氧化鐵納米顆粒示蹤干細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

謝園園，劉 碩，王 斌

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 臨床干細(xì)胞研究室，江蘇 南京 210008)

1 前 言

近年來(lái)，涉及納米技術(shù)的研究成果呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，納米材料在電子學(xué)、光學(xué)、自動(dòng)化技術(shù)、紡織、石油、天然氣和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-4]。在所有類型的納米顆粒中，磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNPs，直徑10～100 nm)，因其尺寸和形狀可調(diào)節(jié)、合成方法簡(jiǎn)單、具有相對(duì)較大的比表面積以及可攜帶多種生物配體的特性等，在醫(yī)學(xué)研究中關(guān)注度較高[5]。MNPs由鐵、鈷、鎳和鋅等磁性材料組成[6]，包含多種金屬化合物，例如Fe3O4、Fe2O3、NiFe2O4和FeCo，從而具有不同的磁性[7]。

眾所周知，鐵是所有生物體必須的礦物質(zhì)，是人體中天然存在的金屬元素，具有多種重要功能，比如：是血紅蛋白的關(guān)鍵組成部分，可為組織攜帶氧氣，促進(jìn)維生素B族代謝以及促進(jìn)嬰幼兒智力發(fā)育等。MNPs中的氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles，IONPs)，具有獨(dú)特的磁性和優(yōu)異的生物相容性[8]，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，包括貧血患者的補(bǔ)鐵劑[9]、磁性細(xì)胞或分子分離技術(shù)[10]、磁性靶向藥物和基因傳遞載體[11]、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)造影劑[12]、磁流體熱療(magnetic fluid hyperthermia，MFH)[13]和干細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用[14]等等。

IONPs的功能核心是納米結(jié)構(gòu)的氧化鐵分子，最常用的氧化鐵是磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γ-Fe2O3)和赤鐵礦(α-Fe2O3)[15]。裸的IONPs顆粒易于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而聚集成團(tuán)，而且可能有毒，因此IONPs一般會(huì)被有機(jī)或無(wú)機(jī)涂層包裹，并且可以用第二層或更多層改性第一涂層以提供特定的功能，從而減少氧化鐵氧化、防止納米粒子聚集及提高生物相容性[16]。醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的是有機(jī)涂層，包括檸檬酸鹽、葡聚糖、聚乙二醇、殼聚糖、聚乙烯亞胺、磷脂和共聚物等等[17]，并且涂層外表還可以通過(guò)物理或化學(xué)的方法綴合與特異性受體結(jié)合的靶向分子(即配體或抗體)，也可以加載特定的藥物化學(xué)分子，如蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)的治療劑，用于某些醫(yī)學(xué)目的[18]。

當(dāng)核心IONPs顆粒尺寸小于臨界尺寸(通常為10～15 nm)時(shí)，在一定溫度范圍內(nèi)顆粒將表現(xiàn)出超順磁性[19]，稱之為超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)。超順磁性是指整個(gè)粒子表現(xiàn)為順磁原子的狀態(tài)，例如，該單疇粒子的磁矩與外部磁場(chǎng)對(duì)齊[20]，通常MRI是觀察SPIONs的首選技術(shù)。MRI是一種功能強(qiáng)大且應(yīng)用廣泛的醫(yī)學(xué)成像方法，具有極高的成像靈活性、優(yōu)異的空間分辨率，可避免電離輻射，患者接受度高，并且能夠評(píng)估解剖學(xué)和生理學(xué)參數(shù)，獲得獨(dú)特的臨床信息，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最有效的診斷工具之一[21]。此外，用于MRI成像的SPIONs，一般具有可生物降解的碳水化合物表層和氧化鐵納米顆粒核心，可以提供強(qiáng)烈的對(duì)比度區(qū)分移植體內(nèi)的SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞和周圍宿主組織[22]，也成為近年來(lái)科學(xué)家們提出的一種新興的干細(xì)胞示蹤檢測(cè)技術(shù)——將MRI和SPIONs應(yīng)用結(jié)合評(píng)估干細(xì)胞在體內(nèi)的命運(yùn)，目前已被提出作為監(jiān)測(cè)植入體內(nèi)的干細(xì)胞生物分布和遷移的金標(biāo)準(zhǔn)[23]。

2 SPIONs在MRI的臨床應(yīng)用中的發(fā)展過(guò)程

目前SPIONs用于臨床成像已經(jīng)超過(guò)20年，本文將詳細(xì)介紹以往和當(dāng)前被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的SPIONs的發(fā)展過(guò)程及各自特點(diǎn)。1995年，第一個(gè)用以MRI成像的SPION被開(kāi)發(fā)出來(lái)，其流體動(dòng)力學(xué)半徑是100～150 nm，是由5～10 nm的氧化鐵核心和葡聚糖分子包被的表面組成[24]。但是在不斷的研究與應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)其安全性、生物相容性、MRI的靈敏度以及與成像裝置的兼容性都需要進(jìn)一步改進(jìn)。隨后，不斷有研究報(bào)道逐漸優(yōu)化的SPIONs的合成方法和工藝，基于其制備了多種質(zhì)量較高、成本較低的納米顆粒材料。

