• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    降鈣素相關(guān)基因肽在小鼠巨噬細(xì)胞炎癥調(diào)控中的作用研究

    2019-07-20 11:30:38肖美芳林樟萍陸喆劉乾坤
    關(guān)鍵詞:引物炎癥因子

    肖美芳,林樟萍,陸喆,劉乾坤

    (海南省婦幼保健院 檢驗(yàn)科,海南 ???570206)

    降鈣素相關(guān)基因肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是由感覺神經(jīng)元釋放的一種肽類物質(zhì)[1]。已有研究證實(shí)CGRP 具有顯著的抗炎效果[2-3],其通過抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖,并且抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子,從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4]。核苷酸結(jié)合低聚體結(jié)構(gòu)域樣受體3(nucleotides binding oligomer domain like receptors 3,NLRP3)作為炎癥反應(yīng)中的炎癥小體[5],主要在外周單核巨噬細(xì)胞和腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[6]。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)被認(rèn)為是最重要的激活炎癥小體NLRP3 的因素[7-8]。NLRP3 炎癥小體在ROS激活后能夠活化半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1),使炎癥因子成熟并釋放到胞外以發(fā)揮作用[9]。因此可推測CGRP 可能作為調(diào)控者通過ROS 使NLRP3 活性降低,從而減少局部炎癥反應(yīng)。基于此,本研究對(duì)該推測進(jìn)行驗(yàn)證。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

    大腸桿菌0111:B4 的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma 公司),CGRP(南京肽業(yè)生物科技有限公司),兔抗NLRP3、Caspase-1、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體(美國Santa 公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物科技有限公司),Trizol 試劑(美國Invitrogen 公司),Taq Man逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologies 公司),小鼠源性IL-1β 和TNF-α 的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢 測試劑盒(美國EXCEL 公司),實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒(美國Gene Copoeia 公司),Bio Rad IQTM 5 Multicolor 實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)(美國Bio Rad 公司),紫外可見分光光度計(jì)(美國Thermo 公司,型號(hào)Nanodrop 2000),Multiskan MK 3 酶標(biāo)儀(美國Thermo),F(xiàn)ACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD),倒置熒光顯微鏡Nikon IX71,Image-Pro Plus 7.0 成像系統(tǒng)(日本Olympus 公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理方法

    RAW264.7 巨噬細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫),所用培養(yǎng)液為含10% FBS(杭州四季青生物材料有限公司),含100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的雙抗α-MEM 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司),于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度為80%~90%時(shí)換1 次液,此時(shí)顯微鏡下觀察到巨噬細(xì)胞生長形態(tài)正常,呈梭形,半貼壁生長(見圖1)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、脂多糖(LPS)100 ng/ml 組(LPS 組)、CGRP 10 ng/ml組(CGRP 10組)、CGPR 30 ng/ml組(CGRP 30 組)、CGRP 100 ng/ml 組(CGRP 100 組)和CGRP 30 ng/ml+LPS 100 ng/ml 組(CGRP 30+LPS 組),加LPS或CGRP 處理前將FBS 含量降至0.5%。每組設(shè)3 個(gè) 平行樣,重復(fù)3 次。RAW264.7 巨噬細(xì)胞以5×104個(gè)/ml,接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中(總體積為10 ml),培養(yǎng)24 h,經(jīng)LPS 和CGRP 刺激后,收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 RNA 提取和qRT-PCR 檢測

