低氧訓(xùn)練誘導(dǎo)miR-27/PPARγ調(diào)控肥胖大鼠腓腸肌脂肪酸代謝的研究

朱 磊，路瑛麗，馮連世*，張素嫻

低氧訓(xùn)練誘導(dǎo)miR-27/PPARγ調(diào)控肥胖大鼠腓腸肌脂肪酸代謝的研究

朱 磊1，路瑛麗2，馮連世2*，張素嫻3

（1．曲阜師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165；2．國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061；3．日照市體育運(yùn)動(dòng)學(xué)校，山東 日照 276800）

：探討在低氧條件下運(yùn)動(dòng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠腓腸肌中miR-27/PPARγ及其下游脂代謝相關(guān)調(diào)控基因和蛋白表達(dá)的影響。：SD大鼠喂飼高脂飼料構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型，建模成功后隨機(jī)分為5組，分別為正常氧濃度組（C組）、低氧訓(xùn)練1周組（E1組）、低氧訓(xùn)練2周組（E2組）、低氧訓(xùn)練3周組（E3組）和低氧訓(xùn)練4周組（E4組），每組10只。低氧訓(xùn)練大鼠置于13.6%低氧環(huán)境（相當(dāng)于實(shí)際海拔3 500 m高度氧含量），水平動(dòng)物跑臺(tái)訓(xùn)練（20 m/min，1 h/天，5天/周）。末次訓(xùn)練24 h后（禁食12 h）麻醉取右側(cè)腓腸肌中端。RT-PCR檢測(cè)大鼠腓腸肌miR-27、PPARγ、ATGL、CD36 m RNA的表達(dá)量，Westent Blot檢測(cè)大鼠腓腸肌PPARγ、ATGL、CD36、蛋白表達(dá)量。：1）肥胖大鼠腓腸肌miR-27表達(dá)量在前2周降低，隨后2周又逐漸上升，E4組miR-27相對(duì)表達(dá)量非常顯著高于其他各組（＜0.01）。2）PPARγ mRNA隨低氧訓(xùn)練時(shí)間的增加表達(dá)量逐漸上升，但E3組出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與E1組、E2組（＜0.05）和E4組（＜0.01）相比呈顯著降低，C組顯著低于E4組（＜0.05）；PPARγ蛋白表達(dá)量隨低氧訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)先下降后上升，C組和E1組均非常顯著高于E2、E3、E4組（＜0.01）。E2組顯著低于E3組（＜0.05）和E4組（＜0.01）。3）ATGL mRNA表達(dá)量逐漸增多，其中C組非常顯著低于E1、E2組、E3組、E4組（＜0.01），E3組顯著低于E4組（＜0.01）；ATGL蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，C組與E1組均非常顯著低于E3組（＜0.01）和E4組（＜0.05）。4）CD36 mRNA表達(dá)量先下降后上升，C組顯著高于E2組、E3組（＜0.05），E1組顯著高于E2組（＜0.05）；C組CD36蛋白表達(dá)量顯著低于E2和E3組（＜0.05）。：肥胖大鼠腓腸肌中miR-27在低氧訓(xùn)練第4周增加顯著，介導(dǎo)PPARγ調(diào)控下游脂代謝相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而調(diào)控大鼠機(jī)體脂代謝水平，這可能是低氧訓(xùn)練減脂降體重的分子學(xué)機(jī)制。

低氧訓(xùn)練；miR-27；PPARγ；肥胖大鼠；脂肪酸代謝

世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的數(shù)據(jù)顯示，2016年全球肥胖成年人占總?cè)丝诘?3%，肥胖作為一種脂代謝紊亂綜合征，是眾多代謝疾病的誘因，嚴(yán)重危害人類的健康，如何增加脂肪的分解，抑制脂肪的生成，受到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。眾多研究表明，低氧訓(xùn)練不僅可以降低體脂率，減輕體重（朱磊,2016; Goodman,2014），還可以干預(yù)因肥胖引起的動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂等一系列脂代謝紊亂疾病，降低其患病風(fēng)險(xiǎn)（Haufe et al,2008; Lam et al,2009）。低氧降低體脂率主要是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成、分解過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)，進(jìn)而減少脂肪的分化以及加速脂肪的分解，最終實(shí)現(xiàn)減脂的目的（荊文 等,2012; 朱磊 等,2016b）。

