MALDI-TOF MS在食品微生物中的應(yīng)用：數(shù)分鐘內(nèi)確認(rèn)和鑒定微生物

□Erin Crowley Q實(shí)驗(yàn)室

一系列的微生物都可能對食物造成污染，如細(xì)菌、酵母菌、霉菌和寄生蟲等。常見的食源性致病菌包括沙門氏菌屬、克羅諾桿菌屬、彎曲桿菌屬，以及單核細(xì)胞增生李斯特菌等。如未能及時(shí)檢測食品中的微生物含量，食源性致病菌將會(huì)通過受污染的食物進(jìn)行傳播擴(kuò)散，進(jìn)而爆發(fā)嚴(yán)重的疾病。通過監(jiān)測大腸桿菌、李斯特菌、酵母菌和霉菌等質(zhì)量指標(biāo)，可對食品工藝衛(wèi)生情況和質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。如今，用于識(shí)別食品中微生物的技術(shù)種類繁多，包括傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法、使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試驗(yàn)的分子檢測方法，以及日益復(fù)雜的分析技術(shù)，如質(zhì)譜法（MS）。然而，研究人員和測試制造商仍試圖尋找更為先進(jìn)的方法，希望以更高的準(zhǔn)確性和靈敏度進(jìn)行更快速的測試。

質(zhì)譜的發(fā)展

歷經(jīng)多年發(fā)展，食品工業(yè)已經(jīng)習(xí)慣于使用經(jīng)AOAC或ISO 16140認(rèn)可的快速檢測方法—這些定性或定量方法被食品安全管理機(jī)構(gòu)所接受，且區(qū)域法規(guī)也對其予以認(rèn)可，并鼓勵(lì)將它們應(yīng)用于各種各樣的食品。新技術(shù)的發(fā)展，如基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）飛行時(shí)間（TOF）質(zhì)譜或測序技術(shù)憑借其更快速、更可靠的結(jié)果被大范圍應(yīng)用，促使食品微生物檢測技術(shù)進(jìn)入新的紀(jì)元。

檢測時(shí)間的長短往往是考量食品微生物實(shí)驗(yàn)室合格與否的關(guān)鍵因素之一，因此，MALDI-TOF MS快速準(zhǔn)確地確認(rèn)與鑒定微生物的能力在常規(guī)測試中具有極高價(jià)值。對比研究表明，在準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌和真菌方面，MALDI-TOF MS（100%）與傳統(tǒng)鑒定板（94%～97%）存在差異—MALDI-TOF MS在速度及試劑成本方面擁有較大優(yōu)勢。

Q實(shí)驗(yàn)室（美國俄亥俄州辛辛那提市）自1966年就服務(wù)于食品、化妝品、制藥、保健美容和膳食補(bǔ)充劑行業(yè)，可以提供全面的微生物學(xué)、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室及研發(fā)服務(wù)。作為一家將先進(jìn)的技術(shù)與個(gè)人服務(wù)和關(guān)注相結(jié)合的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室，Q實(shí)驗(yàn)室致力于提供滿足所有測試和質(zhì)量保證需求的服務(wù)。近期，Q實(shí)驗(yàn)室的微生物食品實(shí)驗(yàn)室采用MALDI-TOF MS進(jìn)行日常食品微生物測試及研發(fā)（R&D）工作。微生物鑒定實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)的“工具箱”方法，其中包括標(biāo)準(zhǔn)的臺(tái)式培養(yǎng)法、自動(dòng)生化法、鏡檢和16S rDNA測序法等。近年來，行業(yè)對微生物鑒定技術(shù)的內(nèi)部審查及用戶對先進(jìn)替代方法的應(yīng)用需求不斷提升，促進(jìn)了采用MS進(jìn)行鑒定工作的推進(jìn)。由于實(shí)驗(yàn)室承接專家鑒定機(jī)構(gòu)外包業(yè)務(wù)，因此成立了技術(shù)進(jìn)步小組（TAG），專門負(fù)責(zé)審查當(dāng)前使用和未來將要實(shí)施的技術(shù)。

在這一行動(dòng)中，食品微生物學(xué)工作被劃分為兩部分，即常規(guī)測試與研發(fā)（R&D），前者由用戶提交樣品以確認(rèn)并鑒定食品中的微生物，后者則是對用戶希望推廣和銷售的診斷分析方法進(jìn)行驗(yàn)證以獲得認(rèn)證。