    各加100 μl Trizol 裂解液到6 孔板中,常溫靜置后加入氯仿140 ml,劇烈搖晃15 s,12 000 r/min 低溫離心15 min,。取上層液體置于干凈EP 管中,加入異丙醇,混勻后室溫放置10 min。繼以轉(zhuǎn)速7 500 r/min,4℃離心5 min 去上清。采用1 ml 75%乙醇洗滌沉淀,干燥后溶于30 μl 無酶水,檢測RNA 濃度,剩余RNA 放入冰箱保存?zhèn)溆?。采用紫外可見分光光度?jì)測定A260/A280 比值,當(dāng)比值在1.8 ~2.0 時(shí)表示所提取的RNA 可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以提取的細(xì)胞總RNA 為模板,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,以cDNA 為模板,根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫應(yīng)用引物表達(dá)-2 軟件設(shè)計(jì)引物序列,CGRP(M34090)正向引物:5'-GAGGCAGCTA CAAGGTTCAGG-3',反向引物:5'-AGGTGTTGGTGCT GGACACA-3'。管家基因GAPDH為內(nèi)參,正向引物:5'- GGCCTTCCGTGTC-CTACC-3',反向引物:5'-CGGCAT GTCAGATCCACAAC-3'。PCR 反應(yīng)體系10 μl,反 應(yīng)條件:50℃預(yù)變性3 min,95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s,共循環(huán)40 次,反應(yīng)結(jié)束后采用分離曲線法確定反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用實(shí)時(shí)定量PCR 循環(huán)閾值Ct(cycle threshold,Ct)比較法,以管家基因GAPDH 的CT 為內(nèi)參,mRNA 相對(duì)表達(dá)量為同一個(gè)樣本CGRP mRNA 的Ct 值與GAPDH mRNA 的Ct 值之比。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)檢測并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所有引物均由美國Invitrogen 公司合成,其中GAPDH 為內(nèi)參,2-ΔΔCt用于計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,ΔΔCt=(Ct基因-CtGAPDH)目的基因-(Ct基因- CtGAPDH)內(nèi)參基因。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔,反應(yīng)體系為20 μl。

    1.4 ELISA 檢測

    收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,根據(jù)ELISA 檢測試劑盒的說明書檢測上清液中IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)。按說明書的要求準(zhǔn)備樣品并將其加入試劑盒配套的96 孔板中,隨后加IL-1β 和TNF-α 抗體孵育。用洗滌液洗凈,加顯色底物及酶結(jié)合工作液、加終止液并混勻。最后在酶標(biāo)儀上檢測450 nm 處的吸光度值并記錄。據(jù)此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算并記錄樣品中IL-1β 和TNF-α 的濃度。

    1.5 蛋白提取和Western blotting

    提取各組細(xì)胞總蛋白,采用PBS 緩沖液沖洗2 次,加入1 ml RIPA 蛋白裂解液,充分接觸后刮下細(xì)胞,搖動(dòng)30 min 使細(xì)胞完全裂解,12 000 r/min 離心5 min后收集上清液,BCA 法檢測各組細(xì)胞的蛋白濃度。分別取30 μg 樣本進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳實(shí)驗(yàn),將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,5% BSA 室溫封閉1 ~2 h,加入1∶10 000 的兔抗人NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TNF-α 及1∶1 000 兔抗人β-actin 抗體,TBST 洗膜3 次,每次10 min,加入1∶1 000 的羊抗兔二抗,室溫孵育1 h。加入ECL 發(fā)光劑后保存條帶圖片。以目的蛋白條帶的灰度值和內(nèi)參β-actin 蛋白條帶的灰度值比值來確定目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

    1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS 水平

    將RAW264.7 巨噬細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,按實(shí)驗(yàn)分組分別給予不同濃度的CGRP 或LPS 處理。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后去除培養(yǎng)基,消化離心收集細(xì)胞放入EP 管,PBS 洗1 次,用無血清培養(yǎng)液按1 000∶1 配制DCFH-DA,每個(gè)樣本加1 ml 工作液重懸。將EP 管放入培養(yǎng)箱,孵育30 min,每隔3 ~5 min 顛倒混勻1 次,離心收集細(xì)胞,PBS 洗3 次,棄上清,1 ml PBS 重懸后上機(jī)檢測(美國FACScan 公司,BD)(激發(fā)光為氬離子激光,488 nm)。最后在流式細(xì)胞儀檢測、FlowJo 軟件(Tree Star)分析并繪制曲線。各組所檢測的活細(xì)胞數(shù)均≥×104個(gè)。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,均通過正態(tài)性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 的表達(dá)水平比較

