番茄果實中類胡蘿卜素合成與調(diào)控的研究進展

于菁文 張 奕 胡 鑫 潘陽露 潘 宇 張興國 蘇承剛

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400715）

類胡蘿卜素是四萜類脂溶性多烯色素中的一大類，廣泛存在于自然界中。類胡蘿卜素具有8 個異戊二烯單位，分子中含有1 個較長的碳碳雙鍵的共軛鍵體系，這決定了類胡蘿卜素可以經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化派生出生物體內(nèi)的多種功能性物質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過800 種天然類胡蘿卜素，顏色多呈紅色到黃色，一般在波長300～600 nm 之間有吸收峰（Magdaong et al.，2014）。在番茄果實中，類胡蘿卜素主要以番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素等形式存在，不僅對番茄生長發(fā)育過程中果實的顏色變化和多種植物激素的產(chǎn)生具有重要作用，還會影響番茄的外觀及品質(zhì)，進而影響其商品價值，同時，也對人體生長發(fā)育調(diào)控起著不可或缺的作用。本文綜合闡述了番茄果實中類胡蘿卜素變化規(guī)律和調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)，以化學(xué)調(diào)控和基因工程等技術(shù)手段為番茄的營養(yǎng)和品質(zhì)改良奠定了理論基礎(chǔ)。

1 番茄果實中的類胡蘿卜素種類、分布與發(fā)育成熟過程中的含量變化

1.1 番茄果實中的類胡蘿卜素種類與分布

在高等植物中，類胡蘿卜素的主要存在形式有β-胡蘿卜素、葉黃素、番茄紅素、β-隱黃質(zhì)、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素等。這些不同的色素主要分布在花、根、種子、果實等植物的 質(zhì) 體 中（Namitha & Negi，2010；Ruizsola & Rodríguezconcepción，2012）。根據(jù)分子組成中氧原子的有無，類胡蘿卜素被分為胡蘿卜素類和葉黃素類，后者在此基礎(chǔ)上又分為胡蘿卜醇、胡蘿卜酯、胡蘿卜酸3 個亞類（殷林 等，2016）。研究表明番茄果實中至少含有12 種類胡蘿卜素，即番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素、鏈孢紅素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、紫黃素、新黃素、ζ-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、δ-胡蘿卜素（Fantini et al.，2013）。在其成熟果實中類胡蘿卜素主要為番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素，其中番茄紅素占主導(dǎo)地位（Srivastava & Srivastava，2015），其含量占類胡蘿卜素總量的70%～90%，β-胡蘿卜素含量占比為5%～26%（Ronen et al.，1999；Kotíková et al.，2018）。

類胡蘿卜素在番茄不同類型顏色果實中的種類、含量和組成不同，且在番茄果實的不同部位以及各成熟階段的含量也存在差異。根據(jù)番茄植株的生理狀態(tài)（生長期、生長狀態(tài)、果實硬度等）可將番茄果實成熟過程分為IMG（immature green，青果期，果實青色、堅硬、處于生長中）、MG（mature green，綠熟期，果實幾乎不再長大，顏色由綠變白）、B（breaker，破色期，果實出現(xiàn)一抹黃色）、B+1 至B+3（破色后1～3 d，橙果期，果實顏色逐漸變橙）、B+4 至B+9〔破色后4～9 d，即紅熟期（red ripe），果實顏色逐漸變紅〕以及B+10至B+14（破色后10～14 d，完熟期，果實顏色逐漸變?yōu)樽霞t色，硬度逐漸降低）幾個時期（Fraser et al.，1994；Carrari et al.，2006；Centeno et al.，2011；于洋，2016）。不同種類的類胡蘿卜素在番茄果實組織中分布不同，詳見表1（Fraser et al.，1994；Carrar et al.，2006；呂鑫 等，2009；于洋 等，2011；Centeno et al.，2011；劉英明 等，2013）。

1.2 番茄果實發(fā)育成熟過程中類胡蘿卜素的含量變化

番茄果實中的類胡蘿卜素種類和含量隨果實發(fā)育成熟的不同階段而變化，同時番茄品種的不同對類胡蘿卜素含量也有一定程度的影響（表2）（Fraser et al.，1994，1999；李京 等，2006；Carrari et al.，2006；程孫亮 等，2007；呂鑫 等，2009；于洋 等，2011；Centeno et al.，2011；Namitha et al.，2011；劉云飛 等，2012；劉長付，2013）。大量數(shù)據(jù)表明，總類胡蘿卜素含量隨番茄果實的成熟呈明顯上升趨勢，且總含量積累曲線近似于對數(shù)曲線（李京 等，2006）。在番茄果實成熟過程中，綠熟期至破色14 d 期間，番茄紅素含量逐漸增加，在破色14 d 達到峰值，β-胡蘿卜素和葉黃素變化趨勢為先增后減再增，在破色14 d 達到峰值（程孫亮 等，2007）。于洋（2016）選取5 種不同果實顏色的番茄品種為代表性材料作為橫向比對，同時以材料的成熟時期作為縱向比對進行測定試驗，結(jié)果顯示，紅熟期品種果實顏色越接近紫紅色，番茄紅素在果皮中含量越高，β-胡蘿卜素含量也越高（于洋 等，2011；劉云飛 等，2012），李京等（2006）的HPLC-PDA試驗也得到了相同的結(jié)果。

