茶葉多糖的提取與結(jié)構(gòu)分析

汪雨 郭軍 陳壯

摘? 要：以本地綠茶為研究對(duì)象，采用苯酚-硫酸法測(cè)定茶葉多糖含量，通過(guò)研究不同因素條件下的提取率，確定最佳工藝為：超聲提取功率70W，提取時(shí)間1h，提取溫度60℃，料液比1∶30，提取次數(shù)3次;通過(guò)紫外光譜圖和紅外光譜圖，確定多糖中存在特征官能團(tuán)。

關(guān)鍵詞：茶多糖;超聲;提取

中圖分類(lèi)號(hào) TS272.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）12-0025-4

茶葉是世界上幾大重要飲料之一，我國(guó)茶資源豐富，是最早飲茶的國(guó)家，經(jīng)過(guò)幾千年的傳承和延續(xù)，飲茶在我國(guó)已經(jīng)成為一種文化[1]，飲茶與人體健康的響應(yīng)機(jī)制是眾多學(xué)者關(guān)注的對(duì)象[2，3]。茶葉多糖是茶葉中由大量單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的天然大分子活性物質(zhì)，具有多種保健效果，是茶葉中的關(guān)鍵性功能成分之一，具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力功能。茶葉多糖以降低血糖血壓和防治糖尿病成為研究的熱點(diǎn)[4，5]，較其它保健品具有吸收快、代謝徹底、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，基本無(wú)毒副作用[6]。本文通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定茶葉多糖的濃度，探究改變外在實(shí)驗(yàn)條件，研究茶葉多糖提取率，并對(duì)茶葉多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為優(yōu)化茶葉多糖的提取工藝和茶葉多糖的制備提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 茶葉購(gòu)于茶農(nóng)，把準(zhǔn)備好的干茶葉放入粉碎機(jī)中粉碎，將粉碎后過(guò)30目篩的茶葉粉末裝好備用;無(wú)水乙醇、正丁醇、濃硫酸、苯酚、三氯乙烷、異戊醇等分析純，上海國(guó)藥生產(chǎn)。

恒溫水浴鍋（HH-8）：金壇市杰瑞電器有限公司;小型超微粉碎機(jī)（WK-150A）：山東省青州市精誠(chéng)機(jī)械制造有限公司;真空干燥箱（OZF-0690）：上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司;電子天平（FA2104N）：上海箐海儀器有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ4）：湖南赫西儀器有限公司;可見(jiàn)分光光度計(jì)（722）：上海奧普勒儀器有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS-200）：美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 茶多糖測(cè)定方法 用苯酚-硫酸法[7]來(lái)測(cè)定茶葉多糖的濃度，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制成100mg/L的葡萄糖溶液。

