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    NF-κB p65對(duì)OX-LDL處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性的影響及機(jī)制研究*

    2019-07-20 11:30:40劉潔羅展雄陳祖平
    關(guān)鍵詞:祖細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)皮

    劉潔,羅展雄,陳祖平

    (柳州市人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科,廣西 柳州 545004)

    心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命健康的主要原因之一,其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的基礎(chǔ)。內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,參與內(nèi)皮組織損傷修復(fù),其在骨髓、脾臟等多種器官中存在,內(nèi)皮祖細(xì)胞可以遷移到外周血并聚集到損傷血管周圍促進(jìn)損傷修復(fù)[1]。核轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的重要亞單位之一NF-κB p65,參與炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、氧化應(yīng)激等過程,在腫瘤、心血管等疾病中扮演重要角色[2]。最近研究顯示,內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷與NF-кB p65 過度表達(dá)有關(guān),在高糖、氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,OX-LDL)等誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中過度激活[3]。本實(shí)驗(yàn)以人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過microRNA 干擾技術(shù)下調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 的表達(dá),探討其在OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中的作用,為明確動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    健康人外周血來自柳州市人民醫(yī)院。SYBR premix Ex Taq 和Prime Script RT reagent kit 購自大連TaKaRa 公司,引物由生工生物(上海)股份有限公司合成,ECL 發(fā)光試劑盒、NF-кB p65 抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所,丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)活力檢測(cè)試劑盒均購自北京Solarbio 公司,活化的Caspase-3 抗體、活化的Caspase-9 抗體均購自美國Abcam 公司,OX-LDL 購自美國Sigma 公司。

    1.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)

    取健康人外周血,按照密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,按照5×105個(gè)/cm2接種細(xì)胞種植到纖維連接蛋白包被好的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每個(gè)孔中加入1 ml M199 細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中含有10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素、b-FGF 1 和50 ng/ml 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),放在飽和濕度、37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 d 以后更換細(xì)胞培養(yǎng)液,添加PBS 洗滌后,貼壁細(xì)胞用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD34、VEGFR-2 的陽性表達(dá)率均>90%,CD133 免疫熒光檢測(cè)其陽性率>95%,DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙染染色陽性率>90%,鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞[8]。

    1.3 OX-LDL 處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65表達(dá)水平

    取內(nèi)皮祖細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸浮液,分別用0 和10 mg/L[1]OX-LDL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 以后,記為Control 和OX-LDL,用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和Western blotting 檢測(cè)。

    1.3.1 qRT-PCR取內(nèi)皮祖細(xì)胞,用細(xì)胞總RNA 提取試劑盒分別提取內(nèi)皮祖細(xì)胞的RNA,步驟按照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)流程操作。檢測(cè)其OD 260/280 nm 的比值在1.8 ~2.0。用Prime Script RT reagent kit 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用SYBR premix Ex Taq 分析NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平,反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃預(yù)變性10 s,95℃退火10 s,60℃延伸30 s,共40 個(gè)循環(huán)。GAPDH作 為參 照,2-△△Ct法分 析NF-κB p65 mRNA 水 平。GAPDH 引物正向:5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-3',反向:5'-GAGCCCTTCCACGATGCCAA-3'。NF-κB p65 引物正向:5'-AAGATCAATGGCTCACAGG-3',反向:5'-CCTCAATGTCTTCTTTCTGA-3'。

    1.3.2 BCA 法蛋白定量取內(nèi)皮祖細(xì)胞,用移液槍小心將上清吸棄以后,用PBS 將各組細(xì)胞洗滌2 次,分別在細(xì)胞中添加適量的裂解液,將細(xì)胞放在冰上裂解反應(yīng)30 min,取細(xì)胞刮棒將各組細(xì)胞裂解液收集到離心管內(nèi),4℃高速離心以后,對(duì)蛋白進(jìn)行定量,具體步驟同BCA 蛋白定量試劑盒操作流程。按照每個(gè)上樣泳道中添加樣品40 μg,濃縮膠90 V 電壓電泳,分離膠120 V 電壓電泳。在200 mA 電流條件下把凝膠上蛋白電轉(zhuǎn)至NC 膜后,用封閉液(5%牛血清白蛋白)將非特異性的位點(diǎn)封閉以后,同NF-κB p65 一抗(1∶200 稀釋)置于4℃過夜反應(yīng),與HRP 標(biāo)記的二抗(1∶2 000 稀釋)結(jié)合2 h。按照增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光,用Image J 軟件以GAPDH 作為參照分析NF-κB p65 蛋白表達(dá)。