近期研究表明，miRNA在脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。miRNA參與脂肪的合成、分解、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，調(diào)節(jié)脂代謝通路中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，影響脂代謝相關(guān)酶的活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)（Feinberg et al.,2016）。其中miR-27是目前發(fā)現(xiàn)的與脂代謝相關(guān)性最高的一種miRNA。miR-27可與PPARγ發(fā)生特異性結(jié)合，影響其表達(dá)，誘導(dǎo)脂代謝通路中PPARγ下游基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)脂質(zhì)分解以及合成代謝效率的調(diào)節(jié)作用（Lozano-Velasco et al,2011; Mozos et al.,2014）。

脂肪酸的分解主要在線粒體中，由脂肪酸的β氧化來(lái)完成。腓腸肌中豐富的線粒體可以更好地氧化分解脂肪酸，高效產(chǎn)生ATP為機(jī)體運(yùn)動(dòng)提供能量。目前關(guān)于miR-27參與肝臟脂質(zhì)代謝的研究較多，關(guān)于低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)對(duì)腓腸肌miR-27時(shí)序性變化影響的研究較少，對(duì)miR-27調(diào)控靶基因PPARγ影響下游脂代謝相關(guān)基因、蛋白表達(dá)水平的機(jī)制尚不明了。本實(shí)驗(yàn)主要通過4周低氧訓(xùn)練的干預(yù)，檢測(cè)低氧訓(xùn)練對(duì)miR-27/PPARγ以及對(duì)下游參與脂代謝的調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平的時(shí)序性變化的影響，探討低氧訓(xùn)練在減輕體脂百分比、降低體重的過程中可能的分子學(xué)機(jī)制，從而為科學(xué)減肥、制定減脂計(jì)劃以及治療脂代謝紊亂相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)5周齡雄性SD大鼠120只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。所有大鼠飼養(yǎng)于國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所動(dòng)物房，隨機(jī)挑選出20只進(jìn)行普通飼料飼養(yǎng)，100只高脂飼料（45%脂供能，research diets公司）飼養(yǎng)，所有大鼠起始體重?zé)o顯著差異。大鼠自由飲食無(wú)干預(yù)，室溫控制在22±1℃，濕度為55%±2%，開啟動(dòng)物房晝夜交替照明設(shè)施，每12 h輪換。進(jìn)行為期8周的高脂飲食飼養(yǎng)，大鼠體重增加顯著，從中挑選出肥胖大鼠，構(gòu)成肥胖大鼠模型，營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型構(gòu)建是否成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：高脂飲食飼養(yǎng)組大鼠體重與普通飲食飼養(yǎng)組體重均值相比增加超20%，TC、TG等與脂代謝相關(guān)血液指標(biāo)與對(duì)照組相比有顯著性變化，Lee’s 指數(shù)顯著上升（王根輩 等,2012; 朱磊 等, 2016a）。建模成功后繼續(xù)高脂飲食，正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行1周的適應(yīng)性訓(xùn)練（跑臺(tái)速度由16 m/min漸增到25 m/min，訓(xùn)練時(shí)間由20 min/天漸增到60 min/天）。將所有肥胖大鼠進(jìn)行跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，從中選取50只能夠完成跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠，隨機(jī)選擇10只為一組，分為5組：常氧未訓(xùn)練對(duì)照組（C組，）、低氧訓(xùn)練1周組（E1組）、低氧訓(xùn)練2周組（E2組）、低氧訓(xùn)練3周組（E3組）、低氧訓(xùn)練4周組（E4組）。利用低氧房模擬13.6%氧濃度低氧環(huán)境，水平動(dòng)物跑臺(tái)訓(xùn)練（20 m/min，60 min/天，5天/周）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況分別訓(xùn)練0周、1周、2周、3周、4周。

1.2 取材

大鼠末次訓(xùn)練結(jié)束恢復(fù)24 h（禁食12 h），麻醉后取右側(cè)腓腸肌，冰生理鹽水漂洗雜物，置于液氮中迅速冷凍，－80℃超低溫冰箱保存。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 RT-PCR檢測(cè)PPARγ、ATGL和CD36 mRNA的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)涉及的全部引物如表1所示，由上海生工合成。