2.1 SPIONs的合成方法

2.1.1 堿性溶液共沉淀法

在堿性溶液中共沉淀Fe2+(亞鐵離子)和Fe3+(鐵離子)是公認(rèn)的、常規(guī)的SPIONs合成方法[10,25]，通過(guò)在非氧化環(huán)境中添加堿性溶液(如反應(yīng)方程式(1))，在穩(wěn)定劑存在下，使用定比例的Fe2+和Fe3+鹽溶液，通過(guò)沉淀法形成Fe3O4納米顆粒。根據(jù)用于共沉淀的懸浮液的pH值和氧含量，F(xiàn)e3O4可以通過(guò)各種電子或離子轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)變成γ-Fe2O3(如反應(yīng)方程式(2))，同時(shí)可以在溶液中加入不同的化合物涂覆在SPIONs表面[26]。通過(guò)改變前驅(qū)體鹽濃度、穩(wěn)定劑、反應(yīng)時(shí)間和pH，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)粒度、磁性和膠體穩(wěn)定性的高度控制。

Fe2++2Fe3++8OH-→Fe3O4+4H2O

(1)

Fe3O4+2H+→γ-Fe2O3+Fe2++ H2O

(2)

這些類型的SPIONs目前已得到了廣泛的研究，并成功轉(zhuǎn)化到臨床[25,27]。該方法可用于SPIONs的大規(guī)模生產(chǎn)，但缺陷是較難獲得尺寸均一和磁性穩(wěn)定的納米鐵顆粒核心[28]。Chen等[29]提出了一種稱為“水冷卻和磁性內(nèi)部加熱共沉淀”的物理輔助策略優(yōu)化合成SPIONs的方法。共沉淀制備過(guò)程按順序分為成核、生長(zhǎng)和成熟3個(gè)部分，而加熱是為納米晶體生長(zhǎng)和成熟階段提供足夠的能量，用優(yōu)化工藝制備的SPIONs的晶體結(jié)構(gòu)得到了極大的改善，粒度分布更均勻，磁性能顯著提高。

2.1.2 熱分解法

在封端劑(例如油酸和油胺)存在下，將鐵的有機(jī)化合物(例如五羰基鐵Fe(CO)5、油酸鐵Fe(acac)3或FeOOH)熱分解可獲得SPIONs，通過(guò)改變反應(yīng)中試劑的比例可以控制SPION的尺寸、形狀和分散性以及磁性等[30-33]。但主要缺點(diǎn)是合成的SPIONs是疏水性的，需經(jīng)多步驟、繁瑣的表面修飾才可以將它們改變成親水性顆粒，從而改善其生物學(xué)功能[28,34]。目前多篇文獻(xiàn)報(bào)道了在IONP的化學(xué)修飾中，聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)是具有高電荷密度的陽(yáng)離子聚合物，其氨基基團(tuán)片段可以產(chǎn)生具有正電荷和聚集穩(wěn)定性的納米顆粒，常被用作多功能封端劑和活性穩(wěn)定劑，對(duì)納米顆粒的流體動(dòng)力學(xué)具有顯著影響，并且可提高其在MRI中的弛豫率和靈敏度[35]。但是缺點(diǎn)是PEI能夠與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜相互作用,并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞具有高毒性[36]。而將水溶性聚合物聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)與PEI結(jié)合產(chǎn)生的PEI-PEG共聚物，不僅可以增強(qiáng)IONPs的水溶性,還可降低PEI的毒性[37]。

2.1.3 微乳液法

聚(L-丙交酯)(poly(L-lactide)，PLLA)是一種在醫(yī)療應(yīng)用中長(zhǎng)期使用并且安全的聚合物，是完全可生物降解的[38]。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)微乳液法合成氧化鐵-PLLA納米粒子[39]，這種合成方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將不同濃度和類型的氧化鐵引入納米顆粒中進(jìn)一步優(yōu)化MRI性質(zhì)，并可將熒光染料嵌入聚合物中。此種方法合成的納米顆粒具有負(fù)Zeta電位(-29和-44 mV之間)，直徑為110～135 nm[40]。

2.1.4 其他合成方法

很多文獻(xiàn)報(bào)道了合成具備所需形狀、尺寸和磁性的氧化鐵納米顆粒的其他方法。其他不太常用的合成方法包括水熱反應(yīng)和溶膠-凝膠合成法[27]。