    1.4 慢病毒感染及細(xì)胞分組

    內(nèi)皮祖細(xì)胞分為4 組,分別為Control 組、OXLDL 組、siRNA control+OX-LDL 組、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組,Control 組和OX-LDL 組處理方法同1.3 部分。siRNA control+OX-LDL 組為感染siRNA Control 陰性對(duì)照慢病毒的內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)10 mg/L 的OX-LDL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,NF-κB p65 siRNA+ OX-LDL 組為感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒的內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)10 mg/L OX-LDL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。慢病毒由山東維真生物科技有限公司構(gòu)建,慢病毒感染方法簡述為:內(nèi)皮祖細(xì)胞密度生長為60%時(shí),將原細(xì)胞培養(yǎng)液吸棄,加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液,同時(shí)加入8 μg/ml 的聚凝胺,按照MOI 值為10 添加慢病毒顆粒,培養(yǎng)過夜以后,檢測(cè)GFP 熒光表達(dá)情況,感染效率高于90%。OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組、NFκB p65 siRNA+OX-LDL 組細(xì)胞用qRT-PCR 和Western blotting 檢測(cè)干擾效果,步驟同1.3 部分。

    1.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖

    內(nèi)皮祖細(xì)胞種植到96 孔培養(yǎng)板(提前用纖維連接蛋白包被)中,按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組處理培養(yǎng)。取出96 孔培養(yǎng)板,每孔加10 μl MTT,放在37℃靜置4 h。將孔內(nèi)的液體分別吸除掉后,加DMSO將結(jié)晶溶解,將酶標(biāo)儀調(diào)整到490 nm 波長處,檢測(cè)各孔的OD 值,用不添加細(xì)胞的孔調(diào)零以后,分析細(xì)胞存活率變化。

    1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

    按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL分組培養(yǎng)后,添加1×PBS 將各組內(nèi)皮祖細(xì)胞洗滌2 次。再加入0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞收集后,加入400 μl 緩沖液混合,分別添加Annexin V-FITC 約10 μl 和PI 約5 μl 至各組待測(cè)細(xì)胞中混合,避光反應(yīng)15 min。繼續(xù)加入100 μl 緩沖液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡水平。

    1.7 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞中活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平

    按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組培養(yǎng)后,檢測(cè)細(xì)胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)情況,步驟同1.3部分中Western blotting 操作。

    1.8 SOD 活力及MDA 含量檢測(cè)

    按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組培養(yǎng)后,收集細(xì)胞,把細(xì)胞裂解以后,檢測(cè)裂解液中SOD 活力及MDA 含量,步驟均參照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)流程。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 OX-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 的表達(dá)的影響

    內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)過OX-LDL 處理以后,細(xì)胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平均升高(P<0.05)。OX-LDL 可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 的表達(dá)。見表1 和圖1。

    表1 兩組NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)的比較 (±s)

    表1 兩組NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)的比較 (±s)

    注:?與Control 組比較,P<0.05

    組別 NF-κB p65 mRNA NF-κB p65 蛋白Control 組 1.000±0.113 0.170±0.022 OX-LDL 組 1.852±0.121? 0.302±0.053?t值 12.269 4.181P值 0.000 0.000

    圖1 OX-LDL 處理前后內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-кB p65 表達(dá)

    2.2 NF-κB p65 siRNA 對(duì)OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 表達(dá)的影響

    內(nèi)皮祖細(xì)胞感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒,經(jīng)過OX-LDL 處理以后,細(xì)胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平降低(P<0.05)。見表2 和圖2。

    2.3 敲低NF-κB p65 對(duì)OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性的影響

    OX-LDL 處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞增殖能力下降(P<0.05),敲低NF-κB p65 可以提高OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性。敲低NF-κB p65 具有拮抗OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖抑制作用。見表3。

    表2 各組NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較 (±s)

    表2 各組NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較 (±s)

    注:?與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較,P<0.05

    NF-κB p65 蛋白OX-LDL 組 1.000±0.000 0.279±0.016 siRNA control+OX-LDL 組 1.011±0.082 0.294±0.042 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 0.321±0.027? 0.110±0.031?F值 192.863 31.759P值 0.000 0.001組別 NF-κB p65 mRNA

    圖2 NF-κB p65 siRNA 對(duì)OX-LDL 條件下 內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 沉默效果

    2.4 敲低NF-κB p65 對(duì)OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響

    OX-LDL 處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡率升高,同時(shí)細(xì)胞中凋亡蛋白活化的Caspase-3、Caspase-9 水平也升高,敲低NF-кB p65 可以降低OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡水平并下調(diào)細(xì)胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白水平(P<0.05)。敲低NF-кB p65 具有拮抗OXLDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡作用。見圖3、4 和表4。

    表3 沉默NF-κB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的 內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率 (%,±s)

    表3 沉默NF-κB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的 內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率 (%,±s)

    注:1)與Control 組比較,P<0.05;2)與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較,P<0.05

    組別 存活率Control 組 100.000±9.021 OX-LDL 組 58.449±8.1371)siRNA control+OX-LDL 組 60.479±7.232 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 81.359±8.6892)F組 23.709P組 0.000