表1 RT-PCR引物序列

RT-PCR檢測(cè)：取腓腸肌100 mg左右，液氮中充分研磨后Trizol法提取總RNA，測(cè)量總RNA濃度，瓊脂糖電泳對(duì)RNA完整性檢驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A，TakaRa）將總RNA在核酸擴(kuò)增儀中反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，利用熒光定量PCR儀進(jìn)行cDNA的快速擴(kuò)增與熒光定量檢測(cè)，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件：起始模板預(yù)變性95℃，30 s；PCR循環(huán)反應(yīng)95℃，5 s；60℃，31 s，40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR得到3個(gè)重復(fù)樣本Ct值，取平均值，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入公式計(jì)算2-△△Ct 值進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

1.3.2 Western Blot法檢測(cè)PPARγ、ATGL和CD36蛋白的表達(dá)

從超低溫冰箱取腓腸肌組織置于液氮中充分研磨，加入蛋白提取液（碧云天）提取總蛋白，采用BCA法測(cè)試得到蛋白濃度并加loding Buffer（碧云天）和去離子水調(diào)至統(tǒng)一值，沸水浴15 min，－20℃冰箱冷藏，常規(guī)Westent blot法檢測(cè)，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Power pactTM Basic，BIO-RAD），滴加ECL發(fā)光液（Millipore，美國(guó)）顯影，后使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

表2 抗體的稀釋比例和來(lái)源

Table 1 Dilution Ratio and Source of Antibody

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。0.05表示具有顯著差異，＜0.01表示具有非常顯著差異。采用單因素方差分析法分析比較組間差異，利用GraghPad Prism 5.0軟件匯總分析并作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠miR-27相對(duì)表達(dá)量的時(shí)序性變化

在低氧運(yùn)動(dòng)的干預(yù)下，大鼠腓腸肌miR-27相對(duì)表達(dá)量先減少后增加，但在前3周低氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)中沒有顯著性變化，E4組表達(dá)量最高，非常顯著高于其他組（＜0.01）（圖1）。

圖1 各組大鼠腓腸肌miR-27和PPARγ的相對(duì)表達(dá)量

Figure 1. Relative mRNA and Protein Levels of miR-27 and PPARγ in Gastrocnemius of Rats

注：*＜0.05，**＜0.01，下同。

2.2 各組大鼠PPARγ表達(dá)的時(shí)序性變化

PPARγ mRNA表達(dá)量隨低氧訓(xùn)練時(shí)間的增加逐漸上升，但E3組出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與E1組、E2組（＜0.05）和E4組（＜0.01）相比顯著減少。E4組PPARγ mRNA表達(dá)量顯著高于C組（＜0.05）；C組PPARγ蛋白表達(dá)量和E1組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組均非常顯著高于E2、E3、E4組（＜0.01），且E2組同時(shí)顯著低于E3組（＜0.05）和E4組（＜0.01）（圖1）。

2.3 各組大鼠ATGL表達(dá)的時(shí)序性變化

C組肥胖大鼠腓腸肌ATGL mRNA表達(dá)量非常顯著低于E1組、E2組、E3組、E4組（＜0.01），E3組非常顯著低于E4組（＜0.01）；ATGL蛋白表達(dá)量出現(xiàn)一個(gè)先增加后略有減少的趨勢(shì)，C組和E1組均顯著低于E3組（＜0.01）和E4組（＜0.05）（圖2）。

Figure 2. Relative mRNA and Protein Levels of ATGL in Gastrocnemius of Rats

2.4 各組大鼠CD36相對(duì)表達(dá)量的時(shí)序性變化

CD36 mRNA表達(dá)量先下降后上升，C組顯著高于E2組、E3組（＜0.05），E1組顯著高于E2組（＜0.05）；C組CD36蛋白表達(dá)量顯著低于E2和E3組（＜0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠腓腸肌CD36的相對(duì)表達(dá)量