表1 番茄不同成熟期對應(yīng)的主要類胡蘿卜素種類及分布部位

表2 番茄不同成熟期果實對應(yīng)的類胡蘿卜素含量及其變化趨勢

2 番茄果實中類胡蘿卜素的合成途徑

類胡蘿卜素作為植物中最主要的色素之一，依據(jù)其豐富多樣的生理功能及作為植物重要組分的合成前體，近些年已成為人們關(guān)注的焦點之一。而作為番茄類胡蘿卜素調(diào)控的主導(dǎo)者，番茄類胡蘿卜素合成途徑成為了研究的主要方向之一，該途徑涉及了脫氫、縮合、環(huán)化、羥基化及環(huán)氧化等一系列生化反應(yīng)。

在番茄類胡蘿卜素的合成途徑中，番茄中的異戊烯焦磷酸（IPP）主要來源于甲基赤蘚糖醇途徑（MEP 途徑）（Kang et al.，2016），即丙酮酸和3-磷酸甘油醛在多種酶（1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因即DXS、5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶即DXR）的作用下反應(yīng)生成IPP 這一前體物質(zhì)。在牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPPS）的催化作用下，IPP 與其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）縮合形成GGPP 這一植物多種物質(zhì)生物合成的共同前體。然后2 分子的GGPP 在八氫番茄紅素合成酶（PSY）的催化下縮合形成八氫番茄紅素（phytoene）（無色）的1，5-順式異構(gòu)體。后者在八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）的作用下脫氫形成ζ-胡蘿卜素（ζ-carotene），然后在ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）的催化作用下形成順式番茄紅素（cis-lycopene），最后在類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）的作用下構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)換形成反式類胡蘿卜素（trans-lycopene）（郭飛，2015）。番茄紅素在不同番茄紅素環(huán)化酶（LCY）作用下，生成兩類不同的類胡蘿卜素—β-胡蘿卜素（2 個β 環(huán)）、α-胡蘿卜素（1 個β 和1 個ε 環(huán)）（Mcquinn et al.，2017），這一步驟是類胡蘿卜素合成途徑中一個關(guān)鍵的分支點。此后，α-胡蘿卜素在β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）的作用下連續(xù)羥基化生成葉黃素（lutein）。β-胡蘿卜素則經(jīng)過2 個氫化反應(yīng)形成玉米黃素，后者經(jīng)過玉米黃素環(huán)氧酶（ZEP）催化形成堇菜黃素（紫黃質(zhì)），再在新黃素合成酶（NXS）的作用下生成新黃質(zhì)。紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)都是脫落酸（ABA）形成的重要前體物質(zhì)（Cazzonelli & Pogson，2010）（圖1）。

通過對番茄基因組數(shù)據(jù)庫的檢索及借助擬南芥數(shù)據(jù)庫中部分基因的同源性比對，鄭青松等（2015）提出了涉及番茄類胡蘿卜素合成途徑中不同階段的47 個酶基因，分別對應(yīng)著24 種不同的酶。對這些基因進行定位和表達分析后，可得出以下結(jié)論：這47 個基因分布在除了9 號染色體以外的其余11條染色體上，其中1 號染色體上的基因數(shù)目最多，為7 個（PSY、CMK、DXS、CCD、ZDS、MCT及HDR），7 號染色體包含基因數(shù)最少，僅為1 個（NECD），其余染色體上均至少含有2 種基因（鄭青松 等，2015）。本文選擇了其中相對較為重要的酶及基因進行闡述。

圖1 番茄中類胡蘿卜素合成代謝途徑 （改自Liu et al.，2015）

2.1 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）

DXS是MEP途徑的第1個關(guān)鍵酶（郭亞飛 等，2018）。番茄中存在2 個結(jié)構(gòu)不同、在調(diào)節(jié)上存在差異的DXS 基因（DXS1、DXS2）（Walter et al.，2002），其功能是催化IPP 的形成，在番茄果實成熟過程中，番茄紅素的形成與DXS1 的表達密切相關(guān)，但與DXS2 的表達不相關(guān)（于洋，2016），DXS2 主要表達在幼嫩的番茄葉片、花瓣、分離的毛狀體等位置（Paetzold et al.，2010；Gutensohn et al.，2014）。研 究 表 明，DXS 在 調(diào) 控MEP 代謝 通 路 中 起 重 要 作 用（Rodríguez-Concepción & Boronat，2015）。Namitha等（2011）的試驗結(jié)果顯示，自綠熟期至破色14 d 的整個階段，DXS 的表達量呈先上升后下降的趨勢，破色10 d 表達量最高。

2.2 牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPPS）

GGPPS 的功能是催化合成GGPP 這一番茄紅素合成直接前體物質(zhì)，果實成熟期間上調(diào)GGPPS表達量有利于番茄紅素的形成。在番茄中，GGPPS基因家族定位在11 號染色體（GGPPS1）、4 號染 色 體（GGPPS2）和2 號 染 色 體（GGPPS3、GGPPS4）上，GGPPS2 基因在番茄果實成熟過程中對番茄紅素的積累起重要的調(diào)控作用（Ament et al.，2006）。鐘秋月等（2009）通過對多毛番茄的GGPPS2 比對分析，推測該基因編碼的蛋白極有可能定位在質(zhì)體中，作為類胡蘿卜素合成路徑中的前體物質(zhì)供應(yīng)節(jié)點存在（Loyola et al.，2012）。Namitha 等（2011）對類胡蘿卜素合成通路中基因表達的測定試驗結(jié)果顯示，自綠熟期至破色14 d的整個階段，GGPPS 的表達量總體呈先上升后下降的趨勢，并在破色5 d 達到峰值。