    6 組IL-1β、TNF-α、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.649、11.439 和17.502,均P=0.000)。與對(duì)照組比較,LPS 組IL-1β、TNF-α、NLRP3 mRNA 的表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.675、2.631 和3.121,P=0.001、0.022 和0.009);與LPS 組比較,CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組 的IL-1β、TNF-α 和NLRP3 的mRNA 表達(dá)水平均降低(IL-1β:t=8.483、10.591、7.363 和6.335,均P=0.000;TNF-α:t=4.369、6.767、5.726 和3.955,P=0.001、0.000、0.000 和0.002;NLRP3:t=6.374、8.640、5.546和4.335,P=0.000、0.000、0.000 和0.001),且CGRP 30 組最低。見表1 和圖2。

    2.2 各組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平比較

    6 組IL-1β 和TNF-α蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.564 和30.796,均P=0.000)。LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.351 和7.886,均P=0.000),LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平升高。CGRP10 組、CGRP30 組、CGRP100 組、CGRP30+LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平與LPS 組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-1β:t=6.464、7.172、5.495 和2.642,P=0.000、0.000、0.000 和0.021;TNF-α:t=9.563、10.542、8.133 和4.315,P=0.000、0.000、0.000 和0.001),CGRP10 組、CGRP30 組、CGRP100 組、CGRP30+LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平均降低,且CGRP30 組最低。見表2 和圖3。

    表1 各組IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表達(dá)水平的比較 (±s)

    表1 各組IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表達(dá)水平的比較 (±s)

    注:1)與對(duì)照組比較,P<0.05;2)與LPS 組比較,P<0.05

    組別 IL-1β TNF-α NLRP3對(duì)照組 1.00±0.15 1.01±0.29 1.00±0.20 LPS 組 1.62±0.321) 1.46±0.191) 1.29±0.051)CGRP10 組 0.50±0.102) 0.71±0.252) 0.71±0.052)CGRP30 組 0.22±0.052) 0.30±0.242) 0.50±0.142)CGRP100 組 0.65±0.112) 0.48±0.102) 0.78±0.012)CGRP30+LPS 組 0.78±0.102) 0.78±0.112) 0.89±0.102)F值 26.649 11.439 17.502P值 0.000 0.000 0.000

    圖2 CGRP 對(duì)細(xì)胞中IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表達(dá)水平的影響 (±s)

    表2 各組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平的比較 (±s)

    表2 各組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平的比較 (±s)

    注:1)與對(duì)照組比較,P<0.05;2)與LPS 組比較,P<0.05

    組別 IL-1β TNF-α對(duì)照組 389.82±157.83 384.29±132.61 LPS 組 812.98±51.011) 811.61±32.111)CGRP10 組 300.76±95.102) 294.77±59.862)CGRP30 組 241.40±83.732) 240.76±30.522)CGRP100 組 375.29±97.382) 369.85±59.272)CGRP30+LPS 組 606.46±73.052) 581±24.312)F值 14.564 30.796P值 0.000 0.000

    圖3 CGRP 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 和TNF-α 蛋白 表達(dá)水平的影響 (±s)

    2.3 各組細(xì)胞的ROS 水平比較

    6 組ROS 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.623,P=0.000)。LPS 組ROS 水平與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.368,P=0.000),LPS 組ROS水平升高。CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組ROS 水平與LPS 組比較,差異均 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.496、14.197、6.741 和5.593,均P=0.000),CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組ROS 水平均降低,且CGRP30 組最低。見表3 和圖4。