Figure 3. Relative mRNA and Protein Levels of CD36 in Gastrocnemius of Rats

3 分析與討論

有研究顯示，高原低氧訓(xùn)練或者是低壓氧倉(cāng)模擬低氧環(huán)境等低氧條件都可以在一定程度上減輕體重，降低體脂百分比（安江紅 等,2014; 袁建琴 等,2003），后期不斷有人通過大量的大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此結(jié)論（Disanzo et al.,2014; Lu et al.,2014）。Lu等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠在經(jīng)過4周的低氧訓(xùn)練后，體重、體脂比均出現(xiàn)非常顯著下降。王寧琦（2012）等征集一些青年志愿者，進(jìn)行了高原低氧環(huán)境的模擬實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過4周的訓(xùn)練后，BMI指數(shù)、體重、腰圍、體脂百分比均較測(cè)試前顯著降低，HDL-C濃度較低氧訓(xùn)練前升高了5.7%，此外體脂比在低氧訓(xùn)練3周時(shí)出現(xiàn)與整體走勢(shì)相反的現(xiàn)象，在整體下降大趨勢(shì)下出現(xiàn)短暫性上升，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是機(jī)體對(duì)低氧訓(xùn)練環(huán)境適應(yīng)過程中出現(xiàn)的短暫性反饋，具體機(jī)制還尚不清楚，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。

3.1 低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠腓腸肌miR-27、PPARγ時(shí)序性變化的影響

miR-27在脂代謝過程中起到重要作用，主要是通過對(duì)脂類合成、氧化分解、轉(zhuǎn)運(yùn)等關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控來(lái)影響脂代謝，成為研究脂代謝機(jī)制的新切入點(diǎn)（Feinberg et al.,2016；Li et al.,2015）。在所有研究過的miRNA中，與脂代謝高度相關(guān)的主要集中在miR-27（Qin et al.,2016）、miR-122（Yamada et al.,2015）、miR-33（Marquart et al., 2010）、miR-370（Li et al.,2015）、miR-143（Dankel et al., 2014）、miR-378（Liu et al.,2015）等，其中miR-27是目前為止研究的所有miRNA中與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)系數(shù)最高的一種miRNA。Vickers等（2013）提取人和鼠肝臟中約150余種miRNA，利用基因芯片技術(shù)篩選后發(fā)現(xiàn)，miR-27是其所有miRNA中與脂代謝調(diào)控相關(guān)性最高的。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27模擬物可以分解機(jī)體脂肪酸，降低其濃度，抑制脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化，下調(diào)體脂百分比，為科學(xué)的減脂降重、防治脂代謝紊亂相關(guān)疾病提供新方向（Xie et al.,2016）。低氧訓(xùn)練因高效安全減肥調(diào)節(jié)脂代謝受到大家廣泛的關(guān)注，但是關(guān)于低氧訓(xùn)練對(duì)腓腸肌miR-27的影響還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低氧訓(xùn)練前3周miR-27表達(dá)量先下降后上升，但沒有顯著性變化，在第4周出現(xiàn)非常顯著升高，可能是機(jī)體逐漸對(duì)低氧訓(xùn)練環(huán)境做出的適應(yīng)性變化。