2.3 八氫番茄紅素合成酶（PSY）

PSY 是類胡蘿卜素合成途徑中最重要的限速酶之一（Fraser et al.，2002），作為紅果番茄類胡蘿卜素途徑中表達最高的2 個基因（PSY 和ZISO）之一（在綠果番茄中表達水平較低）（Giuliano，2014），催化GGPP 生成八氫番茄紅素。在番茄中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3 個PSY 基因（Fantini et al.，2013）。其中PSY1基因定位在3 號染色體上，在番茄果實成熟中上調(diào)表達，是PSY 多基因家族中主要針對果實中類胡蘿卜素合成的基因，對于番茄果實中番茄紅素積累是十分必要的（Giuliano，2014），且番茄顏色突變的上位性涉及順式類胡蘿卜素對PSY1 表達的調(diào)節(jié)（Cazzonelli & Pogson，2010；Kachanovsky & Hirschberg，2012）。PSY2 定位在2 號染色體上，負責(zé)葉綠體中類胡蘿卜素的合成，對果實成熟過程中的類胡蘿卜素形成幾乎沒有作用（Fraser et al.，1999）。綠熟期番茄果實中PSY1 和PSY2 的表達量很少，進入轉(zhuǎn)色期后表達量稍有增加并呈上升趨勢，越靠近成熟期PSY1 和PSY2 的表達量越高，紅色越深，番茄紅素合成越快（劉英明 等，2013）。自綠熟期至破色14 d 的整個階段，PSY 的整體變化趨勢為先升后降，在破色日達到峰值，隨后下降（Namitha & Negi，2010；Kachanovsky & Hirschberg，2012）。PSY3 位于1 號染色體上，被預(yù)測脅迫條件下在根中發(fā)揮作用（Kachanovsky & Hirschberg，2012；Fantini et al.，2013）。

2.4 八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）

PDS 的主要功能是通過2 次去飽和作用，催化八氫番茄紅素生成ζ-胡蘿卜素，主要在花中表達，果實成熟期間上調(diào)表達量，有利于番茄紅素的形成。PDS 定位在3 號染色體上，以單基因的形式存在，是類胡蘿卜素合成途徑中的限速酶（Chamovitz et al.，1991；祝光濤 等，2012）。果實成熟時，PDS 的表達量迅速增加，大量類胡蘿卜素（以番茄紅素為代表）積累，故推測該基因表達與果實形成時類胡蘿卜素的含量呈正相關(guān)關(guān)系（Chamovitz et al.，1991）。當(dāng)對PDS 進行沉默時，植株的總類胡蘿卜素量顯著下降，此時，八氫番茄紅素和六氫番茄紅素含量最高，番茄紅素幾乎完全消失（Fantini et al.，2013）。Namitha 等（2011）對類胡蘿卜素合成通路中基因表達進行測定試驗，結(jié)果顯示，從綠熟期至破色后14 d 之間PDS 含量出現(xiàn)了2 個峰值，前一峰值出現(xiàn)在破色當(dāng)天，后一峰值出現(xiàn)在破色5 d。

2.5 ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）

ZDS 是催化ζ-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成番茄紅素的重要酶。ZDS 被定位在1 號染色體上，與PDS 的基因同源性為33%～35%，系統(tǒng)分析上可將這2 個基因歸為一類（王玉萍 等，2006）。ZDS 對番茄果實中類胡蘿卜素的積累和含量增加起重要的正調(diào)節(jié)作用，破色期mRNA 水平增長10～20 倍，主要在根和葉中表達。當(dāng)對ZDS 進行沉默時，ζ-胡蘿卜素和鏈孢紅素大量累積，番茄紅素幾乎完全消失（Fantini et al.，2013）。在Namitha 等（2011）對類胡蘿卜素合成通路中基因表達的測定中，從綠熟期到破色15 d，ZDS 含量總體呈下降趨勢。

2.6 類胡蘿卜素異構(gòu)酶類（CRTISO、ZISO）

類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）將番茄紅素從順式構(gòu)象異構(gòu)為全反式構(gòu)象，從而作為番茄果實中主要的番茄紅素存在形式。CRTISO 被定位在10號染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，缺少這一基因會使果實中7，9，7′，9′-四順式-番茄紅素大量積累，使擁有這一突變的果實顏色與普通型野生番茄材料存在差異。原核表達結(jié)果顯示，CRTISO 在植物的綠色組織中均有表達，但在成熟的番茄果實中上調(diào)表達（Kachanovsky & Hirschberg，2012）。Fantini 等（2013）在番茄中研究了2 個與CRTISO 相關(guān)的單倍體基因CRTISO-L1 和CRTISO-L2（位于5 號染色體上），并推斷這些酶的功能是啟動競爭性代謝途徑，代謝全反式番茄紅素上游的胡蘿卜素。

ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶（ZISO）的作用是異構(gòu)化15-順式雙鍵，ZISO 定位在12 號染色體上，是紅果番茄中類胡蘿卜素途徑中表達最高的2 個基因之一，能編碼1 個小的蛋白，且含有可與鐵結(jié)合的共有序列（Giuliano，2014），在番茄內(nèi)為單拷貝基因，并高度表達。該基因功能可以部分被光照取代。當(dāng)沉默該基因時，番茄紅素大量減少，八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和ζ-胡蘿卜素的含量補償性上升（Fantini et al.，2013）。