    2.4 各組ROS-NLRP3 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

    6 組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.374、62.779、127.711 和114.531,均P=0.000)。與對(duì)照組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平比較,LPS 組的NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水平均升高(t=13.557、13.815、23.863 和18.779,均P=0.000),與LPS 組比較,CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組的 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達(dá)水 平均降低(NLRP3:t=9.164、14.692、12.729 和11.964,均P=0.000;Caspase-1:t=10.047、15.045、13.952 和12.454,均P=0.000;IL-1β:t=10.173、14.920、9.185 和7.321,均P=0.000;TNF-α:t=10.958、19.548、18.140 和17.222,均P=0.000),且CGRP30 組最低。見表4 和圖5。

    表3 各組ROS 水平的比較 (%,±s)

    表3 各組ROS 水平的比較 (%,±s)

    注:1)與對(duì)照組比較,P<0.05;2)與LPS 組比較,P<0.05

    組別 ROS對(duì)照組 33.24±1.81 LPS 組 37.80±1.991)CGRP10 組 21.91±2.932)CGRP30 組 11.25±1.982)CGRP100 組 25.19±3.242)CGRP30+LPS 組 27.34±1.132)F值 52.623P值 0.000

    圖4 CGRP 對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

    表4 各組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平的比較 (±s)

    表4 各組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平的比較 (±s)

    注:1)與對(duì)照組比較,P<0.05;2)與LPS 組比較,P<0.05

    組別 NLPR3 Caspase-1 IL-1β TNF-α對(duì)照組 0.62±0.10 0.90±0.08 0.61±0.15 0.41±0.12 LPS 組 2.12±0.201) 2.00±0.121) 3.21±0.081)3.03±0.291)CGRP10 組 1.10±0.152) 1.20±0.092) 2.10±0.142)1.50±0.222)CGRP30 組 0.50±0.082) 0.81±0.122) 1.58±0.192)0.30±0.082)CGRP100 組 0.71±0.152) 0.89±0.082) 2.21±0.122)0.50±0.112)CGRP30+ LPS 組 0.80±0.082) 1.01±0.082) 2.41±0.082)0.63±0.102)F值 58.374 62.779 127.711 114.531P值 0.000 0.000 0.000 0.000

    圖5 細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白的表達(dá)

    3 討論

    炎癥反應(yīng)常常是由抗原或異物的入侵、感染等引起的,該過程中會(huì)釋放多種生物活性物質(zhì)[10]。腦損傷時(shí)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞常在發(fā)生損傷的部位聚集,另外血漿蛋白也會(huì)在損傷部位產(chǎn)生免疫反應(yīng)[11]。炎癥反應(yīng)也可引發(fā)多種包括無病原體感染的肥胖、心血管疾病、糖尿病或癌癥等。炎癥反應(yīng)可產(chǎn)生于機(jī)體各組織、器官的常見臨床病理過程,是機(jī)體與致炎因子進(jìn)行抗?fàn)幍囊?guī)律反應(yīng)[12]。以炎癥反應(yīng)常發(fā)生的骨折愈合過程為例,在骨折愈合的血腫機(jī)化期,大量炎癥細(xì)胞浸潤,開始吞噬和清除壞死組織,同時(shí)骨折處的骨外膜增殖分化成骨細(xì)胞使血腫機(jī)化[13]。巨噬細(xì)胞是主要免疫細(xì)胞之一,NLRP3 是感官病原體和危險(xiǎn)信號(hào)的多蛋白復(fù)合物。免疫細(xì)胞中的NLRP3 活化可激活Caspase-1,進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-1β 和TNF-α 等下游炎癥因子的加工與釋放。而T 細(xì)胞、NF-κB 和MAPK等信號(hào)通路均可被成熟的IL-1β 活化,啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答,從而清除病原體。即在宿主先天性免疫反應(yīng)中NLRP3 活化發(fā)揮極其重要的作用[14-15]。

