HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌組織中的表達(dá)

黎超蓮，鄒嘉雯，李榮威，羅伊萍，陽(yáng)玉中，梁 路，徐龍寬，周英瓊

上皮性卵巢癌的發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第二位，而死亡率一直高居?jì)D科惡性腫瘤榜首。上皮性卵巢癌的組織學(xué)類(lèi)型多見(jiàn)為漿液性癌、黏液性癌和內(nèi)膜樣癌等，缺乏特異性臨床癥狀和有效的早期診斷手段，大多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期。目前卵巢癌的主要治療方法以手術(shù)切除聯(lián)合順鉑化療為主，然而化療耐藥性嚴(yán)重影響了化療效果和生存質(zhì)量，卵巢癌患者的5年生存率仍低于50%[1]。有研究表明，約80%卵巢漿液性腫瘤患者的血清能檢測(cè)到糖類(lèi)抗原125(CA125)的提高，但其特異性不高，故臨床上不單獨(dú)用于卵巢癌的早期診斷[2]，臨床上將血清人附睪分泌蛋白4(HE4)、CA125、可溶性間皮素相關(guān)蛋白(SMRP)這三項(xiàng)標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)有助于卵巢癌的篩查及早期診斷[3-4]。因此，發(fā)現(xiàn)特異性的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床早期診斷及早期干預(yù)具有重要意義。

HOX基因是極其保守的多基因家族，其最先是在探索果蠅胚胎發(fā)育的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，且大部分存在于真核細(xì)胞中；HOX基因在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用，其蛋白表達(dá)異常，不但會(huì)導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育異常、組織器官形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，而且可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖形成腫瘤[5]。 HOXA5是同源異型盒(homologous box gene，HOX)基因家族的成員之一，HOXA5基因在許多腫瘤，尤其是乳腺癌[6]、結(jié)腸癌[7]、食管癌[8]中的異常表達(dá)均有所報(bào)道。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)與E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)是Wnt(wingless-type MMTV integration site family members)信號(hào)通路中的兩個(gè)重要成員，β-catenin作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，兼有胞間連接和信號(hào)傳導(dǎo)的功能；E-cadherin作為重要的細(xì)胞連接因子，參與維持細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞間的連接[9]。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2009年1月～2014年12月存檔的60例卵巢癌病理組織蠟塊作為實(shí)驗(yàn)組，另取同期卵巢良性腫瘤31例、正常輸卵管和卵巢組織31例為對(duì)照組。所有患者術(shù)前沒(méi)有經(jīng)過(guò)臨床的化學(xué)治療以及生物治療，且臨床及病理資料完整。60例卵巢癌患者年齡17～75(58±14.1)歲，其中<50歲27例，≥50歲33例，根據(jù)FIGO卵巢癌組織學(xué)分型：漿液性囊腺癌34例，黏液性囊腺癌6例，子宮內(nèi)膜樣癌10例，其他混合型上皮癌或未分化癌共10例；組織學(xué)分級(jí)：高分化30例，低分化30例。根據(jù)FIGO臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ 18例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及試劑本實(shí)驗(yàn)所納入的組織標(biāo)本均使用以下方法處理：① 10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋；② 4.0 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水后，EDTA(pH 8.0)高壓修復(fù)抗原，PBS沖洗；③ PBS沖洗3次，每次3 min，H2O2浸泡10 min；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，稀釋倍數(shù)1 ∶10)，置于37 ℃溫箱中封閉30 min；④ 滴加一抗，4 ℃過(guò)夜；PBS沖洗3次，每次3 min,滴加二抗，室溫放置15 min；⑤ PBS沖洗3次，每次3 min，DAB(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)顯色；⑥ 蘇木精復(fù)染；⑦ 中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌組織為陽(yáng)性對(duì)照。兔源性HOXA5多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，稀釋濃度為1 ∶200；兔源性β-catenin多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司，稀釋濃度為1 ∶200；鼠源性E-cadherin抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，稀釋濃度為1 ∶200；即用型免疫組化EliVisionTMsuper試劑盒(鼠/兔)和免疫組化一抗稀釋液均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)HOXA5蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。E-cadherin及β-catenin蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜，僅有細(xì)胞質(zhì)及胞核染色為異常情況。HOXA5以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，E-cadherin及β-catenin以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞。① 按陽(yáng)性著色程度評(píng)分：0分為無(wú)著色，與背景色一致；1分為稍淺黃色，比背景顏色略深；2分為棕黃色，明顯比背景色深；3分為棕褐色。② 按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：0分為陰性；1分為10%以下；2分為11%～50%；3分為51%～75%；4分為75%以上。每張切片以?xún)烧叱朔e判定陽(yáng)性結(jié)果：0～2分為陰性(-)；3～4分為弱陽(yáng)性(+)；5～8分為中度陽(yáng)性()；9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果()，將≥3分定為陽(yáng)性結(jié)果，<3分定為陰性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比或率表示，差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用χ2檢驗(yàn)對(duì)HOXA5、E-cadherin、β-catenin之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)病理切片HE染色鏡下觀正常輸卵管：輸卵管壁由漿膜、肌層與黏膜組成，輸卵管黏膜上皮為單層柱狀細(xì)胞，見(jiàn)圖1A。高級(jí)別漿液性囊腺癌：腫瘤上皮高度增生，雜亂生長(zhǎng)，相互搭連形成多種復(fù)雜的排列方式，可看到篩狀或裂隙樣結(jié)構(gòu)襯覆，見(jiàn)圖1B。低級(jí)別漿液性囊腺癌：乳頭纖細(xì)、分支復(fù)雜。形成大量新的排列紊亂的上皮性乳頭及小腺體。細(xì)胞密集、異型大，核分裂象多，間質(zhì)較少，見(jiàn)圖1C。高級(jí)別黏液性囊腺癌：腺樣結(jié)構(gòu)不明顯，呈簇狀或彌漫片狀，細(xì)胞核異型性明顯，核分裂象較多，見(jiàn)圖1D。低級(jí)別黏液性囊腺癌：腺體不規(guī)則，大小不一，排列緊密，共壁、篩狀，有浸潤(rùn)。上皮柱狀或低柱狀，結(jié)構(gòu)紊亂，形成共壁，間質(zhì)內(nèi)大量癌細(xì)胞巢浸潤(rùn)，核分裂象較多，見(jiàn)圖1E。