2.7 番茄紅素環(huán)化酶類（LCY-B、LCY-E）

番茄紅素β-環(huán)化酶（LCY-B）是催化番茄紅素生成β-胡蘿卜素的一類重要酶。LCY-B 位于4號染色體（LCY-B1）和10 號染色體（LCY-B2）上。該基因由單拷貝基因編碼而成，并且作用于線狀且對稱的番茄紅素。利用RNAi 沉默表達技術(shù)抑制番茄LCY-B 基因的表達，結(jié)果表明RNAi 沉默的番茄果實中番茄紅素含量有著顯著的提升（鄭青松 等，2015）。番茄中存在2 個LCY-B 基因，LCY-B1 在綠色組織和花中有活性；LCY-B2 對果實中番茄紅素的形成起調(diào)控作用，是有色體特異性的，其表達與番茄中β-胡蘿卜素及下游葉黃素的積累有關(guān)。當(dāng)LCY-B2 上調(diào)表達時，β-胡蘿卜素積累量大幅增加，番茄紅素含量減少。Rosati等（2010）將LCY-B 導(dǎo)入番茄植株，在類胡蘿卜素合成途徑下游，果實中的β-胡蘿卜素含量明顯增加，而在上游果實中LCY-B 基因的表達被抑制，破色階段其mRNA 含量幾乎為零。

番茄紅素ε-環(huán)化酶（LCY-E）的作用是催化番茄紅素生成δ-胡蘿卜素。LCY-E 定位在12 號染色體上，與LCY-B 的氨基酸序列同源性達35%，以單拷貝形式存在，現(xiàn)已克隆出其cDNA 序列。LCY-E 基因在番茄中的表達量隨著果實進入轉(zhuǎn)色期而迅速增加，而在果實成熟期其表達消失。Davuluri 等（2004）通過RNAi 技術(shù)使LCY-E 基因不表達，使番茄果實中番茄紅素的積累量增加（存在不顯著差異）。同時，人們也在研究中發(fā)現(xiàn)了ε-環(huán)化酶的等位基因Del，該基因與LCY-E 共分離。在番茄Delta 突變體的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)該突變由單一顯性基因Del 控制，它的轉(zhuǎn)錄表達使得果實中合成的番茄紅素減少、δ-胡蘿卜素增加，果實顏色由紅色（野生型）變?yōu)槌赛S色（程琳，2012），破色階段其mRNA 含量幾乎為零。

2.8 類胡蘿卜素加氧酶類（CCD、NCED）

類胡蘿卜素裂解加氧酶家族（CCO）包括了類胡蘿卜素裂解雙加氧酶亞家族（CCD）以及9-順式-環(huán)氧-類胡蘿卜素雙加氧酶亞家族（NECD）2 個亞家族。在番茄CCD 亞家族中，已鑒定出4 種與類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)的CCD 基因：CCD1、CCD4、CCD7、CCD8。CCD1（CCD1A、CCD1B）、CCD7 位 于1 號 染 色 體 上，CCD4（CCD4A、CCD4B）、CCD8 位于8 號染色體上。CCD 可導(dǎo)致C40 類胡蘿卜素向β-胡蘿卜素類轉(zhuǎn)化，對調(diào)節(jié)類胡蘿卜素積累至關(guān)重要，同時與阿樸胡蘿卜素的合成相關(guān)（Auldridge et al.，2006）。其中，CCD1 的表達與番茄中揮發(fā)性香味代謝產(chǎn)物的排放有關(guān)（Simkin et al.，2004）。CCD1 酶（SlCCD1A和SlCCD1B）在番茄果實中類胡蘿卜素的裂解（切割類胡蘿卜素底物的9、10 雙鍵）產(chǎn)生各種類異戊二烯揮發(fā)物，包括順-檸檬醛（neral）、反-檸檬醛（geranial）和法呢基丙酮（Ilg et al. ，2016）。CCD7 和CCD8 與獨腳金內(nèi)酯生物合成有關(guān)（Liu et al.，2015），其中CCD7 酶裂解9-順式構(gòu)型類胡蘿卜素（即切割類胡蘿卜素底物的9、10 雙鍵），例如9-順式葉黃素和9-順式-玉米黃質(zhì)，導(dǎo)致形成9-順式-3-OH-ε-apo-10′-胡蘿卜素和9-順式-3-OH-β-apo-10′- 胡 蘿 卜 醛（Bruno et al.，2014），然后CCD8 再在該產(chǎn)物的13、14 雙鍵處作用，使其裂解（Auldridge et al.，2006）。

9-順式-環(huán)氧-類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）家族是CCO 家族下屬的亞家族（Kotíková et al.，2018）。已鑒定出番茄中與類胡蘿卜素合成相關(guān)的NECD 基因位于7 號染色體（NCED）、8 號染色體（NCED2）、5 號染色體（NCED3）上，作用是切割9-新黃素和9-順-紫黃質(zhì)的11、12 雙鍵（Auldridge et al.，2006），并進一步修飾以產(chǎn)生植物激素ABA（Nisar et al.，2015）。