對(duì)于在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，SPIONs在水中的穩(wěn)定性、對(duì)人體的無(wú)毒性以及體內(nèi)可生物降解性至關(guān)重要。一般來(lái)說(shuō)，F(xiàn)e3O4核的SPIONs因更易合成而被廣泛研究，但是有報(bào)道認(rèn)為Fe3O4會(huì)分解成γ-Fe2O3，可能會(huì)在標(biāo)記干細(xì)胞過(guò)程中引起毒性問(wèn)題[41]，因此研究人員一般會(huì)在標(biāo)記干細(xì)胞前預(yù)氧化微粒[42]。一般認(rèn)為γ-Fe2O3在化學(xué)性質(zhì)上更穩(wěn)定并且對(duì)干細(xì)胞的毒性較小，但對(duì)兩種成分尚未進(jìn)行詳細(xì)研究與比較，可能由于大多數(shù)合成的SPIONs是兩者的混合物[33]。

2.2 曾經(jīng)或正在批準(zhǔn)用于臨床成像的SPIONs

作者查閱大量文獻(xiàn)后，總結(jié)了曾經(jīng)或正在批準(zhǔn)用于臨床成像的SPIONs，列于表1。第一個(gè)上市的SPIONs是AMAG Pharmaceuticals公司研發(fā)的右旋糖酐包被的流體動(dòng)力學(xué)直徑為50～100 nm的Endorem?，通用名稱為Ferumoxides AMI-24，其1996年在美國(guó)上市，曾被美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于肝部損傷及某些腫瘤的MRI造影劑，最終于2008年撤市[43]。同一個(gè)公司研發(fā)的Combidex?/Sinerem?(低分子量右旋糖酐包被，20～50 nm)，2005年在歐洲上市，但僅僅兩年后就被撤市[44]。此外還有，Resovist?(聚葡萄糖山梨醇羧甲基醚包被，60～80 nm)和Clariscan?(氧化低聚淀粉包被，直徑為11～15 nm)，由于安全問(wèn)題，現(xiàn)均已被停產(chǎn)[45,46]。詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)表1。

表1 已被批準(zhǔn)用于臨床或正處于臨床試驗(yàn)的SPIONsTable 1 SPIONs approved for clinical application and in clinical trails

目前，可臨床應(yīng)用的SPIONs顆粒有FDA批準(zhǔn)的Ferumoxytol(Feraheme?，AMAG Pharmaceuticals)、中國(guó)FDA(China FDA，CFDA)批準(zhǔn)的瑞存以及在歐洲國(guó)家撤市而在日本仍用于肝臟成像的SPIONs顆粒Resovist?[47,48]。Ferumoxytol是FDA批準(zhǔn)的唯一靜脈注射的超小SPION(ultra SPION，USPIO)顆粒，直徑為17～31 nm，由氧化鐵晶體核心(直徑(6.76±0.41)nm)和親水性羧基葡聚糖涂層組成，最初被FDA批準(zhǔn)用于靜脈治療慢性腎病患者缺鐵性貧血的鐵補(bǔ)充劑[49]。由于其在血管內(nèi)半衰期長(zhǎng)達(dá)14～15 h[50]，近些年作為MRI的靜脈造影劑得到廣泛的研究，同時(shí)也用于細(xì)胞標(biāo)記。Ferumoxytol對(duì)T1和T2加權(quán)的MRI圖像具有強(qiáng)烈的信號(hào)效應(yīng)，反映的縱向r1和橫向r2松弛度分別為15和89 mM-1·s-1[51]，與其他USPIO相比，F(xiàn)erumoxytol較少發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)和特異性反應(yīng)。

3 SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的方法、臨床前安全性評(píng)價(jià)和臨床研究

干細(xì)胞因具有刺激病變宿主組織再生的能力而被廣泛地用于治療各種疾病和病癥。在再生療法中，對(duì)移植到體內(nèi)的干細(xì)胞成像并追蹤其在體內(nèi)的遷移和分布至關(guān)重要，可為評(píng)價(jià)干細(xì)胞的安全性和治療效果提供關(guān)鍵信息[55]。目前，臨床前成像技術(shù)如光學(xué)、光聲和MRI，通常涉及用探針或造影劑標(biāo)記細(xì)胞，使其與宿主細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)[56]。在臨床上，MRI穿透深度和空間分辨率等優(yōu)勢(shì)使其成為干細(xì)胞成像的首選方法，其避免了有創(chuàng)性檢查，并且是可重復(fù)的。一般將患者或組織樣本放置在臨床上常用的1.5 T、3 T以及臨床前高達(dá)21 T的設(shè)備的強(qiáng)外部磁場(chǎng)位置，通過(guò)MRI掃描儀來(lái)可視化活體組織或細(xì)胞。