PPARγ在脂肪組織中分布比較廣泛，不僅可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化，還在脂肪酸的合成、分解、轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。miR-27在脂代謝通路中是PPARγ上游的調(diào)控因子，與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，在脂肪代謝中起到重要作用。利用熒光素酶報(bào)告分析，miR-27可特異性識(shí)別PPARγ3’端UTR位點(diǎn)，結(jié)合后抑制PPARγ的表達(dá)（Ji et al.,2009）。miR-27與脂肪的生成呈負(fù)相關(guān)，隨著miR-27的表達(dá)的增加對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，進(jìn)而抑制脂肪的分化與生成，抑制作用隨脂肪分化程度的加深而逐漸減弱（Karbiener et al.,2009; Liu et al.,2015）。Takahashi等（2012）利用基因敲除技術(shù)敲除3T3-L1細(xì)胞PPAR基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞喪失脂肪分化能力。大量學(xué)者研究均證實(shí)，低氧和運(yùn)動(dòng)都可以引起機(jī)體PPARγ蛋白表達(dá)的變化。Lui等（2015）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低緯度低氧環(huán)境中鹿鼠骨骼肌中PPARγ mRNA的表達(dá)量的僅為是高緯度中的一半，同時(shí)PPARγ蛋白水平也出現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，低氧環(huán)境可以刺激鹿鼠，使骨骼肌中PPARγ蛋白濃度逐漸增加。此外，禹尚美（2015）通過人工模擬低氧環(huán)境，研究低氧對(duì)脂代謝的影響，將SD大鼠隨機(jī)分為常氧組、常氧訓(xùn)練組、低氧組、低氧訓(xùn)練組，實(shí)驗(yàn)開始3周后發(fā)現(xiàn)，脂肪中PPARγ mRNA表達(dá)量在各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有不同，PPARγ mRNA的表達(dá)量整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，E4組顯著高于C組和E3組，但E3組與整體變化趨勢(shì)不同步，原因可能是機(jī)體在適應(yīng)低氧訓(xùn)練環(huán)境過程中出現(xiàn)暫時(shí)性反饋現(xiàn)象，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。但PPARγ蛋白與mRNA變化趨勢(shì)存在一定的差異，在低氧訓(xùn)練第1周時(shí)蛋白表達(dá)量未有顯著性變化，在低氧訓(xùn)練2周時(shí)出現(xiàn)非常顯著降低，但是隨低氧訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，PPARγ蛋白的濃度又逐漸升高，但仍顯著低于C組和E1組。出現(xiàn)這種表達(dá)不一致的原因可能是由于基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，mRNA在翻譯成蛋白的過程中，存在一定的時(shí)間與位置的差異，在這個(gè)過程中可能會(huì)發(fā)生miRNA降解或者基因沉默，且蛋白在機(jī)體的存活時(shí)間比mRNA更久，RT-PCR檢測(cè)的靈敏性高于Westent Blot技術(shù)。也有可能是由于機(jī)體存在某種因子抑制了蛋白的表達(dá)，孫文星等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ mRNA在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于皮下脂肪細(xì)胞，可能是體內(nèi)存在某種反饋機(jī)制對(duì)PPARγ的表達(dá)具有一定的抑制作用。PPARγ蛋白水平的降低可抑制脂肪的分化與形成，減少體內(nèi)脂肪細(xì)胞的生成，這一過程主要發(fā)生于脂肪細(xì)胞。隨著低氧運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制脂肪分化作用逐漸減弱，在低氧訓(xùn)練2、3、4周PPARγ蛋白水平逐漸升高，可能是對(duì)低氧環(huán)境的逐漸適應(yīng)性變化，PPARγ蛋白濃度的增加可以上調(diào)其下游與脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)的分解，為機(jī)體運(yùn)動(dòng)提供更多的能量，進(jìn)而降低體重。

3.2 低氧訓(xùn)練對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠腓腸肌脂代謝相關(guān)因子時(shí)序性變化的影響

PPARγ在脂肪組織廣泛分布，且在肝臟、骨骼肌等組織中表達(dá)量同樣較高，它有多個(gè)與脂肪酸或者是膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因的結(jié)合位點(diǎn)，如脂肪酸移位酶（CD36/ FAT）和脂蛋白脂酶（LPL）等（González-Muniesa et al., 2015）。PPARγ參與骨骼肌中的脂肪酸代謝主要是通過調(diào)控LPL、CD36、ATGL、FATP-1基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)（孫文星 等,2016），進(jìn)而調(diào)節(jié)體脂百分比，減輕體重。CD36是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可以與多種脂質(zhì)結(jié)合，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸至骨骼肌氧化分解，主要通過關(guān)閉或者是打開通道來(lái)調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而調(diào)節(jié)脂代謝效率（孫婧瑜,2014; Glatz et al.,2010）。在靜息條件下，機(jī)體對(duì)能量的需求較少，在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸時(shí)肉堿轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）可能起到更重要的作用，但是當(dāng)機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過程中需要大量能量時(shí)，則是CD36發(fā)揮主要作用（Holloway et al.,2009）。Kriska等（2014）研究證實(shí)，CD36是PPARγ的下游基因，發(fā)現(xiàn)通過激活PPARγ可以上調(diào)CD36的表達(dá)，曾穎等（2012）研究結(jié)果同樣證實(shí)PPARγ激動(dòng)劑可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞中CD36蛋白的表達(dá)。Nishikawa等（2012）將Balb/c小鼠經(jīng)過9周高脂飼養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，CD36等與肝臟脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因以及與脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)量均有所增加。朱磊等（2018）實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，經(jīng)過4周的低氧訓(xùn)練營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟中的CD36、ATGL、LPL表達(dá)量逐漸增加，這與本實(shí)驗(yàn)中CD36蛋白的變化類似，在低氧訓(xùn)練前3周逐漸增加，到第4周出現(xiàn)下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)CD36基因在低氧訓(xùn)練第1周時(shí)無(wú)顯著性變化，第2周出現(xiàn)顯著下降，隨后逐漸增加但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。引起CD36 mRNA水平和蛋白水平變化趨勢(shì)不同的原因可能是存在mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的原因，mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的效率增大，或者是轉(zhuǎn)錄后抑制蛋白的翻譯作用減弱,并且RT-PCR檢測(cè)比Westent blot檢測(cè)的靈敏性要高。