2.9 類胡蘿卜素羥化酶類（CRTR-B、CRTR-E）

類胡蘿卜素β-羥化酶（CRTR-B）和類胡蘿卜素ε -羥化酶（CRTR-E）基因在番茄中的主要存在形式為CYP97A29 和CYP97C11，分別屬于Cyt P450 家族97（CYP97）的A 和C 亞家族（Stigliani et al.，2011），這2 種羥化酶以環(huán)狀類胡蘿卜素為底物，合成含氧類胡蘿卜素（玉米黃素和葉黃素）。在番茄中，CRTR-B 有2 個同源基因CRTR-B1 和CRTR-B2，前者在所有組織中都表達，在葉中的表達最強，后者則是在花中高度表達，在葉片和萼片中完全不表達（Galpaz et al.，2006；D’Ambrosio et al.，2011）。

3 番茄中參與調(diào)控類胡蘿卜素合成的轉(zhuǎn)錄因子

隨著人們對類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子能直接或間接調(diào)控類胡蘿卜素的積累。番茄作為果實成熟研究的模式植物，有關(guān)參與調(diào)控其果實類胡蘿卜素合成的轉(zhuǎn)錄因子的研究已取得了一定進展（高慧君 等，2015）。在番茄中，目前報道的有關(guān)影響和調(diào)控類胡蘿卜素合成的轉(zhuǎn)錄因子主要包括MADS-box 家族、SBPbox 家族、NAC 家族、AP2/ERF 家族、MYB 家族、HD-Zip 家族、NF-Y 家族等（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類胡蘿卜素合成途徑的代謝網(wǎng)絡(luò)

3.1 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子

MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子是目前已報道的影響番茄類胡蘿卜素合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子家族中數(shù)量最多的一個。番茄MADS-RIN 是MADS 轉(zhuǎn)錄因子家族SEPALLATA 亞家族的一員，同時也是目前番茄中研究最為深入的轉(zhuǎn)錄因子。在番茄rin 突變體果實中，MADS-RIN 基因編碼的RIN 轉(zhuǎn)錄因子功能異常，從而導(dǎo)致了rin 突變體果實不同于野生型果實的成熟變化，包括呼吸高峰和乙烯高峰的變化受到影響；果實的軟化、色澤和香氣及風(fēng)味物質(zhì)的形成均不同于野生型番茄果實。迄今研究表明，MADS-RIN 的直接靶標(biāo)至少涉及241 個基因，參與到67 個代謝途徑，涉及乙烯合成及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、呼吸作用、植物激素合成、細胞壁修飾、色素積累、芳香族化合物合成和逆境脅迫應(yīng)答等多個方面（Ito et al.，2008；Martel et al.，2011）。免疫共沉淀結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子MADS-RIN 結(jié)合PSY1啟動子，調(diào)控PSY1 基因的表達，從而調(diào)控番茄果實類胡蘿卜素合成（Li et al.，2017）。番茄rin 突變體的果實在紅熟期呈綠色至微黃色，經(jīng)測定該突變體果實中沒有或只有少量番茄紅素的合成，且?guī)缀鯔z測不到PSY1 基因的表達，說明MADS-RIN 在類胡蘿卜素合成代謝過程中起著重要調(diào)控作用。

番 茄MADS1 與MADS-RIN 同 屬 于SEPALLATA 亞家族，是MADS-box 家族中第一個被報道的果實成熟抑制因子。對SlMADS1 進行RNAi，ACO1、ACS2 和E8 表達量在SlMADS1 沉默系中顯著上調(diào)，而轉(zhuǎn)基因果實中PSY1 的表達顯著增加，證明MADS1 對番茄果實類胡蘿卜素調(diào)控過程起抑制作用（Dong et al.，2013）。

番 茄TAGL1（TOMATO AGAMOUS-LIKE1）通過調(diào)控番茄紅素含量調(diào)控類胡蘿卜素積累（Pan et al.，2010）。利用RNAi 沉默SlTAGL1，果實中β-胡蘿卜素含量上升、番茄紅素含量下降，果實表面粗糙，外果皮變薄，厚角細胞的體積及數(shù)量顯著降低，后期果實呈現(xiàn)橙色或黃色的表型，無轉(zhuǎn)紅軟化過程（Giménez et al.，2010；Pan et al.，2010）。TAGL1 沉默后，番茄果實中ACS2、ACS4、PSY1、PG、PE2、CRTISO 及E4 表達下降，但RIN、NOR 及CNR 的表達不受影響（Vrebalov et al.，2009）。相反，SlTAGL1 超表達能使成熟果實紅色加深，番茄紅素含量增加（Itkin et al.，2009；Pan et al.，2010）。

此外，MADS-box 家族的其他轉(zhuǎn)錄因子也影響番茄果實中的類胡蘿卜素合成。其中，SlMBP8與果實中類胡蘿卜素的合成具有負相關(guān)關(guān)系，對SlMBP8 進行沉默時，果實中PSY1、PDS、ZDS 表達量均有大幅度增加，且總類胡蘿卜素含量增多（Yin et al.，2017）；SlFYFL 對果實中類胡蘿卜素合成途徑起負反饋調(diào)節(jié)作用，在SlFYFL 過表達株系的果實成熟過程中，PSY1、PDS 和ZDS 表達水平可下調(diào)了35%～50%，從而導(dǎo)致果實中總類胡蘿卜素含量的大幅降低（Xie et al.，2014）；SlMBP15與SlMBP8 對類胡蘿卜素的作用完全相反，沉默SlMBP15 后，E4、E8、LOXA、LOXB、ERF1 和rin表達下降，PSY1、PDS、ZDS 的轉(zhuǎn)錄顯著降低，果皮中類胡蘿卜素積累顯著減少（Yin et al.，2018）；對SlCMB1 進行RNA 干擾，果實中PSY1、PDS 表達下調(diào)，CYC-B、LCY-B 和LCY-E 表達上調(diào)，總類胡蘿卜素含量及番茄紅素含量均明顯下降（Zhang et al.，2018）；FUL1 和FUL2 作 為MADS-RIN 的互作蛋白，在番茄中的功能與其類似，對這2 個基因的轉(zhuǎn)基因干涉植株進行分析，可得到這2 個基因通過正相關(guān)作用影響PSY1 和ZDS 表達，從而控制果實內(nèi)類胡蘿卜素的積累（汪淑芬，2014）。

