生防菌+惡霉靈最優(yōu)組合的篩選及對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果研究

王炎峰 田葉韓 魏滟潔 高克祥

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000）

苦瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌苦瓜專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）引起的一種重要的土傳病害（Sun & Huang，1982）。該專(zhuān)化型的部分菌株除侵染苦瓜外，還可以侵染葫蘆。此病原菌在苦瓜整個(gè)生長(zhǎng)周期均可侵染，在盛果期發(fā)病最為嚴(yán)重。在苦瓜的主要種植區(qū)，由于高溫高濕的生長(zhǎng)環(huán)境以及多年連作等原因，苦瓜枯萎病時(shí)常發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失（陳振東 等，2016）?？喙现仓晔艿讲≡秩竞笙虏咳~片的葉脈呈網(wǎng)狀黃化，上部葉片逐漸變黃，最后莖葉壞死，植株逐漸萎縮死亡，切開(kāi)病株可發(fā)現(xiàn)其維管束變成褐色（陳振東 等，2014）。目前生產(chǎn)上對(duì)該病害的防治以農(nóng)業(yè)栽培和化學(xué)農(nóng)藥防治為主，但化學(xué)防治存在農(nóng)藥殘留、抗藥性等問(wèn)題（肖榮鳳 等，2015）。山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室調(diào)查發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的對(duì)西瓜、香蕉和甜瓜等枯萎病具有良好防效的微生物制劑對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果不是很理想，因此，尋求一種安全有效的防治措施十分 必要。

綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）是一種極具生防潛力的重要生防菌，現(xiàn)已有大量關(guān)于綠針假單胞菌生物防治的研究報(bào)道，該菌對(duì)番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有較好的防治效果（申順善 等，2016）；何延靜等（2006）發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌對(duì)辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）具有強(qiáng)拮抗作用。李惠（2009）研究發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌能夠誘發(fā)菜豆對(duì)灰霉病菌的抗性且能夠促進(jìn)菜豆生長(zhǎng)，并對(duì)楊樹(shù)腐爛病菌（Valsa sordida）、板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）等多種病菌都有較強(qiáng)的抑制作用。張清霞等（2018）研究發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌主要通過(guò)產(chǎn)生抗生素防治水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）；該菌對(duì)黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）、苦瓜枯萎病菌 （F. oxysporum f. sp. momordicae）均有較好的生防效果（侯圓圓，2017）。

惡霉靈不僅是內(nèi)吸性殺菌劑，同時(shí)也是土壤消毒劑，對(duì)腐霉菌、鐮刀菌等引起的猝倒病有較好的預(yù)防效果（尹凱，2018）。惡霉靈對(duì)土壤中病原菌以外的細(xì)菌、放線(xiàn)菌的影響很小，故而對(duì)土壤中的微生物生態(tài)影響很小。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌G5 對(duì)苦瓜枯萎病菌有較好的抑制作用，并對(duì)盆栽苦瓜枯萎病防治效果最優(yōu)的生防菌+農(nóng)藥組合進(jìn)行了初步篩選（侯圓圓，2017），發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌G5+惡霉靈組合對(duì)盆栽苦瓜枯萎病的防治效果最優(yōu)，但未進(jìn)行不同濃度生防菌G5 與惡霉靈藥劑復(fù)配的篩選，因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化生防菌+農(nóng)藥組合配方，以求篩選出對(duì)苦瓜枯萎病防治效果更好的菌藥組合，并在田間條件下驗(yàn)證其防效，為有效防治苦瓜枯萎病提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試苦瓜品種為如玉41 號(hào)，由福建農(nóng)科農(nóng)業(yè)良種開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）G5 菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）SG-15 菌株，由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；99%惡霉靈（hymexazol，簡(jiǎn)稱(chēng)Hym）原藥由濰坊華諾生物科技有限公司生產(chǎn)、山東天達(dá)生物股份有限公司監(jiān)制，按照推薦使用濃度稀釋4 000 倍使用；培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基、 LA 培養(yǎng)基、PDB 培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基；盆栽用土：選擇10 a 以上無(wú)耕作的樹(shù)林土，與基質(zhì)按照2∶1 的體積比混勻，所用基質(zhì)購(gòu)自山東風(fēng)景園林有限公司；防御酶測(cè)定試劑盒：過(guò)氧化物酶（A084-3）、苯丙氨酸解氨酶（A137）、多酚氧化酶（A136）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