SPIONs作為干細(xì)胞標(biāo)記示蹤劑與器官成像有著根本性的差異，后者是直接靜脈內(nèi)施用SPIONs溶液，而前者是體外標(biāo)記細(xì)胞后將其移植入患者和/或動(dòng)物模型體內(nèi)[33]。在兩種情況下鐵的使用劑量不能統(tǒng)一定論，評(píng)價(jià)體系也是不同的，并且要考慮SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的方法以及不用種類細(xì)胞的差異性。

3.1 SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的方法

SPIONs能否成功標(biāo)記細(xì)胞，受粒子從細(xì)胞外環(huán)境穿梭到細(xì)胞內(nèi)這一過(guò)程中各種因素的影響，標(biāo)記效率取決于細(xì)胞膜特性以及標(biāo)記細(xì)胞的大小。有些細(xì)胞類型允許對(duì)納米顆粒的有效攝取，并且僅通過(guò)簡(jiǎn)單地將納米顆粒懸浮在培養(yǎng)基中孵育一定的時(shí)間即可成功標(biāo)記。但是由于干細(xì)胞缺乏吞噬能力，內(nèi)化的SPIONs量可能不足以用于細(xì)胞成像，所以通常使用物理方法或轉(zhuǎn)染劑(transfection agents，TA)涂覆帶負(fù)電的SPIONs顆粒，促進(jìn)顆粒與陰離子細(xì)胞膜的結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)納米鐵顆粒的攝取[57]。常用的TA試劑包括脂質(zhì)體(lipofectamine、SuperFect)、多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)和硫酸魚精蛋白(protamine sulfate)等[58]。

3.1.1 物理學(xué)方法標(biāo)記

基于電穿孔、顯微注射或超聲脈沖[56,59,60]的物理學(xué)方法標(biāo)記干細(xì)胞的原理是暫時(shí)破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性，細(xì)胞膜滲透性的瞬時(shí)變化允許納米顆粒穿過(guò)膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。磁電/聲波穿孔的主要優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記是瞬時(shí)的、不需要延長(zhǎng)細(xì)胞的孵育時(shí)間，常用于標(biāo)記一些敏感的原代細(xì)胞。然而，這種標(biāo)記方式最大的缺陷是細(xì)胞死亡較多，并且需要針對(duì)每種細(xì)胞類型優(yōu)化參數(shù)[55]。Lei等使用聚焦超聲波的磁光子穿孔術(shù)(magnetosonoporation，MSP)標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞[61]，并且驗(yàn)證了MSP標(biāo)記干細(xì)胞的安全性。但是這些標(biāo)記程序?qū)Ω杉?xì)胞生物學(xué)的長(zhǎng)期影響需要更全面和徹底的評(píng)估。

此外，還有大量文獻(xiàn)報(bào)道，由于SPIONs的獨(dú)特磁性能，SPIONs和細(xì)胞膜之間的相互作用可以通過(guò)各種類型的磁場(chǎng)來(lái)控制。這種技術(shù)包括在細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育SPIONs，并在培養(yǎng)瓶下面放置一個(gè)磁鐵，從而產(chǎn)生一個(gè)靜磁場(chǎng)(static magnetic field，SMF)，一方面力的作用將納米鐵顆?！袄边M(jìn)細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)SMF會(huì)導(dǎo)致內(nèi)吞相關(guān)蛋白表達(dá)增加[62,63]，從而有更多的SPIONs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且該過(guò)程不損害細(xì)胞活力。除SMF外[64]，研究表明脈沖磁場(chǎng)(pulsed magnetic fields，PMF)[65]和交變磁場(chǎng)(alternating magnetic field，AMF)[66]產(chǎn)生的磁力也可增加細(xì)胞的SPIONs攝取量。此外，有研究人員合成具有不同磁鐵礦載荷的磁性納米顆粒，評(píng)估磁力對(duì)納米顆粒吸收的影響，結(jié)果表明，內(nèi)化速率取決于顆粒內(nèi)的磁鐵礦水平[67]。

3.1.2 PLL復(fù)合SPIONs顆粒標(biāo)記干細(xì)胞

PLL(分子量為 350～400 Da)是一種帶正電荷的合成氨基酸鏈，廣泛用作生物涂層，并且是第一種認(rèn)定的聚合DNA轉(zhuǎn)染試劑，可將DNA濃縮成帶正電的顆粒。有文獻(xiàn)報(bào)道，PLL與氧化鐵納米顆粒復(fù)合后標(biāo)記干細(xì)胞的效率高達(dá)80%[68]。作者課題組曾將Fe濃度為5 mg/mL的Ferumoxytol與濃度為100 μg/mL 的PLL復(fù)合后超聲，用Fe終濃度為200 μg/mL的復(fù)合物轉(zhuǎn)染人臍帶和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，效率均可達(dá)到100%，見(jiàn)圖1。但是也有文獻(xiàn)報(bào)道，SPIONs-PLL復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后可能會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧和羥基自由基的形成，從而增加細(xì)胞凋亡率，并且PLL的終濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，可引起明顯的細(xì)胞死亡[69]，還有報(bào)告指出用SPIONs-PLL復(fù)合物標(biāo)記MSCs抑制其軟骨分化能力[70,71]。因此針對(duì)不同的干細(xì)胞必須優(yōu)化出最佳的PLL和SPIONs的比率以及轉(zhuǎn)染濃度，轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞本身產(chǎn)生的毒性根據(jù)所應(yīng)用的條件而變化。