    NLRP3 炎癥復(fù)合體能被多種激活劑激活,而活性氧ROS 則是激活NLRP3的關(guān)鍵。已有研究表明線粒體內(nèi)ROS 是調(diào)控NLRP3 活化的關(guān)鍵,ROS 生成過程若發(fā)生自吞噬抑制,則NLRP3 激活被抑制,自吞噬過程被抑制或發(fā)生障礙則NLRP3 被激活。此外,炎癥細(xì)胞同時(shí)分泌大量的細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-β 等,刺激成纖維細(xì)胞增殖分化、膠原蛋白及血管生成[16]。而促炎因子如IL-1β、TNF-α 的過表達(dá)可顯著延長炎癥期及創(chuàng)面愈合的時(shí)間[17]。因此尋找抑制ROS-NLRP3 通路的分子將可能抑制促炎因子IL-1β 和TNF-α 等的釋放,從而為臨床各種炎癥反應(yīng)的治療提供新的思路。

    CGRP 為典型的神經(jīng)肽類,在加速骨折愈合中扮演著關(guān)鍵的角色,其對(duì)骨細(xì)胞有促進(jìn)作用[18]。本研究分別以不同濃度的CGRP 處理小鼠來源的巨噬細(xì)胞RAW264.7,檢測CGRP 對(duì)NLRP3 炎癥復(fù)合體及其下游通路相關(guān)的炎癥因子活化的影響。通過與對(duì)照組或LPS 組的比較,反映出細(xì)胞或培養(yǎng)上清中NLRP3、IL-1β、TNF-α 或ROS 水平的變化,驗(yàn)證CGRP 可抑制細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞上清中炎癥復(fù)合體NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平,以及抑制ROS-NLRP3 通路下游相關(guān)的炎癥因子或蛋白IL-1β、TNF-α 和Caspase-1的mRNA 和蛋白表達(dá),且參與抑制細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的變化過程。以上研究結(jié)果與AUBDOOL[19]和李翔等[20]的研究相一致,即巨噬細(xì)胞中CGRP 也可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS 使NLRP3 的活性降低,從而使ROS-NLRP3信號(hào)通路下游的IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子的釋放減少,下游通路相關(guān)蛋白Caspase-1 的表達(dá)降低,從而可能在減少局部炎癥反應(yīng)中起到重要作用。

    綜上所述,本研究初步闡明CGRP 對(duì)NLRP3 炎癥小體及下游炎癥因子激活的調(diào)節(jié)作用,該研究可能為如何減少炎癥反應(yīng)(如加快骨折愈合、傷口愈合等)提供新的臨床治療思路。