2.2 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在不同組織中的表達(dá)HOXA5蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin蛋白免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞膜著色為陽(yáng)性，β-catenin蛋白免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞膜著色為陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。

HOXA5、E-cadherin及β-catenin蛋白在卵巢癌組織的表達(dá)顯著低于正常輸卵管、卵巢組織(P=0.000，P=0.003，P=0.001)。HOXA5在卵巢良性腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于正常輸卵管、卵巢組織(P=0.002)，E-cadherin及β-catenin在卵巢良性腫瘤組織和正常輸卵管、卵巢組織間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.775，P=0.767)，見(jiàn)表1。

2.3 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)陽(yáng)性率與年齡(P>0.05)、組織學(xué)類(lèi)型(P>0.05)、臨床分期(P>0.05)、發(fā)生部位(P>0.05)無(wú)顯著關(guān)系，而與組織學(xué)分級(jí)(P=0.007，P=0.000，P=0.000)有關(guān)，組織分化越高，其表達(dá)率越高，見(jiàn)表2。

圖1 常規(guī)病理切片HE染色鏡下觀 ×400

圖2 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在不同組織中的表達(dá) ×400

A：正常輸卵管；B：高級(jí)別漿液性囊腺癌；C：低級(jí)別漿液性囊腺癌；D：高級(jí)別黏液性囊腺癌；E：低級(jí)別黏液性囊腺癌；1：HOXA5；2：E-cadherin;3:β-catenin

表1 HOXA5、E-cadherin和β-catenin在正常卵巢、輸卵管組織及卵巢良、惡性腫瘤組織中的表達(dá)[n(%)]

2.4 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)相關(guān)性分析χ2檢驗(yàn)提示在卵巢癌組織中，HOXA5的表達(dá)與E-cadherin(r=0.289,P=0.025)、β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.293,P=0.023 )，見(jiàn)表3。