試驗(yàn)于2017 年4～9 月進(jìn)行。生防菌+農(nóng)藥最適組合的篩選于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)北校區(qū)溫室完成；防御酶活性測(cè)定于山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成；生防菌+農(nóng)藥最優(yōu)組合的田間防效試驗(yàn)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠針假單胞菌G5 菌懸液和苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液的制備 綠針假單胞菌G5 在LA 固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h 至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落再次純化，挑取純化出的單菌落加入到含有40 μg · mL-1利福平（Rif）的LB 培養(yǎng)基中于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)17 h，10 000 r · min-1離心10 min 去除培養(yǎng)液，將細(xì)菌沉淀用自來(lái)水重懸。用比濁法將G5 菌 懸 液 調(diào) 節(jié) 成1×108、1×109cfu · mL-12 個(gè) 濃度。

苦瓜枯萎病菌SG-15 菌株孢子懸浮液的制備：配制PDB 培養(yǎng)液，250 mL 的錐形瓶中裝液量為150 mL，高壓濕熱滅菌，冷卻后每瓶中接入3 塊直徑為6 mm 的苦瓜枯萎病菌菌餅，26 ℃恒溫160 r · min-1振蕩培養(yǎng)7 d，用滅菌過(guò)的濾網(wǎng)過(guò)濾菌絲，得到孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定孢子懸浮液濃度。

1.2.2 G5+惡霉靈對(duì)盆栽苦瓜幼苗的促生效果 2017 年4 月選用顆粒飽滿(mǎn)的苦瓜種子，用無(wú)菌水洗3～5 次，放入50～60 ℃無(wú)菌水中浸泡，水沒(méi)過(guò)種子，用無(wú)菌的封口膜覆蓋瓶口，轉(zhuǎn)移到28 ℃恒溫?fù)u床中160 r · min-1振蕩6～8 h。用無(wú)菌水把滅菌的紗布潤(rùn)濕，平鋪在培養(yǎng)皿中上下各4 層，中間放置浸泡過(guò)的苦瓜種子，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽48 h 左右。種子露白后播于50 穴的育苗盤(pán)中，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置光照時(shí)間14 h、溫度26 ℃，黑暗時(shí)間10 h、溫度22 ℃。幼苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)移栽。

取制備好的盆栽用土裝入高10 cm、內(nèi)口徑寬12 cm 的花盆中，每盆200 g，共設(shè)置12 個(gè)處理，每處理9 盆，每盆移栽1 株苦瓜，3 次重復(fù)。惡霉靈推薦使用濃度為250.0 mg · L-1，本試驗(yàn)用1×108、1×109cfu · mL-12 個(gè)濃度的G5 菌懸液將惡霉靈稀釋至250.0、187.5、125.0、62.5 mg · L-14 個(gè)濃度（分別為推薦使用濃度的100%、75%、50%、25%），移栽時(shí)每盆相應(yīng)澆灌10 mL G5 菌懸液、惡霉靈及二者組合至苦瓜根部，具體盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

苦瓜移栽后15 d 對(duì)苦瓜株高、莖粗、葉面積及全株鮮質(zhì)量、干質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。株高、莖粗的測(cè)定參照李雪玲（2018）的方法。葉面積測(cè)定參照柏軍華等（2005）的方法。用清水沖洗根部土壤，吸干苦瓜體表水分，在電子天平上測(cè)定鮮質(zhì)量。接著將苦瓜植株放入烘干箱，105 ℃殺青處理30 min，85 ℃下烘干至重量不再變化，測(cè)定干質(zhì)量。

表1 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 G5+惡霉靈對(duì)盆栽苦瓜枯萎病的防治效果 取制備好的盆栽用土裝入高10 cm、內(nèi)口徑寬12 cm 的花盆中，每盆200 g，向每盆加入制備好的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液，使每克土壤中病菌孢子為1×106個(gè)，在自然狀態(tài)下風(fēng)干，將風(fēng)干帶菌土壤混勻后立即移栽苦瓜。每處理設(shè)置3 次重復(fù)，每重復(fù)15 盆，每盆1 株苦瓜。除將1.2.2 中的健康土換成含有苦瓜枯萎病菌的病土外，其他操作均與1.2.2相同，此時(shí)將清水處理記為CK。