3.2 SBP-box 轉(zhuǎn)錄因子

SPL-CNR 是SBP-box（SQUAMOSA promoter binding-like protein） 家 族 基 因（Salinas et al.，2012），發(fā)現(xiàn)于番茄Cnr（colorless non-ripening）突變體中。Cnr 突變體表型與其他已知的多個突變均明顯不同，開花40～50 d 后果實仍保持較高的硬度，果皮呈現(xiàn)黃色，果肉為無色或白色，乙烯合成下降，用外源乙烯處理仍不能完全恢復(fù)野生型表型（Orf ila & Knox，2001）。Manning 等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，Cnr 突變體是由于SPL-CNR 啟動子自發(fā)表觀遺傳變異（DNA 甲基化）引起的。在Cnr 突變體整個果實發(fā)育期間，MADS-RIN 的表達顯著上升，F(xiàn)UL1 的表達顯著下降，PSY1 的表達完全檢測不到，表明CNR、RIN、NOR 及FUL1 至少部分存在于同一轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑中（Eriksson et al.，2004），SPL-CNR 基因的表達與PSY1 呈正相關(guān)（Salinas et al.，2012）。

3.3 NAC 轉(zhuǎn)錄因子

在NAC 家族SlNAC1 超表達株系的果實中，PSY1 上調(diào)表達，CYCB 下調(diào)表達，在這一過程中該基因依賴了乙烯的調(diào)控作用，使植株及果實中類胡蘿卜素合成代謝含量發(fā)生變化（Ma et al.，2014）。而該家族的SlNAC4 表達受到抑制時，PSY1 轉(zhuǎn)錄物減少，LCY-B、LCY-E 和CYC-B 的轉(zhuǎn)錄物積累增 加，類胡蘿卜素合成總量降低，同時該轉(zhuǎn)錄因子也可通過對乙烯合成的調(diào)控影響類胡蘿卜素合成途徑（Zhu et al.，2014）。

3.4 AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子

AP2/ERF 家族的SlERF6 負反饋調(diào)節(jié)乙烯的生物合成，影響γ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的含量，從而控制類胡蘿卜素的合成。而在RNA 干擾下SlERF6 低表達時，DXS 表達量升高，能夠在果實成熟過程中增強類胡蘿卜素水平，也為其能夠直接調(diào)控類胡蘿卜素合成途徑提供確鑿證據(jù)（Lee et al.，2012）。在類胡蘿卜素代謝通路中，SlAP2a通過調(diào)控乙烯水平，使得PSY1、CYCB、PDS、BCH、CRTISO、ZEP1 等的表達量發(fā)生變化（Karlova et al.，2011；高慧君 等，2015），從而調(diào)控番茄果實中類胡蘿卜素含量。在SlAP2a 的RNAi 果實中，PSY1 表達量下降，CYCB 表達量上升，導(dǎo)致β-胡蘿卜素含量上升，番茄紅素合成明顯受到抑制，果實出現(xiàn)顏色分布不均及轉(zhuǎn)紅困難等情況。同時該轉(zhuǎn)錄因子也被推測能夠直接調(diào)控PSY 而影響番茄果實類胡蘿卜素代謝進程（Chung et al.，2010）。

3.5 MYB 轉(zhuǎn)錄因子

MYB 家族的SLAN2 對于番茄中類胡蘿卜素的合成具有明顯的抑制作用，超表達植株的果實中各種類胡蘿卜素含量相對于野生型均有不同程度的減少（Meng et al.，2015），同時，果實中PSY1、PDS、ZDS 表達量均較低（相對于野生型植株）。GARP 亞家族的GLK1、GLK2 對果實中類胡蘿卜素含量起促進作用，這2 個基因的超表達植株中八氫番茄紅素、葉黃素、番茄紅素等各種類胡蘿卜素及總胡蘿卜素的表達均呈上升趨勢，但該促進作用不是通過一般的成熟控制系統(tǒng)（乙烯調(diào)控系統(tǒng)、關(guān)鍵成熟基因）進行，而是通過改變質(zhì)體數(shù)量和活性完成的。同時，相比GLK1 而言，GLK2 在果實中具有相當(dāng)高的表達量（Nguyen et al.，2014）。

