明顯的彌散拖尾現(xiàn)象。說明除了擴增出目的PCR產(chǎn)物外還出現(xiàn)了許多的雜帶,降低了擴增的特異性。這將大大影響后續(xù)試驗,給純化和測序帶來了困難。退火溫度為48℃時并不適合對棗屬ITS和psbA-trnH序列的PCR擴增。
當退火溫度為57℃時,ITS序列的PCR產(chǎn)物條帶較弱;退火溫度為55和52℃時條帶較亮,其中,52℃處理的帶型最好,條帶明亮,粗細適中,沒有雜質(zhì)。說明退火溫度為52~55℃時ITS序列均能擴增出質(zhì)量較高的PCR產(chǎn)物,其中,最佳退火溫度為52℃。
當退火溫度為57和55℃時,psbA-trnH序列的PCR產(chǎn)物條帶都較弱,亮度不夠,說明退火溫度為57和55℃時不能有效地擴增出足夠的PCR產(chǎn)物;退火溫度為52℃時,條帶明顯較亮,且無雜帶,說明退火溫度為52℃最佳。
從試驗結(jié)果看,擴增時psbA-trnH片段要求的退火溫度較ITS序列更為嚴格。
根據(jù)確立的最適PCR反應(yīng)條件,對棗屬12個種和1個近緣種共13份材料的ITS及psbA-trnH序列進行了擴增。結(jié)果(圖3和4)顯示,PCR擴增后的電泳條帶清晰,無雜帶,擴增效果良好。說明優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠,可用于棗屬植物系統(tǒng)發(fā)育的研究。
圖3 ITS序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoregram of PCR products for ITS sequence with optimized condition
圖4 psbA-trnH序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoregram of PCR products for psbA-trnH sequence with optimized condition
在優(yōu)化PCR反應(yīng)體系下擴增的ITS和psbA-trnH序列完全符合測序的要求,經(jīng)純化后測得的序列完整,正反雙向測序后對比完整,質(zhì)量較高,已經(jīng)提交Genebank數(shù)據(jù)庫。
ITS和psbA-trnH序列測序是基于PCR的分子技術(shù),而影響PCR反應(yīng)的因素有很多,如dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶等對擴增效率均有一定的影響。對ITS和psbA-trnH序列的PCR研究中,前人對于dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶用量的優(yōu)化較為成熟。
模板DNA質(zhì)量和濃度是影響PCR擴增效果的關(guān)鍵因素之一,PCR體系中模板DNA濃度范圍較大,但濃度過低或者過高均會對擴增效果產(chǎn)生不良影響[23]。選擇適宜的模板濃度對建立穩(wěn)定的PCR體系很重要,楊培奎等[24]對橄欖ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化時認為,不同物種不同PCR體系中,適宜的模板DNA濃度范圍存在差異,進行PCR體系優(yōu)化時仍有必要將模板DNA作為影響因素。每個物種的DNA長度不同,不同PCR操作中對模板DNA濃度要求上有一定差異。本研究條件下對棗屬ITS和psbA-trnH序列擴增時發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi)模板DNA用量對PCR產(chǎn)物影響不大,在利用ITS和psbA-trnH序列進行系統(tǒng)學研究中較少的模板DNA可以擴增出質(zhì)量較高的PCR產(chǎn)物。這對于采樣量困難的植物或標本,基于ITS和psbA-trnH序列進行分析更具有優(yōu)勢。本研究中,對于模板DNA的用量梯度并沒有達到最低用量的極限。
對于ITS和psbA-trnH序列PCR體系優(yōu)化的研究少有報道,但對于其他分子標記的PCR體系進行優(yōu)化的研究中,許多學者對退火溫度進行了優(yōu)化。退火溫度的高低直接影響到PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量,不同分子標記、不同引物、不同材料之間存在差異,最佳退火溫度各不相同。本研究中,擴增時psbA-trnH片段要求的退火溫度較ITS序列更為嚴格,但兩段序列的最佳退火溫度相同。
綜上所述,棗屬ITS及psbA-trnH序列優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為:50 μL反應(yīng)體系中,內(nèi)含dNTP 0.2mmol/L,Mg2+2 mmol/L,2條引物各60 ng,TaqDNA聚合酶1.5 U,葉片總DNA模板50 ng。反應(yīng)程序為:①94℃預(yù)變性2 min;②94℃變性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min。循環(huán)35次;③最后72℃延伸10 min。