在苦瓜移栽15 d后以重復(fù)為單位調(diào)查統(tǒng)計(jì)苦瓜枯萎病的發(fā)病率、病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果?？喙峡菸∶缙诓『Ψ旨?jí)標(biāo)準(zhǔn)（陳振東 等，2014）：0 級(jí)，植株健康，無(wú)病癥；1 級(jí)，子葉發(fā)黃；3 級(jí)，子葉變黃，邊緣皺縮，但真葉正常；5 級(jí)，子葉有皺縮枯死現(xiàn)象，部分真葉開(kāi)始發(fā)黃；7 級(jí)，真葉發(fā)黃，部分葉片黃化或停止生長(zhǎng)；9 級(jí)，全株萎蔫或 枯死。

1.2.4 G5+惡霉靈對(duì)盆栽苦瓜幼苗葉片防御酶活性的影響 試驗(yàn)共設(shè)置CK0、CK、B、Hym、B+0.75Hym 5 個(gè)處理，處理方法同1.2.3。取移栽 前、移栽后3、6、9、12、15 d 6 個(gè)時(shí)期生長(zhǎng)情況一致的苦瓜植株底部葉片，每處理隨機(jī)選取3 株，用液氮運(yùn)輸并充分研磨均勻，采用防御酶測(cè)定試劑盒對(duì)苦瓜防御酶進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 苦瓜枯萎病高發(fā)病樣地模型制備 本試驗(yàn)以山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保試驗(yàn)站（北緯 36°18′，東經(jīng) 117°17′）為定位試驗(yàn)平臺(tái)。人為引入苦瓜枯萎病菌，將制備好的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液用自來(lái)水稀釋100 倍后按1∶1 的質(zhì)量比與草炭土混勻，繼續(xù)進(jìn)行二次擴(kuò)繁，30 d 后將擴(kuò)繁好的含病原菌草炭均勻撒入試驗(yàn)田中（1 kg · m-2），旋耕整地，將健康土壤轉(zhuǎn)化為枯萎病高發(fā)病土壤，試驗(yàn)區(qū)域土壤中病原菌的含量為1×103～1×104cfu · g-1（干土）。以此為模型，驗(yàn)證盆栽試驗(yàn)篩選出的生防菌G5+惡霉靈最優(yōu)組合對(duì)苦瓜枯萎病的田間防治效果。

1.2.6 G5+惡霉靈對(duì)苦瓜枯萎病的田間防治效果 試驗(yàn)由隨機(jī)挑選的4 個(gè)區(qū)域構(gòu)成，每個(gè)試驗(yàn)區(qū)域長(zhǎng)12 m、寬1.2 m，種植2 行苦瓜，前后株間距0.6 m，左右株間距1.0 m。每一區(qū)域?qū)?yīng)一組處理，每個(gè)處理種植30 株苦瓜。共設(shè)置CK、B、Hym、B+0.75Hym 4 個(gè)處理，苦瓜移栽前打好定植穴，每個(gè)定植穴中澆灌100 mL 4 個(gè)處理的菌、藥、菌藥最優(yōu)組合，移栽后30 d 再次澆灌100 mL 上述菌、藥或菌藥最優(yōu)組合。分別于移栽后30、60 d 調(diào)查苦瓜枯萎病的發(fā)病情況，病情指數(shù)與防治效果的計(jì)算方法同1.2.3。試驗(yàn)期間測(cè)定小區(qū)苦瓜總產(chǎn)量。