    猜你喜歡
    引物炎癥因子
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    因子von Neumann代數(shù)上的非線性ξ-Jordan*-三重可導(dǎo)映射
    脯氨酰順反異構(gòu)酶Pin 1和免疫炎癥
    歡迎訂閱《感染、炎癥、修復(fù)》雜志
    一些關(guān)于無窮多個(gè)素因子的問題
    影響因子
    影響因子
    歡迎訂閱《感染、炎癥、修復(fù)》雜志
    伦理电影免费视频| 午夜免费成人在线视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美乱妇无乱码| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 悠悠久久av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲av熟女| 久久欧美精品欧美久久欧美| av免费在线观看网站| 久久人人精品亚洲av| 免费高清视频大片| 麻豆国产av国片精品| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久精品国产清高在天天线| 99riav亚洲国产免费| 欧美一级毛片孕妇| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲五月天丁香| 两性夫妻黄色片| 成人18禁在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 丁香欧美五月| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 男女午夜视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 国内揄拍国产精品人妻在线 | 亚洲午夜理论影院| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 一本大道久久a久久精品| www.自偷自拍.com| 视频区欧美日本亚洲| 欧美成狂野欧美在线观看| 级片在线观看| 欧美日韩黄片免| 亚洲激情在线av| 久久亚洲真实| 韩国精品一区二区三区| 国产av不卡久久| 大香蕉久久成人网| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产v大片淫在线免费观看| netflix在线观看网站| 男人舔女人的私密视频| 久久中文字幕一级| 国产激情久久老熟女| 岛国在线观看网站| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| www国产在线视频色| av福利片在线| 男男h啪啪无遮挡| 午夜福利高清视频| 亚洲无线在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 国产精品综合久久久久久久免费| 岛国在线观看网站| 日本成人三级电影网站| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲电影在线观看av| 色老头精品视频在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利高清视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲精品在线观看二区| 黄色 视频免费看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成人av一区二区三区在线看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品久久久久久精品电影 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 嫁个100分男人电影在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 露出奶头的视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 99热这里只有精品一区 | 老司机靠b影院| 黄色 视频免费看| av中文乱码字幕在线| 久久99热这里只有精品18| 一二三四社区在线视频社区8| 极品教师在线免费播放| 亚洲免费av在线视频| 中文字幕av电影在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品二区激情视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲真实伦在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲,欧美精品.| 国产成年人精品一区二区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av成人av| 丰满的人妻完整版| 久久久久久久午夜电影| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| av中文乱码字幕在线| 亚洲国产看品久久| 欧美乱色亚洲激情| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 白带黄色成豆腐渣| 中文资源天堂在线| 国产激情欧美一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 白带黄色成豆腐渣| 在线观看www视频免费| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久精品人妻少妇| 波多野结衣av一区二区av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费在线观看日本一区| 黄片播放在线免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 搞女人的毛片| 欧美乱色亚洲激情| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲av电影不卡..在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 国产av不卡久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日韩免费av在线播放| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久人人精品亚洲av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 丝袜美腿诱惑在线| bbb黄色大片| 精品日产1卡2卡| 在线观看免费午夜福利视频| 又大又爽又粗| av中文乱码字幕在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 精品久久久久久成人av| 国产精品二区激情视频| 91九色精品人成在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品亚洲美女久久久| 91在线观看av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品久久久久久成人av| 色综合欧美亚洲国产小说| 首页视频小说图片口味搜索| 人人妻人人澡人人看| 观看免费一级毛片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| www.熟女人妻精品国产| 黄色丝袜av网址大全| 久久久国产成人精品二区| xxxwww97欧美| 老司机午夜十八禁免费视频| bbb黄色大片| 国产在线精品亚洲第一网站| 成人三级做爰电影| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲免费av在线视频| 亚洲免费av在线视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看免费午夜福利视频| 久久精品人妻少妇| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 老司机在亚洲福利影院| 欧美精品啪啪一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产免费男女视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 成人永久免费在线观看视频| 搞女人的毛片| 午夜福利欧美成人| 国产野战对白在线观看| 免费看a级黄色片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 美女大奶头视频| 99re在线观看精品视频| 美女午夜性视频免费| 一a级毛片在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 两个人免费观看高清视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| cao死你这个sao货| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲第一青青草原| 国产精品一区二区三区四区久久 | 日韩av在线大香蕉| 午夜福利在线观看吧| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 91麻豆av在线| www.