茶葉多糖的提取率公式：提取率（%）=（C×稀釋倍數(shù)×V×10-6）/m×100

式中：C為分光光度計(jì)間接測(cè)定的茶葉多糖的濃度;單位：mg/L;V為提取液體積;位：mL;m為樣品質(zhì)量;單位：g。

1.2.2 不同超聲功率和時(shí)間下提取多糖

1.2.2.1 不同超聲波功率提取多糖 稱取待測(cè)10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，在溫度為60℃和超聲功率分別為0、50、60、70、80W條件下提取1h。提取液用4層紗布過(guò)濾后靜置3h，抽濾，濾液經(jīng)離心，然后測(cè)定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.2.2 不同超聲時(shí)間提取多糖 稱取待測(cè)10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，在溫度60℃和功率70W條件下提取，超聲提取時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5h，提取液用4層紗布過(guò)濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測(cè)定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.3 超聲條件下單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 溫度對(duì)提取率的影響 稱量10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，在功率70W條件下，放置于溫度不同的同一型號(hào)的超聲波清洗儀中，設(shè)定水溫分別為50、60、70、80、90℃，浸提1h，提取液用4層紗布過(guò)濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測(cè)定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.3.2 料液比對(duì)提取率的影響 稱量10.0g茶葉粉5份，分別加入100、200、300、400、500mL的蒸餾水，在功率70W條件下放置于60℃的超聲波清洗儀中，浸提1h，提取液用4層紗布過(guò)濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測(cè)定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.3.3 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響 稱量10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，放置于60℃超聲波清洗儀中，在功率70W條件下，分別提取1、2、3、4、5次，一次1h，提取液用4層紗布過(guò)濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測(cè)定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.4 茶葉多糖脫蛋白 把多糖溶于20mL的蒸餾水中，并用三氯甲烷和正丁醇（4∶1）配制4份各10mL的sevag試劑，分別加入到多糖溶液中。充分振蕩30min后放入到離心機(jī)上以3000r/min的速度離心1min。然后留下上清液，繼續(xù)加入相當(dāng)于多糖溶液1/3體積的sevag試劑，重復(fù)上述操作3次。向剩下的多糖溶液中加入2倍的無(wú)水乙醇，冷藏靜置2h，然后離心3min，用水洗滌沉淀后，加入丙酮脫水，真空冷凍干燥12h，得到除掉蛋白的多糖。

1.2.5 紅外與紫外實(shí)驗(yàn) 取少量除去蛋白的多糖，加蒸餾水溶解，在200～700nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外實(shí)驗(yàn)，保存所得光譜。取2mg精糖放入研缽中，并加入200mgKBr在研缽中充分研磨壓片，然后在4000～400cm-1處進(jìn)行紅外光譜實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 依據(jù)分光光度法在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度A490，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，得回歸方程為：A=0.0128C-0.0547，R=0.9987。

2.2 不同因素對(duì)多糖提取率的影響

2.2.1 不同超聲波功率對(duì)提取率的影響 由圖2可知，隨著超聲波功率的增加，茶葉多糖提取率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲波功率大于70W之后，提取率增加不明顯，沒(méi)有超聲情況下提取率最低。

2.2.2 不同超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響 由圖3可知，茶葉多糖提取率隨著超聲浸提時(shí)間的增加而逐漸升高，1h后，提取率增加緩慢，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)生產(chǎn)成本會(huì)增加，因此浸提時(shí)間應(yīng)選在1h適宜。超聲波可在液體中產(chǎn)生空穴作用，空穴作用產(chǎn)生的沖擊波和射流可破壞植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而增加細(xì)胞內(nèi)溶物通過(guò)[8，9]。經(jīng)過(guò)超聲浸提比不經(jīng)過(guò)超聲浸提得到的多糖要多，而且超聲提取的時(shí)間加長(zhǎng)會(huì)增加多糖的提取，因此可以推斷出超聲在一定程度上有利于茶葉多糖的提取。

2.2.3 超聲提取溫度與提取率的關(guān)系 由圖4可知，伴隨溫度的升高，多糖的提取率漸漸升高，這表明溫度愈高對(duì)茶葉細(xì)胞的破壞作用愈大，有益于多糖的浸出。但在90℃左右時(shí)，雖然提取率達(dá)到1.63%，但茶葉提取液的粘度變得過(guò)大，這也許是因?yàn)椋阂皇遣枞~細(xì)胞在高溫下會(huì)處于“崩潰”、溶解的狀況;二是茶葉多糖中含有的淀粉在90℃時(shí)會(huì)處于糊化的狀態(tài)，茶葉提取液就形成一種粘稠的糊狀，而這種高黏的液體對(duì)固液分離不利[10，11]。所以在茶葉多糖的工業(yè)化生產(chǎn)中，提取溫度不得超過(guò)90℃，在60℃時(shí)提取的多糖與在70℃時(shí)提取的多糖質(zhì)量相差不大，隨著提取溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)會(huì)變得更為劇烈，多糖提取率也會(huì)隨之增加。由于多糖是活性物質(zhì)，溫度過(guò)高易破壞其結(jié)構(gòu)，影響其生物活性，會(huì)對(duì)后面試驗(yàn)造成不利影響，所以初步推出60℃和70℃為最佳浸提溫度。