3.1.3 硫酸魚精蛋白復(fù)合SPIONs顆粒標(biāo)記干細(xì)胞

目前，大部分的干細(xì)胞示蹤研究中使用硫酸魚精蛋白(protamine sulfate，Ps)與Ferumoxytol復(fù)合來(lái)標(biāo)記干細(xì)胞，結(jié)果表明單獨(dú)的Ferumoxytol與Ps直接復(fù)合不能有效地標(biāo)記細(xì)胞[49,72]。將Ps先和肝素(heparin sodium，Hs)按比例混合，迅速通過(guò)靜電作用形成復(fù)合物[73]，然后再加入Ferumoxytol，三者即可形成穩(wěn)定的HsPsF納米復(fù)合物，可以高效率地標(biāo)記干細(xì)胞。Ps是一種低分子量(～4000 Da)天然聚陽(yáng)離子肽；Hs為FDA批準(zhǔn)的抗凝血藥物[58]，細(xì)胞耐受性好，治療窗口寬(大于50 mg/mL)。HsPsF標(biāo)記干細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是這些藥物都是具有臨床資質(zhì)的，因此不需要對(duì)復(fù)合物各種藥物成份進(jìn)行廣泛的安全性檢測(cè)，縮短了臨床轉(zhuǎn)化時(shí)間。文獻(xiàn)中報(bào)道的高效的標(biāo)記方法[74]是將HsPsF按照Hs(1～5 IU/mL)、Ps(30～60 μg/mL)、Ferumoxytol(50～100 μg/mL)的順序依次加入無(wú)血清培養(yǎng)基中混合，配置成復(fù)合物后加入細(xì)胞中培養(yǎng)4 h，再加入血清至完全培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h。作者課題組前期也采用HsPsF(濃度分別為5 IU/mL、60 μg/mL、100 μg/mL)的方法標(biāo)記人臍帶MSCs，標(biāo)記效率也達(dá)到100%，見(jiàn)圖1。HPF的標(biāo)記方法中使用的Hs、Ps和Ferumoxytol的濃度均低于臨床推薦劑量。而且有文獻(xiàn)報(bào)道，HsPsF納米復(fù)合物具有與SPIONs相似的生物化學(xué)特性，可在標(biāo)記細(xì)胞中通過(guò)鐵代謝途徑生物降解[75]。

圖1 Ferumoxytol標(biāo)記人臍帶MSCs的普魯士藍(lán)染色圖：(a)對(duì)照組，(b)Ferumoxytol-PLL標(biāo)記法，(c)HsPsF標(biāo)記法Fig.1 Prussian blue staining images of Ferumoxytol labeled human umbilical cord MSCs:(a)control cell,(b)Ferumoxytol-PLL labeling method,(c)HsPsF labeling method

3.1.4 蛋白質(zhì)電暈介導(dǎo)的SPIONs顆粒標(biāo)記干細(xì)胞

Nejadnik等[76]將Ferumoxytol與含有人血清(Human serum，HS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基在溫育后通過(guò)離心除去過(guò)量和未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌。將沉淀重懸于PBS后，以Fe終濃度100 μg/mL加入細(xì)胞中，標(biāo)記人MSCs，細(xì)胞內(nèi)平均鐵含量為(4.01±0.02)pg，在動(dòng)物模型體內(nèi)MRI T2弛豫時(shí)間相比于HPF標(biāo)記方法明顯縮短。

無(wú)論使用何種標(biāo)記方法，都需要檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)記效率，一般采用普魯士藍(lán)呈色法定性觀察；用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察SPIONs在細(xì)胞內(nèi)分布；采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)平均鐵含量。在ICP-AES檢測(cè)前需徹底清洗細(xì)胞以去除細(xì)胞表面所有過(guò)量的納米顆粒，因?yàn)闅埩粼诩?xì)胞外的造影劑可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高，而通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)[77]分選后定量細(xì)胞內(nèi)鐵含量的方法可以排除細(xì)胞外聚集體。最為精確的定量方法是用磁電泳檢測(cè)法[78,79]測(cè)量磁性納米顆粒的攝取，這種技術(shù)最初是由Zborowski等研究學(xué)者提出的，細(xì)胞磁電泳取決于高度規(guī)則的自旋鐵物質(zhì)的存在并且產(chǎn)生細(xì)胞磁泳過(guò)程，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞磁泳遷移率的平均值和分布的變化來(lái)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鐵含量，此方法優(yōu)勢(shì)是既可排除細(xì)胞外聚集體，又能測(cè)量活細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞中的磁性含量而非細(xì)胞群體的平均值。