苦瓜枯萎病田間發(fā)病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（李雪玲，2018）：0 級(jí)，無(wú)病癥；1 級(jí)，輕微發(fā)病，30%以下的葉片出現(xiàn)葉脈黃化現(xiàn)象；3 級(jí)，中度發(fā)病，30%～70%的葉片出現(xiàn)葉脈黃化現(xiàn)象；5 級(jí)，高度發(fā)病，全株葉片葉脈黃化，未明顯影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育；7 級(jí)，全株葉片葉脈黃化且呈現(xiàn)萎蔫癥狀，維管束變褐，植株停止生長(zhǎng)發(fā)育；9 級(jí)，植株 死亡。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用 SPSS 20.0 和 Excel 2007 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著檢驗(yàn)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 G5+惡霉靈不同組合對(duì)盆栽苦瓜幼苗的促生效果

苦瓜盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：施用綠針假單胞菌G5、惡霉靈及二者組合處理能夠明顯提高苦瓜莖粗、株高、葉面積、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量，表現(xiàn)出不同的促生效果。總體來(lái)看，B+0.75Hym 處理（1×109cfu · mL-1G5 菌 懸 液+187.5 mg · L-1惡霉靈）各項(xiàng)生理指標(biāo)均較高，促生效果最為明顯 （表2）。

2.2 G5+惡霉靈不同組合對(duì)盆栽苦瓜枯萎病的防治效果

試 驗(yàn) 結(jié) 果 顯 示（表3），與1×108cfu · mL-1G5 菌懸液相比，1×109cfu · mL-1G5 菌懸液與惡霉靈各濃度復(fù)配對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果較高；其中B+0.75Hym 處理對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果為81.60%，明顯高于其他處理，單獨(dú)使用1×108cfu · mL-1G5 菌懸液對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果為26.34%，低于其他處理。G5+惡霉靈各組合對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果都要高于單獨(dú)使用生防菌G5 或惡霉靈。

2.3 G5+惡霉靈不同組合對(duì)盆栽苦瓜幼苗葉片防御酶活性的影響

2.3.1 G5+惡霉靈不同組合處理下苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性變化 在整個(gè)取樣周期中，PAL 活性呈現(xiàn)出先迅速升高后下降的趨勢(shì)，CK0、CK、Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性在移栽后3 d 達(dá)到峰值；B+0.75Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性持續(xù)升高時(shí)間較長(zhǎng)，在移栽后6 d 出現(xiàn)峰值。在整個(gè)取樣周期內(nèi)CK、Hym、B+0.75Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性總體高于CK0。Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性在移栽后3～12 d 變化較為平穩(wěn)，但在12～15 d 劇烈下降。15 d 時(shí)PAL 活性表現(xiàn)為B+0.75Hym ＞B ＞CK ＞CK0 ＞Hym（圖1-A）。

2.3.2 G5+惡霉靈不同組合處理下過(guò)氧化物酶（POD）的活性變化 CK0、CK 處理的苦瓜幼苗葉片POD 活性呈持續(xù)平穩(wěn)上升趨勢(shì)，移栽后9 d Hym 處理的POD 活性達(dá)到峰值后持續(xù)下降，活性下降幅度最大；12 d 時(shí)B 處理的POD 活性達(dá)到最大值；移栽后12～15 d 處理CK0、CK、B、Hym的 POD 活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而B(niǎo)+0.75Hym POD活性在15 d達(dá)到峰值，顯著高于其他處理（圖1-B）。

表2 G5+惡霉靈不同組合對(duì)盆栽苦瓜幼苗的促生效果

表3 G5+惡霉靈不同組合對(duì)盆栽苦瓜枯萎病的 防治效果

2.3.3 G5+惡霉靈不同組合處理下多酚氧化酶（PPO）的活性變化 不同處理的PPO 活性總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。移栽后3～6 d 出現(xiàn)小幅下降，隨后又持續(xù)上升。移栽后9 d B+0.75Hym 處理的PPO活性高于其他處理，12～15 d B 處理的PPO 活性持續(xù)上升，在15 d 時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)PPO 活性大小依次為B ＞Hym ＞B+0.75Hym ＞CK0 ＞CK（圖1-C）。

2.4 盆栽試驗(yàn)篩選出的菌藥最優(yōu)組合對(duì)苦瓜枯萎病的田間防治效果

從表4 可以看出，苦瓜幼苗移栽后30 d，對(duì)枯萎病的防治效果為B+0.75Hym（52.59%）＞Hym（49.35%）＞B（45.46%）；苦瓜幼苗移栽后60 d 時(shí)，防治效果為B+0.75Hym（32.13%）＞B （28.51%）＞Hym（24.09%）；苦瓜產(chǎn)量的高低與移栽后60 d 的防治效果相對(duì)應(yīng)。