脂肪甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）在脂肪水解為甘油和脂肪酸中發(fā)揮重要作用，是脂肪水解的關(guān)鍵限速酶，飲食對(duì)ATGL表達(dá)量的影響較大，在饑餓狀態(tài)時(shí)，表達(dá)量增加，促進(jìn)脂肪的分解，攝食后表達(dá)量降低，抑制脂肪的分解，所以有人認(rèn)為可以通過調(diào)節(jié)ATGL的轉(zhuǎn)錄速率以及蛋白的活性來(lái)影響脂代謝（胡深強(qiáng) 等,2011）通過在小鼠的飲食中增加羅格列酮（PPARγ激動(dòng)劑），發(fā)現(xiàn)ATGL表達(dá)量顯著增加（Shen et al.,2007），另有研究發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞中，PPARγ可以促進(jìn)ATGL的表達(dá)，但ATGL活性未受影響（丁明 等,2009），上述研究均證實(shí)ATGL是PPARγ下游靶基因。Nadeau等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，大鼠骨骼肌中脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）蛋白濃度、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP-1）蛋白濃度和mRNA相對(duì)表達(dá)量在運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)顯著增加，提示有氧運(yùn)動(dòng)可以提升脂肪氧化分解供能能力，這與本實(shí)驗(yàn)大鼠腓腸肌中ATGL和CD36蛋白的變化趨勢(shì)相類似。有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以促進(jìn)蝦虎魚肝臟中ATGL蛋白的表達(dá)，并且低氧暴露時(shí)間越長(zhǎng)，效果越明顯（Gracey et al.,2011）。Lu等（2014）在對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠高住高訓(xùn)后，大鼠脂肪組織中ATGL的表達(dá)量在低氧訓(xùn)練2周和3周時(shí)較對(duì)照組顯著增加，但是低氧訓(xùn)練1周組有所下降，低氧訓(xùn)練4周組較對(duì)照組無(wú)顯著性變化。本實(shí)驗(yàn)ATGL經(jīng)過4周低氧訓(xùn)練mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著增加，但E3組ATGL mRNA表達(dá)量顯著低于E4組，E3組相較于低氧訓(xùn)練的前2周也略有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E3組、E4組ATGL蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于C組和E1組，這一變化趨勢(shì)與E3組PPARγ mRNA的變化有所不同，這可能是在轉(zhuǎn)錄過程中機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境的暫時(shí)性適應(yīng)，并且最后起到調(diào)節(jié)作用的是蛋白質(zhì)，所以還是以蛋白的變化為主要依據(jù)，且Steinberg等（2007）也證實(shí)在肥胖群體中，ATGL mRNA出現(xiàn)輕微性下降在脂肪降解過程中作用并不是特別重要，ATGL蛋白翻譯后的修飾過程更為重要。低氧訓(xùn)練可促進(jìn)腓腸肌ATGL和CD36的蛋白表達(dá)量逐漸增加，進(jìn)而加速腓腸肌中脂肪的分解，脂肪分解可以為腓腸肌運(yùn)動(dòng)提供更多的能量，因此改善了肥胖大鼠的血脂含量和體脂百分比，這可能也是低氧訓(xùn)練減脂降體重的原因。