3.6 HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子

番茄HD-Zip 家族轉(zhuǎn)錄因子LeHB-1 在果實成熟和果色變化過程中，通過調(diào)控乙烯合成調(diào)控類胡蘿卜素含量（Lin et al.，2008）。研究表明，LeHB-1 基因在果實發(fā)育初期和綠熟期高度表達，破色后表達量逐漸下降（Lin et al.，2008）。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silence，VIGS）技術(shù)在番茄Ailsa Craig 果實上沉默LeHB-1（mRNA 表達下降 60%～90%），果實成熟延緩，部分延熟果實果皮呈現(xiàn)黃色或橙色，LeACO1 表達下降，與ACO1 沉默的轉(zhuǎn)基因番茄表型一致（Lin et al.，2008）。

3.7 NF-Y 轉(zhuǎn)錄因子

NF-Y 家族部分基因的表達模式也與果實成熟中類胡蘿卜素的積累起正或負反饋作用（Shan et al.，2016）。通過對番茄果實成熟過程中該家族各個基因的表達情況及表達量可視化分析，可得出：NF-Y 家族中與成熟過程相關(guān)的基因共有13 個，分屬NF-YA、NF-YB、NF-YC 3 個亞家族，其中，一些基因與果實成熟呈正相關(guān)，一些則呈負相關(guān)關(guān)系，李珊等（2017）確定了包括NF-YB 亞 組（Solyc06g069310、Solyc07g065500）和NF-YA 亞 組 的3 個 成 員（Solyc01g087240、Solyc08g062210、Solyc11g065700）的5 個NF-Y 基因抑制番茄果實的成熟。部分NF-Y 基因也能與RIN 結(jié)合，控制類胡蘿卜素的合成過程。

3.8 其他核蛋白

在番茄中，除了已報道的轉(zhuǎn)錄因子之外，還存在著許多其他的核蛋白對類胡蘿卜素合成起到調(diào)節(jié)作用，如光信號調(diào)節(jié)因子、生長素響應(yīng)因子、組蛋白去乙?；窰D2 家族的HDT3、番茄滯綠蛋白SGR1（STAY-GREEN）和隱花色素家族的CRY1a等。這些蛋白對于番茄中各種類胡蘿卜素合成酶的作用趨勢不相一致，而對番茄果實成熟過程中總類胡蘿卜素積累產(chǎn)生積極作用。

3.8.1 光信號調(diào)節(jié)因子 光敏色素PHY 作為番茄體內(nèi)響應(yīng)紅光和遠紅光的分子開關(guān)，在植物果實的光形態(tài)反應(yīng)及果實著色方面有重要的影響作用。對果實進行特異性RNAi 介導(dǎo)的SlPHY 基因沉默后，獲得的轉(zhuǎn)基因成熟果實與野生型番茄成熟果實相比，GGPPS、PSY1、PDS 表達量大幅減少，番茄紅素含量顯著降低。

光敏色素互作因子PIF（phytochrome-interacting factor）家族中的PIF1a 對番茄果實的成熟起顯著的正調(diào)節(jié)作用，該互作因子通過直接結(jié)合到PSY1基因啟動子上的PBE-box（CACATG）來抑制類胡蘿卜素生物合成及表達。在對SlPIF1a 進行沉默后，SlPSY1 轉(zhuǎn)錄物大幅增加，八氫番茄紅素及番茄紅素含量明顯升高（Llorente et al.，2016；Ernesto et al.，2018）。

DET1（DE-ETIOLATED 1）屬于核蛋白的一種（Benvenuto et al.，2002），DET1 是調(diào)控番茄光形態(tài)發(fā)生的重要基因之一（高慧君 等，2015），轉(zhuǎn)DET1 基因的植株類胡蘿卜素含量明顯下降，而RNAi 植株中番茄紅素和β-胡蘿卜素水平顯著增加。研究表明DET1 對番茄果實中類胡蘿卜素（尤其是β-胡蘿卜素和番茄紅素）的含量提升有負相關(guān)關(guān)系（Davuluri et al.，2004）。

3.8.2 生長素響應(yīng)因子 生長素響應(yīng)因子ARF（auxin response factors）家族的一些成員在近些年的研究中被證明與果實成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有著密切關(guān)系，其中SlARF2 的表達模式顯著與成熟相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，番茄中SlARF2A 和SlARF2B 是一對被推測出的共同基因組，這二者在番茄果實內(nèi)充當(dāng)生長素依賴性基因轉(zhuǎn)錄的阻遏物。當(dāng)對該基因組進行共同沉默時，SlARF2AB-RNAi 果實表現(xiàn)出低水平的SlPSY1 轉(zhuǎn)錄物和高水平的SlLCY-B 和SlCYCB，促進β-胡蘿卜素而非番茄紅素的積累，抑制番茄果實類胡蘿卜素的積累，從而導(dǎo)致SlARF2ABRNAi 果實表現(xiàn)出橙黃色（Hao et al.，2015；Breitel et al.，2016）。

3.8.3 其他核蛋白 HDT3 的RNAi 果實中PSY1表達下調(diào)，CYCB、LCY-B 和LCY-E 表達顯著上調(diào)，但總類胡蘿卜素含量上調(diào)表達，同時，該轉(zhuǎn)錄因子被推測與組蛋白的乙酰化和RIN 的啟動子甲基化相關(guān)，該關(guān)聯(lián)也是HDT3 調(diào)控番茄類胡蘿卜素合成代謝的方式之一（Guo et al.，2017）。

番茄滯綠蛋白SGR1（STAY-GREEN）通過與PSY1 互作，控制PSY1 的表達量，反向調(diào)控β-胡蘿卜素、番茄紅素和八氫番茄紅素等的積累量，從而控制類胡蘿卜素的積累。且在果實成熟早期，SGR1 也與PSY1 互作調(diào)控果實內(nèi)質(zhì)體活動，從而調(diào)節(jié)類胡蘿卜素合成（Luo et al.，2013）。