圖1 G5+惡霉靈對(duì)盆栽苦瓜幼苗葉片防御酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

綠針假單胞菌G5 是分離自芫荽（香菜）莖內(nèi)的一株內(nèi)生菌，研究發(fā)現(xiàn)菌株G5 可產(chǎn)生多種次生代謝物質(zhì)，如吩嘖衍生物、氫氰酸（HCN）、嗜鐵素和蛋白酶、植物生長(zhǎng)素（IAA）等（李惠，2009）。侯圓圓（2017）通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌G5 菌株對(duì)苦瓜枯萎病菌SG-15 菌株的菌絲具有明顯拮抗作用，采用不同接種方法，G5 菌株對(duì)SG-15 菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到60%以上；試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)惡霉靈能夠抑制苦瓜枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)，故而能夠減輕苦瓜枯萎病的發(fā)生。本試驗(yàn)將生防菌G5 與殺菌劑惡霉靈結(jié)合起來(lái)協(xié)同防治苦瓜枯萎病。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試的8 種G5+惡霉靈組合防治盆栽苦瓜枯萎病的效果都要高于單獨(dú)使用生防菌或農(nóng)藥，其中B+0.75Hym 處理（1×109cfu · mL-1G5+187.5 mg · L-1惡霉靈）的防治效果最好（表3），與此相似，曹小蕾等（2016）研究發(fā)現(xiàn)將殺菌劑、植物誘抗劑和生防微生物共同施用時(shí)能夠更有效地抑制棉花黃萎病的發(fā)生。但張志紅等（2011）研究發(fā)現(xiàn)生物肥與惡霉靈配施加重了香蕉枯萎病的發(fā)生，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)中配施的惡霉靈濃度較低，且惡霉靈對(duì)生防細(xì)菌的影響較小造成的。

逆境脅迫破壞植株正常的生長(zhǎng)和發(fā)育（楊書(shū)運(yùn) 等，2007），影響植物生理活動(dòng)、動(dòng)態(tài)平衡（Wahid et al.，2007；鄧茳明 等，2010），受逆境脅迫后植株組織內(nèi)防御酶活性升高，以增強(qiáng)植物抗性 （Ashraf ＆ Foolad，2007）。臺(tái)蓮梅等（2008）研究發(fā)現(xiàn)不同大豆品種用尖孢鐮孢菌毒素處理后根內(nèi)PAL、PPO、POD 活性都要高于對(duì)照組，與其相似，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)帶菌土壤（CK）苦瓜葉片內(nèi)的PAL、POD、PPO 活性總體高于健康土（CK0）（圖1）。連清貴等（2016）研究發(fā)現(xiàn)番茄植株長(zhǎng)勢(shì)健壯時(shí)相關(guān)防御酶活性較高，灰霉病發(fā)生程度降低，與此相似，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)盆栽苦瓜促生效果最為明顯的B+0.75Hym 處理對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果最佳（表2、3、4），同時(shí)在整個(gè)取樣周期內(nèi)PAL、POD、PPO 3種防御酶的活性總體上表現(xiàn)較高。由此可見(jiàn)，植株的生長(zhǎng)指標(biāo)與病害的發(fā)生情況及相關(guān)的防御酶系統(tǒng)之間存在著密切的聯(lián)系。

盆栽試驗(yàn)中篩選出的最優(yōu)菌藥組合B+0.75Hym 在防治苦瓜枯萎病田間試驗(yàn)中得到了有效的肯定，田間條件下，苦瓜苗移栽后30、60 d B+0.75Hym 處理對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果高于單一施用B 或Hym；同時(shí)B+0.75Hym 處理的增產(chǎn)效果也最為明顯。本試驗(yàn)僅將生防菌G5 與惡霉靈混合后加入到定植穴中，對(duì)于田間防效試驗(yàn)中的生防菌+農(nóng)藥的施用方式、施用時(shí)間仍需進(jìn)一步的研究。