熟女人妻精品国产| 国产在线精品亚洲第一网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品电影一区二区三区| 国产激情欧美一区二区| 亚洲国产欧美网| 国产伦一二天堂av在线观看| 中文资源天堂在线| 岛国在线观看网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日本免费一区二区三区高清不卡| 嫩草影视91久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产在线观看jvid| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品一区二区三区四区久久 | 俺也久久电影网| 制服诱惑二区| 99热6这里只有精品| 国产亚洲欧美98| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品第一国产精品| 国产成人av激情在线播放| 国产精品野战在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 2021天堂中文幕一二区在线观 | 韩国av一区二区三区四区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲精品在线美女| 自线自在国产av| 搡老岳熟女国产| 精品乱码久久久久久99久播| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美日韩乱码在线| 国产精品 国内视频| 首页视频小说图片口味搜索| 成年免费大片在线观看| svipshipincom国产片| 人人澡人人妻人| 真人做人爱边吃奶动态| 99国产精品一区二区三区| 一级a爱视频在线免费观看| 国产高清激情床上av| 十八禁网站免费在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲av第一区精品v没综合| 嫁个100分男人电影在线观看| 一进一出抽搐动态| 久久草成人影院| 久久热在线av| 在线观看舔阴道视频| 又紧又爽又黄一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲,欧美精品.| 听说在线观看完整版免费高清| 成人午夜高清在线视频 | 午夜激情av网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 91国产中文字幕| 亚洲欧美激情综合另类| svipshipincom国产片| 国产精品野战在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| www.www免费av| x7x7x7水蜜桃| 国产精品 欧美亚洲| 窝窝影院91人妻| 成年版毛片免费区| 好男人电影高清在线观看| 久热这里只有精品99| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲国产欧美一区二区综合| 男女那种视频在线观看| 在线播放国产精品三级| 久久 成人 亚洲| 成人国产综合亚洲| 91字幕亚洲| 久热这里只有精品99| 淫秽高清视频在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲熟女毛片儿| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 亚洲男人的天堂狠狠| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日本免费a在线| 首页视频小说图片口味搜索| 国产亚洲精品一区二区www| 老汉色∧v一级毛片| 男女之事视频高清在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲专区国产一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 一级作爱视频免费观看| 久久热在线av| 中文字幕久久专区| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 亚洲精品久久国产高清桃花| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久青草综合色| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲国产精品999在线| 国产午夜精品久久久久久| 级片在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品国内亚洲2022精品成人| 黑人操中国人逼视频| 久久香蕉精品热| 国产不卡一卡二| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美日韩一级在线毛片| 久久伊人香网站| 不卡av一区二区三区| 久久久久久大精品| 中亚洲国语对白在线视频| 十分钟在线观看高清视频www| 精品国产乱子伦一区二区三区| 成年版毛片免费区| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久久久大精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 级片在线观看| 精品福利观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲一区高清亚洲精品| 又黄又粗又硬又大视频| 看黄色毛片网站| 日韩欧美三级三区| 无人区码免费观看不卡| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产私拍福利视频在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲免费av在线视频| 亚洲av片天天在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99热只有精品国产| 久久精品91无色码中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 少妇被粗大的猛进出69影院| av视频在线观看入口| www国产在线视频色| 国产伦一二天堂av在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美性猛交黑人性爽| 在线观看免费午夜福利视频| 脱女人内裤的视频| 在线视频色国产色| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲五月婷婷丁香| 最新美女视频免费是黄的| 90打野战视频偷拍视频| 国产麻豆成人av免费视频| 国产1区2区3区精品| 日韩免费av在线播放| 国产三级黄色录像| 亚洲人成电影免费在线| 国产99白浆流出| 在线免费观看的www视频| a在线观看视频网站| 成人一区二区视频在线观看| 精品久久久久久成人av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品人妻1区二区| 国产精品精品国产色婷婷| av片东京热男人的天堂| 在线观看舔阴道视频| 村上凉子中文字幕在线| 免费观看人在逋| 免费在线观看日本一区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 1024香蕉在线观看| 大香蕉久久成人网| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线观看www视频免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 日韩高清综合在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 夜夜夜夜夜久久久久| 韩国av一区二区三区四区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日本五十路高清| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产av不卡久久| 人人妻人人澡人人看| 色综合婷婷激情| av中文乱码字幕在线| 