3.2 SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的臨床前研究——安全性評(píng)價(jià)檢測(cè)

SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞為干細(xì)胞體內(nèi)示蹤提供了一種有望臨床轉(zhuǎn)化的工具，但是目前全世界并沒(méi)有批準(zhǔn)用于臨床的干細(xì)胞標(biāo)記造影劑，因此完善標(biāo)記后的干細(xì)胞的安全性評(píng)價(jià)體系對(duì)于干細(xì)胞示蹤的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。理想的臨床用細(xì)胞造影劑必須滿足以下標(biāo)準(zhǔn)[40]：① 標(biāo)記的細(xì)胞移植體內(nèi)后可觀察到的MRI信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞量呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)趨勢(shì)關(guān)系；② 不影響細(xì)胞在體內(nèi)的生存、擴(kuò)增和遷移；③ 國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(International Society for Cellular Therapy，ISCT)定義的干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有變化；④ 干細(xì)胞未發(fā)生明顯影響療效的功能改變。而干細(xì)胞的來(lái)源、轉(zhuǎn)染試劑、標(biāo)記技術(shù)、標(biāo)記時(shí)間以及細(xì)胞內(nèi)的鐵含量都有可能對(duì)標(biāo)記后的細(xì)胞產(chǎn)生影響。

作者研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞法規(guī)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，總結(jié)出SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞需檢測(cè)的項(xiàng)目應(yīng)包括：① 標(biāo)記效率檢測(cè)；② 毒性檢測(cè)：形態(tài)、活率、凋亡、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、增殖、生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期等；③ 功能學(xué)檢測(cè)：表面標(biāo)志物、分化潛能、集落形成能力、遷徙能力、免疫調(diào)節(jié)和基因芯片檢測(cè)等；④ 動(dòng)物體內(nèi)安全性檢測(cè)：致瘤性、炎癥反應(yīng)和致死性等；⑤ MRI可視化：細(xì)胞水平以及動(dòng)物體內(nèi)可成像性。

目前不同的研究小組[40]已經(jīng)證實(shí)了不同的SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞在體外和體內(nèi)的MRI特性，然而，鐵標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的毒性和生物學(xué)功能影響存在爭(zhēng)議，一些研究小組報(bào)告了變化，而有些文獻(xiàn)則沒(méi)有觀察到任何統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，強(qiáng)調(diào)了每種標(biāo)記方法綜合評(píng)估的重要性。例如，有文獻(xiàn)報(bào)道Ferucarbotran標(biāo)記干細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞遷移能力[55]，而有的數(shù)據(jù)[74]卻顯示不影響；對(duì)于成脂和成骨分化潛能，有文獻(xiàn)表明沒(méi)有影響[70]，有的則報(bào)道對(duì)成骨分化潛能呈現(xiàn)劑量依賴性抑制，高濃度下成骨分化能力消失[80]。Gu研究組[81]用合成的SPIONs標(biāo)記人骨髓MSCs細(xì)胞，研究表明其通過(guò)激活經(jīng)典MAPK通路調(diào)控的分子機(jī)制促進(jìn)人骨髓MSCs成骨分化。在大多數(shù)研究中，SPIONs不會(huì)影響脂肪和神經(jīng)原性分化[70,82]；表型也不發(fā)生改變[74]。詳細(xì)內(nèi)容總結(jié)于表2。

目前為止，還沒(méi)有一份特定MRI造影劑標(biāo)記干細(xì)胞后的系統(tǒng)而全面的安全評(píng)價(jià)報(bào)告或指導(dǎo)性的文件。但是縱觀文獻(xiàn)，SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞在一定的濃度范圍和孵育時(shí)間內(nèi)基本是安全的，具有臨床應(yīng)用可行性。因此，前期有些研究小組雖未經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的安全評(píng)價(jià)體系，也已經(jīng)應(yīng)用在臨床病人體內(nèi)。