綜上所述，低氧訓(xùn)練可以上調(diào)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠腓腸肌中miR-27的表達(dá)，miR-27可以通過抑制PPARγ的表達(dá)減少成熟脂肪細(xì)胞的生成，減少脂肪堆積，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用逐漸減弱，PPARγ蛋白表達(dá)量逐步增加，ATGL和CD36蛋白隨低氧訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白濃度逐漸增加，從而促進(jìn)了脂肪的氧化分解，減少了機(jī)體脂肪的堆積。

4 結(jié)論

低氧訓(xùn)練可通過miR-27來(lái)調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠腓腸肌中PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游與脂代謝相關(guān)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腓腸肌中脂肪的分解代謝，這可能是低氧訓(xùn)練減脂降體重的分子學(xué)機(jī)制。有待通過過表達(dá)/抑制miR-27的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證低氧訓(xùn)練過程中miR-27介導(dǎo)PPARγ調(diào)控脂代謝的具體機(jī)制。

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Effects of Hypoxia Exercise Induced miR-27 / PPARγ on Fatty Acids Metabolism in Gastrocnemius of Obese Rat

ZHU Lei1, LU Yingli2, FENG Lianshi2*, ZHANG Suxian3

: To explore the effects of hypoxic exercise on miR-27 / PPARγ and lipid metabolism related gene and protein expression levels in gastrocnemius muscle of obese rats.: The high-fat diet induced obese rats were randomly divided into 5 groups (=10 in each group), i.e., a normal oxygen concentration group (C), a hypoxia-exercises-for-1-week group (E1), a hypoxia-exercises-for-2-weeks group (E2), a hypoxia-exercises-for-3-weeks group (E3) and a hypoxia-exercises-for-4-weeks group (E4). The exercise training was conducted in an environment of 13.6% hypoxic (equivalent to the actual altitude of 3500 meters high oxygen content), rats were running on an animal treadmill in a speed of 20 m/min for 1 h/d，5d/w. After 24 h of the last exercise (12 h fasting), the middle of the right gastrocnemius muscle was collected. The RT-PCR was used to detect the mRNA levels of miR-27, PPARγ, CD36 and ATGL, the protein levels of PPARγ, CD36 and ATGL were measured by using Western blotting.: 1) In the first two weeks, the expression levels of miR-27 was gradually decreased in gastrocnemius muscle, but it was gradually increased in the subsequent two weeks. The expression levels of miR-27 in group E4 were significantly higher than other groups (＜0.01). 2) The mRNA levels of PPARγ were gradually increased during the training session, but the mRNA levels of PPARγ in group E3 were significantly lower than that of group E1 and E2 (＜0.05), and group E4 (＜0.01); the group C was significantly lower than group E4 as well (＜0.05); the protein levels of PPARγ showed a trend from decline to rise during training session, both group C and E1 were significantly higher than group E2?E3 and E4 (＜0.01), the group of E2 was significantly lower than E3 group (＜0.05) and E4 group (＜0.01). 3) The mRNA levels of ATGL in group C were significantly lower than E1?E2?E3 and E4 groups (＜0.01), and the group E3 was significantly lower than group E4 (＜0.01); moreover, the protein levels of ATGL were lower in group C and E1 than that of group E3 (＜0.01) and group E4 (＜0.05); 4) The mRNA levels of CD36 in group C were significantly higher than group E2 and E3 (＜0.05), the group E1 was significantly higher than group E2 as well (＜0.05). The protein levels of CD36 in group C was significantly lower than group E2 and E3 (＜0.05).: The miR-27 in skeletal muscle of obese rats was increased significantly at the fourth week of hypoxic exercise training. miR-27 regulates the transcription and translation of target genes in the downstream of PPARγ, thereby regulates the lipid metabolism in rats, and this is the potential molecular mechanism of hypoxic exercise in reducing body fat and weight.

exercise

2018-10-18；

2019-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31471139）

朱磊(1977-),男,副教授,博士,主要研究方向?yàn)榈脱跤?xùn)練調(diào)控脂代謝的機(jī)制, E-mail: zhulei316@126.com。

馮連世(1964-),男,研究員,博士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控、高原(低氧)訓(xùn)練, E-mail: fenglianshi@ ciss.cn。

G804.7

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1000-677X(2019)06-0055-07

10.16469/j.css.201906007