    2.5 敲低NF-κB p65 對(duì)OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷的影響

    OX-LDL 處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中抗氧化酶SOD 活性降低,MDA 含量升高,敲低NF-κB p65 能夠降低OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中MDA 含量,并提高SOD 活性(P<0.05)。敲低NF-κB p65具有拮抗OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。見表5。

    圖3 內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡

    圖4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡變化

    表4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平變化 (±s)

    表4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平變化 (±s)

    注:1)與Control 組比較,P<0.05;2)與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較,P<0.05

    組別 凋亡率/% 活化的Caspase-3 活化的Caspase-9 Control 組 8.561±1.522 0.237±0.043 0.281±0.052 OX-LDL 組 28.957±3.7431) 0.410±0.0591) 0.542±0.0811)siRNA control+OX-LDL 組 29.411±4.171 0.417±0.033 0.560±0.072 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 15.782±1.1622) 0.320±0.0212) 0.393±0.0522)F值 36.044 13.215 12.877P值 0.000 0.002 0.002

    表5 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量變化 (±s)

    表5 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量變化 (±s)

    注:1)與Control 組比較,P<0.05;2)與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較,P<0.05

    MDA 含量/(nmol/ml)組別 SOD 活性/(u/ml)Control 組 42.510±3.242 5.689±1.348 OX-LDL 組 9.892±1.1421) 14.581±1.7211)siRNA control+OX-LDL 組 10.210±1.262 14.821±1.958 NF-кB p65 siRNA+OX-LDL 組19.676±1.8722) 11.010±1.2312)F值 166.062 21.510P值 0.000 0.000

    3 討論

    近年來很多研究表明,在骨髓、臍帶血、外周血等中均有內(nèi)皮祖細(xì)胞存在,內(nèi)皮祖細(xì)胞作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,其以CD34、CD133、VEGFR-2 為標(biāo)志,能夠分化成為內(nèi)皮細(xì)胞,在血管新生及損傷修復(fù)中具有重要作用[4]。動(dòng)脈粥樣硬化是以血管內(nèi)皮損傷為主特征的心血管系統(tǒng)疾病,其發(fā)病機(jī)制與內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷密切相關(guān)[5]。OX-LDL 是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要誘導(dǎo)因子,也是內(nèi)皮功能障礙發(fā)生的原因之一,其可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷[6]。本研究表明,OX-LDL組處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性降低,細(xì)胞凋亡增多,提示成功構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷模型。

    NF-κB 在體內(nèi)的分布極為廣泛,是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,NF-κB 含有5 個(gè)成員,其中NF-κB p65 是重要的NF-κB 家族成員之一,其N 端含有Rel 同源區(qū),參與DNA 結(jié)合和二聚體的形成,另外,NF-κB p65 還含有1 個(gè)TAD 結(jié)構(gòu)域,具有正向調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用[7]。NF-κB p65 參與多種生理過程,包括細(xì)胞生長、凋亡、免疫反應(yīng)等,在內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等各種類型的細(xì)胞中均有表達(dá)[8]。目前研究表明,NF-κB p65 在動(dòng)脈粥樣硬化中過度激活,參與內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷發(fā)生,在銀杏內(nèi)酯B、Ang-1基因調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖中異常表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)表明,OX-LDL 處理可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 高表達(dá),敲低其表達(dá)后可以減少OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡,提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性,提示敲低NF-κB p65 在動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

    眾所周知,正常組織中細(xì)胞增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞過度增殖或者過度凋亡時(shí)都可以引起疾病的發(fā)生,內(nèi)皮祖細(xì)胞過度凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要機(jī)制之一[10]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)的Caspase 蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān),該級(jí)聯(lián)反應(yīng)幾乎參與所有細(xì)胞的凋亡過程,Caspase-9 是位于凋亡反應(yīng)上游的起始因子,Caspase-3 位于凋亡反應(yīng)的下游,兩者在活化后可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡發(fā)生的誘導(dǎo)因素之一,細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基可以促進(jìn)細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化,而細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基與細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD 活性降低有關(guān),MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物[11]。另外,內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷也是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)制之一。NF-кBp65具有促進(jìn)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞凋亡作用,在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮促進(jìn)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示,OX-LDL 條件下,敲低NF-κB p65 后的內(nèi)皮祖細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平降低,SOD 活性升高,MDA 含量降低,這可能表明敲低NFκB p65 通過降低OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激減少細(xì)胞凋亡。

    NF-κB p65 在內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中表達(dá)水平升高,敲低其表達(dá)可以減少內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性,敲低NF-κB p65 表達(dá)具有減輕動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷作用,這為研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制提供了基礎(chǔ),也為以后探討NF-κB p65 在內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),但對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制和作用機(jī)制尚不清楚,在以后的研究中將進(jìn)一步探討。

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    懸滴和懸浮法相結(jié)合培養(yǎng)胰腺祖細(xì)胞
    新鮮生雞蛋殼內(nèi)皮貼敷治療小面積燙傷
    微環(huán)境在體外大量擴(kuò)增晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞中的作用
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