3.3 SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的臨床研究和體內(nèi)示蹤

2006年，第一篇報(bào)道SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的文章發(fā)表在NewEnglandJournalofMedicine雜志上[96]。研究人員從一名34歲患者暴露的神經(jīng)組織(腦損傷區(qū)域)分離出自體神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)，后利用Feridex IV4(FDA批準(zhǔn)的造影劑，2008年撤市)和Effectene(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑)復(fù)合物標(biāo)記，再將這些標(biāo)記后的細(xì)胞再次植入患者腦損傷區(qū)域周圍。術(shù)后第24 h及每周進(jìn)行MRI，共十周。植入后第一天，細(xì)胞移植的部位見(jiàn)圓形的暗組織區(qū)域；植入后第一周，信號(hào)的變化與細(xì)胞積聚和病變周圍細(xì)胞的增殖一致，第二和第三周病變周圍信號(hào)增強(qiáng)。第四周，NSCs已經(jīng)從注射的主要部位逐漸遷移到損傷組織邊界，7周后無(wú)信號(hào)。作者推測(cè)無(wú)信號(hào)的原因是細(xì)胞增殖及移植細(xì)胞向受損組織的邊緣遷移引起的信號(hào)稀釋。這項(xiàng)涉及兩名患者的初步臨床研究，證明了SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞移植的安全性以及MRI非侵入性檢測(cè)干細(xì)胞的移植和遷移的可行性，與動(dòng)物模型中的臨床前數(shù)據(jù)一致。

2010年Karussis等進(jìn)行了一項(xiàng)臨床研究[97]，項(xiàng)目注冊(cè)號(hào)是NCT00781872，目的是評(píng)估自體骨髓MSCs在多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者中的可行性、安全性和免疫學(xué)作用。研究中涉及MS與ALS(脊髓)患者9例，將自體骨髓來(lái)源MSCs與Ferumoxide共孵育后，采用殼內(nèi)注射與靜脈注射量為2∶1的方式移植標(biāo)記干細(xì)胞。移植后第4～48 h、1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月分別進(jìn)行MRI成像，患者隨訪至25個(gè)月。T2加權(quán)圖像結(jié)果表明，MSCs從腰椎(移植部位)向髓膜、脊神經(jīng)根和脊髓組織遷移。隨訪期間沒(méi)有發(fā)生不良反應(yīng)。

2010年Jozwiak等在CellMedicine雜志發(fā)表論文[98]，研究中采用PLL修飾的Ferumoxide復(fù)合物，標(biāo)記自體臍帶血來(lái)源神經(jīng)祖細(xì)胞，48 h后移植到發(fā)生缺血性腦損傷后7個(gè)月的16個(gè)月大的嬰兒腦室內(nèi)，每個(gè)月連續(xù)注射3次細(xì)胞至大腦的側(cè)腦室中。移植后第1天、1周、1月、2月和4月后進(jìn)行MRI成像，結(jié)果顯示移植后4個(gè)月內(nèi)細(xì)胞沿著側(cè)腦室壁排列，沒(méi)有進(jìn)入腦組織，隨訪到第6個(gè)月，神經(jīng)狀況略有改善，證明腦室內(nèi)移植細(xì)胞是可行的，并且是耐受和安全的。

2014年，Janowski等在PLoSOne雜志發(fā)表文章[99]，他們同樣采用PLL修飾的Ferumoxide復(fù)合物，標(biāo)記自體臍帶血來(lái)源神經(jīng)祖細(xì)胞，48 h后移植到嚴(yán)重腦缺血的18個(gè)月大的嬰兒側(cè)腦室前額角，腦室內(nèi)注射約107個(gè)細(xì)胞。移植后第1天、1周、1月、2月、4月和33個(gè)月進(jìn)行MRI成像，并在體外開(kāi)發(fā)重力驅(qū)動(dòng)的沉降測(cè)定和吸引細(xì)胞的磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)。移植后24 h，MRI檢測(cè)到側(cè)腦室枕角中低信號(hào)的細(xì)胞，并且觀察到標(biāo)記細(xì)胞可隨著外加磁場(chǎng)方向遷移，在整個(gè)成像周期內(nèi)信號(hào)降低，第33個(gè)月時(shí)檢測(cè)不到信號(hào)。臨床數(shù)據(jù)表明，MRI成像可以檢測(cè)到側(cè)腦室內(nèi)SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞。

表2 臨床前研究中顯示的SPIONs標(biāo)記對(duì)干細(xì)胞的影響Table 2 The effects of SPIONs labeling on stem cells in preclinical studies

Notes：H，human，人類；NM，not mentioned，未檢測(cè)；HUCB-MSCs，人臍帶血造血干細(xì)胞；Fe-Pro：Ferumoxytol-Protamin complex，F(xiàn)erumoxytol-硫酸魚精蛋白復(fù)合物；Cho：chondrogenic differentiation，成軟骨分化潛能；BM-MSC：bone marrow MSC骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；Adi:adipogenesis differentiation，成脂分化潛能；HPF：肝素-魚精蛋白-Ferumoxytol復(fù)合物；Ost：osteogenic differentiation，成骨分化潛能；AEC:amniotic epithelial cells，羊膜干細(xì)胞；NPC：neural progenitor cells，神經(jīng)祖細(xì)胞；ADSC：adipose-derived stem cells，脂肪干細(xì)胞；CDCs：cardiosphere-derived stem cells，心臟球衍生的干細(xì)胞；PLL:poly-L-lysine,多聚賴氨酸；HEDP：1-Hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid羥基乙叉二膦酸；HNSCs:human neural stem cells，人神經(jīng)干細(xì)胞；PLLA：poly(L-lactic acid)，聚(L-丙交酯)。

