混合質(zhì)控菌種盲樣的鑒定分析

□ 張春鵬 徐州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢驗(yàn)檢測中心

1 引言

微生物盲樣考核是對(duì)檢測人員技能、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和管理水平的檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室專業(yè)技術(shù)人員必須考慮實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑、診斷血清等因素，從接種、培養(yǎng)、分離鑒定等環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，減少主觀因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響，進(jìn)而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在實(shí)驗(yàn)評(píng)審過程中，特別是現(xiàn)場評(píng)審中，盲樣測試方式可以更直接地反映被評(píng)審實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和技術(shù)素質(zhì)的實(shí)際水平[1]。

2 材料與方法

2.1 微生物盲樣樣品

樣品為來自CMA評(píng)審專家提供的半固體1支，盲樣編號(hào)為MY-WJ-01。盲樣中有兩種或以上菌株，且為食品檢測中常見的致病菌，要求最終報(bào)告得出的結(jié)果是所有檢出菌種的名稱。

2.2 培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基和細(xì)菌生化鑒定管，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門氏菌診斷血清（60種），寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；以上試劑均在有效期內(nèi)。

2.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-4），北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-300BSH-II），上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；厭氧培養(yǎng)箱（DG250），英國DWS；顯微鏡（BX41），奧林巴斯；全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（VITEK2）并配套革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡，法國梅里埃；以上所有儀器設(shè)備檢定均在有限期內(nèi)。

2.4 檢測方法

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB 4789及CMA評(píng)審專家提供的《致病菌檢測作業(yè)指導(dǎo)書》。

3 結(jié)果與分析

3.1 增菌培養(yǎng)

挑取質(zhì)控樣接種到腦心浸出液肉湯（BHI）培養(yǎng)基中，接種兩瓶，分別放在生化培養(yǎng)箱和厭氧培養(yǎng)箱中以36℃培養(yǎng)24h，結(jié)果為兩瓶增菌液均混濁。

表1 在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

表2 在三糖鐵斜面上的生長情況和革蘭氏染色結(jié)果

3.2 劃線分離

用接種環(huán)從增菌液中挑取1環(huán)直接劃線接種到BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色瓊脂平板、MAC瓊脂平板、TCBS瓊脂平板、血瓊脂平板、Barid-Parker瓊脂平板、哥倫比亞CNA血瓊脂平板、MYP瓊脂平板、PALCAM瓊脂平板、李斯特氏菌顯色瓊脂平板、CT-SMAC瓊脂平板、大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板、阪崎腸桿菌顯色瓊脂平板、CN瓊脂平板，觀察菌落特征。在BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色瓊脂平板、血瓊脂平板和Barid-Parker瓊脂平板中發(fā)現(xiàn)2種不同的可疑菌落，分別編為1號(hào)菌和2號(hào)菌，菌落特征見表1。

3.3 生化試驗(yàn) [2]

挑取上述平板中的典型菌落接種到三糖鐵瓊脂斜面上，置36℃培養(yǎng)24h，觀察生化特征并涂片染色，結(jié)果見表2。

1號(hào)菌繼續(xù)做其它相關(guān)生化試驗(yàn)，結(jié)果符合沙門氏菌菌屬，結(jié)果見表3。然后，經(jīng)血清鑒定為鼠傷寒沙門氏菌（1,4,[5],12:i:1,2）。

3.4 血漿凝固酶試驗(yàn)[3]

挑取Baird-Parker平板上的可疑菌落，接種到5mL BHI中，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。取新鮮配制兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2～0.3mL，置于36℃±1℃培養(yǎng)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，同時(shí)作陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)物小試管中呈現(xiàn)凝塊，陰性對(duì)照未出現(xiàn)凝塊，因此可判定結(jié)果為陽性，故2號(hào)菌可判定為金黃色葡萄球菌。

3.5 全自動(dòng)微生物生化鑒定

從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成0.5MCF濁度的菌懸液，1號(hào)菌和2號(hào)菌分別使用革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡，置于VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果分別顯示為沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

表3 1號(hào)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

綜合以上細(xì)菌菌落特征、菌體染色形態(tài)、生化試驗(yàn)、血清學(xué)和全自動(dòng)生化鑒定結(jié)果，可判斷該盲樣樣品中檢出2種菌，即鼠傷寒沙門氏菌（1,4,[5],12:i:1,2）和金黃色葡萄球菌。

4 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)室在收到樣品后，首先要對(duì)盲樣樣品狀態(tài)進(jìn)行確認(rèn)，如出現(xiàn)包裝破損或其他異常情況應(yīng)及時(shí)與實(shí)施部門聯(lián)系，這是做好質(zhì)控盲樣的前提[4]。準(zhǔn)備檢測前，應(yīng)仔細(xì)閱讀《作業(yè)指導(dǎo)書》，盡可能制定全面的檢測方案。在分析鑒定過程中，應(yīng)選擇多種分離增菌液和選擇性瓊脂平板，并在選擇性平板上盡可能挑取各種典型菌落[5]，以避免漏檢。為做好混合菌種質(zhì)控的鑒定分析工作，可采用常規(guī)生化試驗(yàn)與全自動(dòng)微生物生化鑒定儀相結(jié)合的方式[6]，進(jìn)而保證對(duì)菌種的結(jié)果判定更為準(zhǔn)確、快捷。

本次混合菌種鑒定項(xiàng)目取得了令人滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。盲樣考核是開展CMA/CNAS認(rèn)證評(píng)審的重要內(nèi)容，利用盲樣測試進(jìn)行現(xiàn)場評(píng)審能直接反映出實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和技術(shù)素質(zhì)的實(shí)際水平和出具報(bào)告的能力[7]，其不僅是衡量實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的關(guān)鍵指標(biāo)，還有利于檢測機(jī)構(gòu)重視檢驗(yàn)水平的提升，不斷提高專業(yè)技術(shù)人員的技能水平，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。