国产黄色小视频在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 午夜激情av网站| 18禁国产床啪视频网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久香蕉精品热| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产色视频综合| 免费一级毛片在线播放高清视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品av久久久久免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 曰老女人黄片| 18禁国产床啪视频网站| 久久香蕉激情| 亚洲午夜理论影院| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成人午夜高清在线视频 | 国产精品影院久久| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩av在线大香蕉| 欧美乱色亚洲激情| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲国产精品久久男人天堂| 在线视频色国产色| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲最大成人中文| 女性生殖器流出的白浆| 久热爱精品视频在线9| 欧美大码av| 亚洲片人在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 老汉色∧v一级毛片| 1024视频免费在线观看| 搞女人的毛片| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人手机av| 国产乱人伦免费视频| 久久中文字幕人妻熟女| 麻豆一二三区av精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 男女午夜视频在线观看| 久99久视频精品免费| 亚洲精品国产区一区二| 久久亚洲真实| 亚洲专区国产一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 不卡av一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 波多野结衣巨乳人妻| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲在线自拍视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜影院日韩av| 美女高潮到喷水免费观看| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲五月色婷婷综合| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲av美国av| 欧美一级a爱片免费观看看 | 哪里可以看免费的av片| 亚洲人成网站高清观看| 国产av一区二区精品久久| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲人成伊人成综合网2020| 中文在线观看免费www的网站 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 啦啦啦 在线观看视频| 人妻久久中文字幕网| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲av熟女| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美黑人精品巨大| 无人区码免费观看不卡| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲无线在线观看| 伦理电影免费视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美激情高清一区二区三区| 精品第一国产精品| 亚洲av电影在线进入| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产成人欧美| 男女视频在线观看网站免费 | 九色国产91popny在线| 亚洲自拍偷在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 又黄又爽又免费观看的视频| 成人免费观看视频高清| 国产高清videossex| 午夜影院日韩av| 好男人在线观看高清免费视频 | 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产黄a三级三级三级人| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精华霜和精华液先用哪个| 免费在线观看黄色视频的| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 99国产综合亚洲精品| 国内精品久久久久精免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 99热只有精品国产| 午夜福利成人在线免费观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 人妻久久中文字幕网| 男人舔奶头视频| 香蕉国产在线看| 婷婷精品国产亚洲av| 国产高清有码在线观看视频 | 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美在线黄色| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产又爽黄色视频| 无人区码免费观看不卡| 波多野结衣高清无吗| 在线av久久热| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 一二三四在线观看免费中文在| 在线永久观看黄色视频| 色av中文字幕| 亚洲欧美日韩无卡精品| 很黄的视频免费| 97碰自拍视频| 99久久国产精品久久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品免费视频内射| 男女视频在线观看网站免费 | 天天一区二区日本电影三级| 香蕉丝袜av| 中文资源天堂在线| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 黄片小视频在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 香蕉av资源在线| 国产精品一区二区免费欧美| 国产91精品成人一区二区三区| 国产av一区在线观看免费| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产又爽黄色视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 啦啦啦免费观看视频1| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| www日本黄色视频网| 色av中文字幕| 午夜影院日韩av| 国产真实乱freesex| av免费在线观看网站| av免费在线观看网站| 男人舔女人的私密视频| 后天国语完整版免费观看| 久久国产精品影院| 满18在线观看网站| 美国免费a级毛片| 成人亚洲精品一区在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 在线永久观看黄色视频| 精品第一国产精品| 久久香蕉国产精品| 99国产精品一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 色综合婷婷激情| 国产一区二区激情短视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 丰满的人妻完整版| 国产精品久久电影中文字幕| 在线视频色国产色| 国产高清videossex| 妹子高潮喷水视频| 久久久久九九精品影院| 精品福利观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日韩国内少妇激情av| 男女之事视频高清在线观看| 国产免费男女视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 麻豆一二三区av精品| 国产精品九九99| 色综合婷婷激情| 制服丝袜大香蕉在线| 成年版毛片免费区| 99riav亚洲国产免费| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 波多野结衣av一区二区av| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品二区激情视频| 亚洲国产欧美网| 国产成人精品久久二区二区91|