CRYs 是隱花色素中的一員，其中的CRY1a 通 過 控 制 其 下 游 組 分 如HY5（LONG HYPOCOTYL5）、COP1 等調(diào)節(jié)果實色素沉著，促進或抑制果實內(nèi)六氫番茄紅素、八氫番茄紅素、β-胡蘿卜素的合成，最終使果實內(nèi)部總類胡蘿卜素含量發(fā)生變化（Liu et al.，2018）。

4 環(huán)境因子及表觀遺傳對番茄果實類胡蘿卜素的調(diào)控

4.1 環(huán)境因子對番茄果實類胡蘿卜素的調(diào)控

環(huán)境因子在植物生長發(fā)育的各個方面均起著不可或缺的作用，在果實發(fā)育成熟過程中，該作用尤為明顯。

八氫番茄紅素的合成是類胡蘿卜素合成代謝途徑中的關(guān)鍵限速步驟，這一限速步驟涉及的合成酶八氫番茄紅素合成酶，也是該途徑中最重要的限速酶之一。該酶對應(yīng)的基因PSY 受多種環(huán)境因子制約，包括光強、溫度、鹽離子濃度、水分、光周期等。番茄中PSY 基因的表達受光周期影響較為顯著，在紅光和遠紅光下PSY 的轉(zhuǎn)錄豐度上調(diào)，最終導(dǎo)致類胡蘿卜素合成量的提升。而在高溫下，PSY 轉(zhuǎn)錄水平受到一定程度的抑制，mRNA 水平大幅下降，果實中類胡蘿卜素含量降低（Welsch et al.，2000；Cazzonelli & Pogson，2010）。

從八氫番茄紅素合成至全反式番茄紅素合成需要一系列復(fù)雜的反應(yīng)，這一過程中需要八氫番茄紅素去飽和酶（PDS）、β-胡蘿卜素異構(gòu)酶（ZISO）、β-胡蘿卜素去飽和酶（ZDS）和類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO），以及光介導(dǎo)的光異構(gòu)化的共同參與。其中，PDS 與PSY 的調(diào)控作用機理有一定的相似性，即二者的轉(zhuǎn)錄豐度都在光敏色素介導(dǎo)的光調(diào)控下上升，從而使果實內(nèi)部總類胡蘿卜素含量上升。ZISO 作為番茄中類胡蘿卜素途徑中表達最高的2個基因之一，功能可以部分被光照取代。當(dāng)沉默該基因時，番茄紅素大量減少，總類胡蘿卜素含量降低（Fantini et al.，2013）。

4.2 表觀遺傳對番茄果實中類胡蘿卜素的調(diào)控

表觀遺傳是不同于孟德爾等位基因相互作用來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的遺傳方式。近些年，隨著表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的逐步拓寬，類胡蘿卜素的表觀遺傳機制得到了進一步探索。類胡蘿卜素的合成與代謝途徑是整個類胡蘿卜素探索方向上最主要的分支，而這一途徑在植物整個生命周期中受到嚴(yán)格而復(fù)雜的調(diào)控。研究表明，表觀遺傳可通過調(diào)節(jié)番茄體內(nèi)類胡蘿卜素合成代謝途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達而控制其果實類胡蘿卜素含量（Zhong et al.，2013；Arango et al.，2016）。

DNA 甲基化是基因轉(zhuǎn)錄被表觀遺傳調(diào)節(jié)的研究最多的機制之一（Arango et al.，2016）。甲基化 發(fā) 生 在DNA 中 的CpG、CpCpG、CpHpHp 和CpNpG 基序中，是種子成熟前抑制果實成熟的關(guān)鍵決定因素之一（Zhong et al.，2013）。在番茄Spn-cnr 突變體果實中，啟動子區(qū)域發(fā)生高水平甲基化后，至少有18 個甲基化胞嘧啶的生成，導(dǎo)致LeSpn-cnr 的表達較低，PSY 表達水平下調(diào)，類胡蘿卜素積累受到抑制，得到了無色非成熟突變體，果實缺乏番茄紅素，呈綠色，無紅熟期（Zhong et al.，2013）。

5 展望

近年來，隨著人們營養(yǎng)健康的需要，對園藝產(chǎn)品的營養(yǎng)價值也提出了更高的要求。類胡蘿卜素由于其種類和功能的多樣性，研究也越來越深入，一直以來成為色素多功能性研究的重要對象。番茄作為果實成熟研究的模式生物，其類胡蘿卜素合成途徑目前已經(jīng)形成較為清晰的通路，但其調(diào)控基因卻有待進一步闡明。從目前的研究進展來看，番茄的類胡蘿卜素合成受到光照、激素、溫度、營養(yǎng)、發(fā)育階段等多方面因素的影響，但目前對于已報道的可調(diào)控番茄類胡蘿卜素含量的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子是如何具體調(diào)控類胡蘿卜素合成，在類胡蘿卜素合成過程中如何發(fā)揮作用等方面尚不清楚，有待進一步深入研究。隨著番茄類胡蘿卜素合成與調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能的進一步發(fā)掘，將為番茄及其他園藝作物提高類胡蘿卜素含量新品種的培育等方面提供充分的理論依據(jù)。