3 討論

HOXA5基因正常表達(dá)可以維持上皮細(xì)胞的穩(wěn)定及組織的正常分化。該基因的異常表達(dá)參與到多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如白血病、乳腺癌等，參與大部分腫瘤的黏附、遷移、侵襲過(guò)程，是臨床中值得關(guān)注的基因靶點(diǎn)。此外，國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)[10]報(bào)道提示twist表達(dá)產(chǎn)物具有抗細(xì)胞凋亡的作用。在卵巢組織中，twist基因可抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)[11]，而HOXA5基因表達(dá)產(chǎn)物又可抑制twist基因的表達(dá)[12]，當(dāng)HOXA5表達(dá)下降，twist基因?qū)-cadherin蛋白的抑制作用增強(qiáng)，從而使E-cadherin蛋白表達(dá)下降，由此推測(cè)HOXA5基因很有可能通過(guò)調(diào)控twist基因的表達(dá)間接在Wnt信號(hào)通路中調(diào)控E-cadherin蛋白表達(dá)，進(jìn)而起到抑制卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的作用。且在林路 等[13]、于舒鴻 等[14]研究結(jié)果中有說(shuō)明E-cadherin、β-catenin共同參與上皮細(xì)胞黏附復(fù)合體的形成，當(dāng)E-cadherin或β-catenin表達(dá)下降或缺失，就會(huì)造成上皮細(xì)胞的黏附功能下降，從而導(dǎo)致腫瘤從原發(fā)部位脫落，向周邊組織侵襲和浸潤(rùn)。Ordonez-Moran et al[15]指出HOXA5可通過(guò)與Wnt信號(hào)通路相互作用來(lái)調(diào)控腸干細(xì)胞的穩(wěn)定及其分化過(guò)程，他們發(fā)現(xiàn)在腸隱窩中，Wnt信號(hào)通路通過(guò)抑制腸干細(xì)胞/祖細(xì)胞中的HOXA5來(lái)維持腸干細(xì)胞的穩(wěn)定性；而在腸隱窩之外，HOXA5反向抑制Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)腸干細(xì)胞進(jìn)行分化。

表2 HOXA5、E-cadherin及β-catenin在卵巢癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系[n]

A：HOXA5、E-cadherin、β-catenin在漿液性癌與黏液性癌組織中的表達(dá)差異；b：HOXA5、E-cadherin、β-catenin在漿液性癌與其他組織學(xué)類(lèi)型中的表達(dá)差異

表3 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)及其相關(guān)性分析(n)

以上現(xiàn)有的研究大致可以說(shuō)明HOXA5基因可以通過(guò)某些中介來(lái)影響E-cadherin、β-catenin蛋白在卵巢癌中的表達(dá)，本研究將HOXA5與β-catenin、E-cadherin作為一個(gè)整體進(jìn)行研究，探討它們?cè)谀c隱窩之外的卵巢癌組織中的表達(dá)，分析三者在卵巢癌組織中的表達(dá)相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，在卵巢癌組織中，HOXA5及E-cadherin、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯低于正常輸卵管、卵巢組織(P=0.000,P=0.003,P=0.001)，且在高級(jí)別卵巢癌和低級(jí)別卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)比中(級(jí)別越高，卵巢癌分化越低)，級(jí)別越高，HOXA5及E-cadherin、β-catenin蛋白表達(dá)越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007,P=0.000,P=0.000)，提示HOXA5、E-cadherin、β-catenin與卵巢癌的病理分化過(guò)程、發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，這三者在卵巢組織中的表達(dá)下降往往導(dǎo)致卵巢腫瘤的形成及分化、惡化程度趨向于一個(gè)不良的預(yù)后。HOXA5與E-cadherin、β-catenin蛋白在卵巢癌中的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.289,P=0.025；r=0.293,P=0.023)，提示可以通過(guò)上調(diào)HOXA5、β-catenin、E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，用于預(yù)防腫瘤的形成，抑制癌組織進(jìn)一步惡化，或通過(guò)阻斷HOXA5與β-catenin、E-cadherin相互作用的通路，從而抑制卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，或通過(guò)檢測(cè)HOXA5、β-catenin、E-cadherin的表達(dá)水平達(dá)到卵巢癌早期篩查的作用；這為卵巢癌的臨床診斷和治療提供了可供參考的理論基礎(chǔ)，HOXA5基因有可能作為卵巢癌基因靶向藥物治療的靶點(diǎn)，為卵巢癌基因靶向治療藥物開(kāi)發(fā)提供參考的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新性主要在于把HOXA5、β-catenin、E-cadherin三者共同置于卵巢癌中研究且證明了它們之間的表達(dá)具有正相關(guān)性。至于HOXA5基因在卵巢癌中促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。