MALDI-TOF MS常規(guī)測試

2017年1月，微生物食品實(shí)驗(yàn)室將MALDI-TOF MS添加到其用于常規(guī)微生物鑒定與研發(fā)的工具箱中。該技術(shù)能夠獲得微生物的特征蛋白質(zhì)指紋圖譜，并將指紋圖譜與覆蓋面廣泛的數(shù)據(jù)庫中的數(shù)千個(gè)參考圖譜相匹配，從而準(zhǔn)確可靠地鑒定特定目標(biāo)微生物。此外，利用現(xiàn)有技術(shù)可對該工具箱進(jìn)行補(bǔ)充，例如，使用rDNA測序方法鑒定微生物序列。

MALDI-TOF MS技術(shù)使實(shí)驗(yàn)室能夠擁有靈活的周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）和成本選項(xiàng)，以適應(yīng)用戶的檢測需求。這樣一來，實(shí)驗(yàn)室就能進(jìn)行完全定制化的服務(wù)，如鑒于菌種快速鑒定的需要—有些工作需要當(dāng)天完成，MS技術(shù)可做到這一點(diǎn)，而傳統(tǒng)方法則無法實(shí)現(xiàn)。MALDI-TOF系統(tǒng)檢測結(jié)果更高的準(zhǔn)確性及更靈敏度意味著重復(fù)測試次數(shù)更少，因此在第一次得到鑒定結(jié)果時(shí)，用戶可當(dāng)即作出判定。

在發(fā)生病原菌污染的情況下，傳統(tǒng)的生化測試方法需要3～7天才能確定病原菌的種類與數(shù)量。如病原菌檢測結(jié)果預(yù)判為陽性，那么如何縮短確認(rèn)結(jié)果所需的時(shí)間將變得十分關(guān)鍵，MALDI-TOF MS可有效避免產(chǎn)品召回的延誤，并延緩感染性微生物的爆發(fā)。該技術(shù)可在30分鐘至2小時(shí)完成樣品分析，用于確認(rèn)某種替代方法的疑似結(jié)果，或從平板上直接鑒定微生物。

驗(yàn)證新的分析方法

常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測試樣品來自食品，而研發(fā)實(shí)驗(yàn)室測試的“樣品”則是技術(shù)本身。技術(shù)公司及診斷合作伙伴將新的技術(shù)或分析方法帶到Q實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證，包括沙門氏菌、李斯特菌或軍團(tuán)菌的檢測等，并要求對其工作提出建議。Q實(shí)驗(yàn)室的用戶和方法驗(yàn)證組織（如美國的AOAC INTERNATIONAL）制定了一種研究設(shè)計(jì)，其滿足AOAC附錄J指南要求—MicroVal和AFNOR認(rèn)證是歐洲的認(rèn)證機(jī)構(gòu)，采用的方法按ISO 16140標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估；“專家實(shí)驗(yàn)室”（Q實(shí)驗(yàn)室）與技術(shù)提供商合作制定方法、并將其提交到認(rèn)證機(jī)構(gòu)以供技術(shù)審核員批準(zhǔn)。Q實(shí)驗(yàn)室是北美唯一被 AOAC、MicroVal和AFNOR這3個(gè)主要認(rèn)證機(jī)構(gòu)認(rèn)可的專家實(shí)驗(yàn)室，這使AOAC/ISO聯(lián)合驗(yàn)證研究的設(shè)計(jì)，以及滿足所有用戶需求成為可能。

圖1 從MALDI Biotyper（MBT）獲得的圖譜示例

協(xié)作研究

在AOAC-OMA研究或ISO 16140驗(yàn)證研究中，需要選取一個(gè)領(lǐng)先的內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室（如微生物研發(fā)實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行對比協(xié)作研究，即對技術(shù)的重現(xiàn)性進(jìn)行測驗(yàn)，這就需要在全世界招募12～15個(gè)實(shí)驗(yàn)室同意自愿對收到的盲樣進(jìn)行測試。在這一項(xiàng)目中，所有實(shí)驗(yàn)室需在同一天使用相同的技術(shù)對樣品進(jìn)行評估，分析完成后，各實(shí)驗(yàn)室將數(shù)據(jù)提交給主導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后為用戶生成一份完整報(bào)告，并提交給認(rèn)證機(jī)構(gòu)。最后，由技術(shù)委員會(huì)進(jìn)行審查并在協(xié)商一致后批準(zhǔn)，此項(xiàng)批準(zhǔn)意味著該方法適用于預(yù)定目的并滿足驗(yàn)證要求。