4 結(jié) 語(yǔ)

本文介紹了基于SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞示蹤的臨床轉(zhuǎn)化相關(guān)研究進(jìn)展，包括SPIONs的合成方法、批準(zhǔn)用于臨床的SPIONs的發(fā)展歷程、SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的方法、標(biāo)記后干細(xì)胞的安全評(píng)價(jià)以及目前已報(bào)道的干細(xì)胞示蹤的臨床試驗(yàn)。SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的流程見(jiàn)圖2。MRI示蹤成像SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞具有堅(jiān)實(shí)的臨床前研究基礎(chǔ)，臨床前細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)、動(dòng)物水平示蹤以及目前已開(kāi)展的臨床試驗(yàn)的初步結(jié)果顯示，SPIONs示蹤干細(xì)胞是一項(xiàng)非常有前途的技術(shù)并且值得臨床轉(zhuǎn)化，將極大推動(dòng)移植干細(xì)胞在體內(nèi)生物分布和歸巢不明這一難題的解決。

然而，在臨床轉(zhuǎn)化的過(guò)程中依舊有很多問(wèn)題需要科學(xué)家們進(jìn)一步地探索和解決：(1)MRI信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞中的SPIONs量直接相關(guān)，移植到體內(nèi)的標(biāo)記干細(xì)胞可能會(huì)在體內(nèi)增殖以及被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，細(xì)胞內(nèi)氧化鐵納米顆粒可能會(huì)逐漸稀釋并在體內(nèi)生物降解，使得MRI檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而降低，這可能會(huì)限制MRI檢測(cè)干細(xì)胞的時(shí)間，并且出現(xiàn)假陽(yáng)性。未來(lái)的研究中，需要開(kāi)發(fā)新的SPIONs，進(jìn)一步建立符合良好生產(chǎn)規(guī)范(good manufacturing practices，GMP)、安全有效的干細(xì)胞標(biāo)記方案來(lái)克服這些問(wèn)題。(2)SPIONs標(biāo)記的干細(xì)胞檢測(cè)閾值受多種因素的影響，包括磁場(chǎng)強(qiáng)度、信噪比、脈沖序列、粒子類型和大小等。目前的MRI設(shè)備和成像序列，對(duì)SPIONs標(biāo)記細(xì)胞的定量是間接技術(shù)，信號(hào)變化反映的是磁性納米粒子的總體濃度，而不是實(shí)際的細(xì)胞總數(shù)。某些內(nèi)源性病癥導(dǎo)致的低MR信號(hào)可能與磁性造影劑的存在相混淆。例如：在梗死的心肌中通常有含鐵黃素的巨噬細(xì)胞，其低信號(hào)與標(biāo)記細(xì)胞沒(méi)有區(qū)別[100]。因此，開(kāi)發(fā)靈敏度更高的成像設(shè)備以及成像序列至關(guān)重要。

圖2 SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的流程示意圖 (Ⅰ：TA標(biāo)記法；Ⅱ：物理學(xué)標(biāo)記法；Ⅲ：蛋白質(zhì)電暈介導(dǎo)標(biāo)記法)Fig.2 Schematic diagram of clinical transformation of SPIONs labeling stem cells (Ⅰ:SPIONs/transfection agents complex method；Ⅱ:Physical labeling method；Ⅲ:Protein corona mediated labeling method)

用于標(biāo)記干細(xì)胞的理想MR對(duì)比劑最好符合以下條件：低毒性、生物相容性、穩(wěn)定對(duì)比度、高靈敏度(單細(xì)胞檢測(cè))、不隨著細(xì)胞增殖而稀釋，并且最小程度地向內(nèi)源宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移[55]。雖然目前可用的磁性納米顆粒不能同時(shí)滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，但可以通過(guò)MR的引導(dǎo)實(shí)時(shí)將干細(xì)胞遞送到患者體內(nèi)，確保干細(xì)胞的初始移植和分布在解剖學(xué)上是準(zhǔn)確的。干細(xì)胞的長(zhǎng)期示蹤，有待于開(kāi)發(fā)出SPIONs與MR特異性成像物質(zhì)相結(jié)合的材料，不僅可以觀察到移植細(xì)胞是否存活,而且信號(hào)不會(huì)隨著細(xì)胞分裂而稀釋。