2.2.4 料液比對(duì)提取率的影響 由圖5可知，隨著料液比的增加，多糖的提取率也會(huì)漸漸增加，但當(dāng)料液比到達(dá)1∶30后，多糖的提取率的增加就變得遲緩。而體積的增加會(huì)延長(zhǎng)濃縮時(shí)間，生產(chǎn)成本增加，所以料液比選擇在1∶30較好。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響 由圖6可知提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響也較為突顯，當(dāng)提取次數(shù)從1到3次時(shí)，多糖提取率增加快速，從3到5次時(shí)，多糖提取率上升相當(dāng)遲緩。所以，從節(jié)約成本和提高效率方面考慮提取次數(shù)選擇3次適宜。

2.3 茶葉多糖的紅外表征 圖7是茶葉多糖在4000～400cm-1的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紅外光譜圖，對(duì)照以上結(jié)果可知3650～3150cm-1處的較寬吸收峰是O—H和N—H伸縮振動(dòng)峰，在2910cm-1周?chē)嬖诘姆鍨榧谆ā狢H3）和次甲基（—CH2）的C—H伸縮振動(dòng)的信號(hào)，1650cm-1處的峰是多糖水合吸收振動(dòng)吸收峰，是由糖環(huán)上的糖苷鍵和酰氨基上的C[]O伸縮振動(dòng)引起的，1360cm-1處的吸收峰是C—H鍵的變角振動(dòng)，1240cm-1處的峰是C—O—C非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[12]。887cm-1是吡喃糖苷的特征吸收峰，652cm-1出現(xiàn)吸收峰，表明茶多糖結(jié)構(gòu)中存在酰胺基。

2.4 茶葉多糖的紫外表征 由圖8～11用紫外掃描儀在200～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得到的結(jié)果可知：該紫外吸收光譜圖在200～280nm波長(zhǎng)處有吸收峰，說(shuō)明其中含有肽鍵，表明多糖內(nèi)含有蛋白質(zhì)和核酸[13]。在圖4中，溫度升高會(huì)增加多糖的產(chǎn)量，但是溫度過(guò)高會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)影響其活性，而且60℃和70℃下提取出的多糖相差很少，從節(jié)約能源的角度看，60℃為最佳浸提溫度。在圖7中可以看出，紅外光譜的在1650cm-1左右出現(xiàn)吸收峰，這是多糖中C[]O伸縮振動(dòng)引起的，但同時(shí)也是酰氨基上的C[]O伸縮振動(dòng)引起的，這說(shuō)明多糖中有蛋白質(zhì)的存在[14]。由圖8，圖9，圖10，圖11可以看出，207nm處為茶多糖的特征吸收峰，274nm處為蛋白質(zhì)吸收峰，無(wú)超聲情況下，50℃和60℃時(shí)蛋白質(zhì)的吸收峰較低，但是在70℃時(shí)蛋白質(zhì)的吸收峰較高，說(shuō)明溫度增加了蛋白質(zhì)的提取，在該溫度下超聲提取時(shí)，蛋白質(zhì)的吸收峰明顯降低，可能是超聲引起了蛋白質(zhì)的變性，從而引起蛋白質(zhì)溶解度降低，說(shuō)明超聲對(duì)蛋白質(zhì)提取有抑制作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)茶多糖提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)超聲提取功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，得出最佳提取功率是70W，提取時(shí)間為1h，提取溫度是60℃，料液比為1∶30，提取次數(shù)為3次。通過(guò)紅外光譜和紫外光譜實(shí)驗(yàn)確定多糖中存在特征官能團(tuán)，確定茶多糖是一種含有吡喃環(huán)和糖醛酸的蛋白多糖復(fù)合物[15]。

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（責(zé)編：王慧晴）