Q實(shí)驗(yàn)室對Bruker的MALDI Biotyper（MBT）進(jìn)行了AOAC-OMA和ISO 16140的驗(yàn)證，并通過結(jié)合現(xiàn)行指南（AOAC附錄J指南與新的ISO 16140第6部分標(biāo)準(zhǔn)）創(chuàng)建了一個(gè)優(yōu)化研究設(shè)計(jì)以驗(yàn)證MBT在食品微生物分析中的應(yīng)用。由于對確認(rèn)與鑒定方法設(shè)計(jì)的驗(yàn)證尚未能夠跟上最新的技術(shù)發(fā)展，這一研究成為該領(lǐng)域的首個(gè)相關(guān)研究應(yīng)用。表1給出了提交AOAC-OMA和ISO 16140批準(zhǔn)的MBT合作研究的設(shè)計(jì)及結(jié)果匯總。

表1 提交AOAC-OMA和ISO 16140批準(zhǔn)的MALDI Biotyper協(xié)作研究的設(shè)計(jì)和結(jié)果匯總

Q實(shí)驗(yàn)室于2017年12月獲取了MBT的AOAC-OMA研究結(jié)果，成為兩項(xiàng)獨(dú)立研究的主導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室—第一種是確認(rèn)與鑒定沙門氏菌、克羅諾桿菌和其它革蘭氏陰性細(xì)菌；第二種為確認(rèn)與鑒定食品微生物中的單核細(xì)胞增生李斯特菌、李斯特菌屬和其它革蘭氏陽性細(xì)菌。作為MicroVal批準(zhǔn)的ISO 16140專家實(shí)驗(yàn)室，Q實(shí)驗(yàn)室在2018年初組織了首次研究，并獲得4項(xiàng)證書；2018年4月，其在斯德哥爾摩舉行的食品保護(hù)內(nèi)部協(xié)會(huì)（IAFP）活動(dòng)上，分別以海報(bào)和研討會(huì)的形式，與MicroVal技術(shù)委員會(huì)成員共同發(fā)布了該結(jié)果。

因持有AOAC官方分析方法，以及ISO驗(yàn)證/MicroVal認(rèn)證級別的認(rèn)證，MALDITOF MS方法被食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）接受并用于病原菌的確認(rèn)，符合歐洲法規(guī)EC 2073/2005。并且，F(xiàn)DA和歐洲法規(guī)都要求第三方認(rèn)證機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，并將其視為與其現(xiàn)有確認(rèn)/鑒定方法（被視為金標(biāo)準(zhǔn)）具有同等效力的替代方法。

微生物確認(rèn)與鑒定的未來

一直以來，質(zhì)譜法都是一種分析化學(xué)工具，其最近通過了AOAC-OMA和ISO 16140認(rèn)證，這證明了在微生物學(xué)家掌握下的MBT具有可靠性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。因此，將MALDITOF MS應(yīng)用到常規(guī)測試工作流程中可實(shí)現(xiàn)重大的資源整合，并將取代多種傳統(tǒng)的生化鑒定方法，進(jìn)而消除DNA測序中的大量步驟、及工作站計(jì)量要求帶來的負(fù)擔(dān)。在分析前，檢測人員無需知曉目標(biāo)微生物的類型，因?yàn)榧?xì)菌、酵母菌或霉菌都將按照相同的工作流程同時(shí)進(jìn)行分析。

由于用戶對食品和環(huán)境污染物的鑒定需求不斷上升，Q實(shí)驗(yàn)室正在擴(kuò)大其通過MALDI-TOF MS和rDNA測序提供的確認(rèn)與鑒定服務(wù)，并尋求增加其環(huán)境測試服務(wù)。對于一個(gè)分離的菌落，可在15分鐘內(nèi)獲得確認(rèn)/鑒定結(jié)果，而對于一整塊MALDI靶板樣品如95個(gè)樣品，僅需不到1小時(shí)即可獲得結(jié)果。當(dāng)時(shí)間對決策者至關(guān)重要時(shí)，擁有此技術(shù)可提高危機(jī)應(yīng)對能力。